מאמר שיטה

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

DOI:

10.3791/51005

⸱

30 בינואר 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד של מיקרוגליה מרקמת מערכת העצבים המרכזית הוא כלי חקירה רב עוצמה המשמש ללימודי ביולוגיה microglial vivo לשעבר. השיטה הנוכחית פרטי הליך לבידודה של מיקרוגליה מקליפת המוח העכברי ילוד על ידי תסיסה מכאנית עם שייקר סיבובי. בידוד מיקרוגליה זה תשואות שיטת מיקרוגליה בקליפת המוח טהורים מאוד כי תערוכת מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים מעידים על מיקרוגליה שקטים בתנאים רגילים, nonpathological in vivo. הליך זה גם משמר את immunophenotype microglial והפונקציונליות ביוכימיים כפי שהודגם על ידי האינדוקציה של שינויים מורפולוגיים, טרנסלוקציה הגרעינית של למקטע p65 של NF-κB (p65), והפרשה של ציטוקינים מעודדי דלקת סימן היכר, גורם-α נמק גידול (TNF-α ), על lipopolysaccharide (LPS) ופאם 3 4 צסק"א (פאם) אתגרים. לכן, הליך הבידוד הנוכחי משמר את immunophenotype של שניהם שקטים וactiמיקרוגליה vated, מתן שיטה ניסיונית של חקירת ביולוגיה מיקרוגליה בתנאי vivo לשעבר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי microglial, מקרופאגים המעקב של parenchyma מערכת העצבים המרכזית, מהווים כ 12% מאוכלוסיית התאים הכוללת של המוח של היונקים הבוגרים. מיקרוגליה נגזרים מצק חלמון מיאלואידית מבשר תאים ולהשתנות בצפיפות תאים ומורפולוגיה באזורי cytoarchitectural שונים בתוך מערכת העצבים המרכזית הבוגר 1-5. במוח בוגר בריא, מיקרוגליה הם תאים קטנים, מסועפים או קוטב עם תהליכים עדינים ודינמיים. בניגוד למורפולוגיה מקרופאג היקפי, מיקרוגליה להפגין פנוטיפ במוחות בריאים שעלולות להופיע כחוסר פעילות הסלולר שקט, בפרופיל נמוך, עם זאת, במחקרי הדמיה vivo מראים כי תהליכי microglial דינמי להאריך ולחזור בו כדי לפקח microenvironment שלהם באופן המזכיר את " דגימה ומדידות "6,7.

מיקרוגליה הם מאוד ואופן דיפרנציאלי מגיבים לשינויים סביבתיים וpathophysiological במוח, מיתוגממשגיח למדינות מדינות בדרך כלל נחשבים למנוחה שלהם והופעלו מפעיל, בהתאמה. מתג בהפעלה זו יכול להיות מתווך על ידי מעורבות של קולטני קרום הנכנס זיהוי תבניות (PRRs), כגון קולטנים כמו חיוג (TLRs), אשר מגיבים הלקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן (PAMPs), ליפופרוטאינים כלומר חיידקים ונגיפיים נגזרים , חומצות גרעין, ופחמימות 8-11. בנוסף לPAMPs, PRRs יש גם הוכח כדי לגרום להפעלת microglial נגד מולקולות סטרילי, nonpathogenic המכונים דפוסי סכנה / הקשורים לנזק מולקולרי (damps), המייצגות את הפרעות במערכת העצבים המרכזית הומאוסטזיס, כגון נזק לתאים 12-16. עוסק ברגע, PRRs ליזום תאית מפל איתות כי תוצאות שינויים בביטוי מורפולוגיה של תאים וגני microglial, במיוחד, מיקרוגליה הופעלו להתאים פנוטיפ כמו אמבואידית, translocate מקטע p65 NF-κB (p65) לגרעין התא, וupregulate production והפרשה של ציטוקינים מעודדי דלקת, כגון גורם-α גידול הנמק (TNF-α), β interleukin-1 (IL-1β), יחד עם מיני חמצן תגובתי (ROS) 16-24. אמנם נפרד בתגובה החיסונית המולדת של מערכת העצבים המרכזית, מולקולות המופרשות על אלה יש גם נמצאים להגדיל סטרס חמצונים עצביים, ובכך ישכנעו והחרפת ניוון מוחיים במדינות חולות כמו פרקינסון ואלצהיימר 25-29.

עם זאת, המנגנונים של הפעלת microglial במצבים פתולוגיים שאינם מובן לחלוטין. לכן, בידוד של מיקרוגליה הוא כלי רב עוצמה לחקירת תהליכים ביולוגיים אלה, כפי שרבים בתכונות vivo של הפעלת microglial יכולים להיות סכמו בתרבות. מספר שיטות זמינות לבידוד מיקרוגליה, כולל בידוד באמצעות שיפוע Percoll הבא עיכול אנזימטי של רקמת מערכת העצבים המרכזית 30,31. עם זאת, עיכול אנזימטי יכול לשנותimmunophenotype של התאים על ידי הפחתה על פני קרום תא ביטוי אנטיגן 32, ותוצאות בתשואה נמוכה יותר לכל תא בבעלי חיים מאשר בשיטה שתוארה במסמך זה. באופן ספציפי, אנו מדווחים תשואת מיקרוגליה ממוצעת לקליפת גור של 7.5 x 10 5 תאים, בעוד שדווחו בעבר שיטות בידוד מכל מערכת העצבים המרכזית באמצעות תשואת שיפוע Percoll 3-5 x 10 5 תאים 30,33,34. ההליך הנוכחי עוקף את השימוש באנזימי עיכול על ידי בידוד מיקרוגליה המבוססים על המאפיינים נמוך דבקותם, ובכך לשמר את immunophenotype ופונקציונליות microglial.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים את הבידוד של תאי microglial מתרבויות גליה מעורבות נגזרו מCX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) הטרוזיגוטיים בילוד, וC57BL / 6 הקורטקס עכברי באמצעות תסיסה מכאנית על שייקר סיבובי, הרחבה של העבר 24,35 שיטה שפורסם. אנו משתמשים בזן העכבר לשעבר להדמיה קלה של מיקרוגליה, כפיעכברים אלה מבטאים GFP תחת שליטתו של מוקד CX3CR1 אנדוגני - אמרגן מונוציטים הספציפיים 36-38. שיטה זו מייצרת תרבויות microglial טהורות מאוד עם השתמרו immunophenotype לשעבר, / 2 אגוניסטים TLR4 וTLR1 vivo כפי שהודגם על ידי שינויים מורפולוגיים, טרנסלוקציה הגרעינית של p65, והפרשה של TNF-α כאשר תיגר עם lipopolysaccharide חיידקים (LPS) או פאם 3 צסק"א 4 , בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפני תחילת פרוטוקול זה, לאסוף עכברים בילוד בימים שלאחר הלידה 1-3 (P1-3) במכל סטרילי מקונן עם מצעי כלוב מקוריים להגנה וחמימות. חשוב לעבוד במהירות וביעילות באמצעות פרוטוקול זה כדי לייעל את תשואת microglial. אנא ראה טבלה 1 לרשימה מגיב מלאה.

1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, וצלחות

  1. הכן 10 מיליליטר / גור מדיה שלמה Microglia (MCM; 1x מינימאלי חיוני [ממ] של בינוני ארל בתוספת: 1 L-גלוטמין מ"מ, פירובט נתרן 1 מ"מ,) גלוקוז D-(+ 0.6% v / v, 100 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), 4% v / v בסרום שור העוברי (FBS), 6% V / V סוסים סרום), ולהוסיף לכל בקבוק T-75 (בקבוק 1 / גור); כובע ומקום אופקי לתוך חממה (37 מעלות צלזיוס, CO 2 של 5%) לאזן במשך שעה 1. זה חיוני כדי לאזן את המדיה הזו בבקבוק (ים) לפני תחילת הניתוח.
  2. תכשיריםמחדש, aliquot, וחם ב37 MCM אמבט המים C ° לנתיחה (6 מיליליטר / גור) ובMCM צינור חרוטי נפרד לתא resuspension (2 מיליליטר / גור). היכונו, aliquot, ומקרר על קרח ממינסינג מדיה (MM; HBSS בתוספת: 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S, M 0.01 HEPES; 3 מיליליטר / גור), וביתור מדיה (DM; MEM השלים עם 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S; 2 מיליליטר / גור).
  3. לעקר את הכלים כירורגיים הבאים על ידי טבילה באתנול 70% עבור 10 דקות: מספריים # 1 (1; לערוף), מלקחי # 1 (2; כדי לאבטח את האף ולהסיר קליפת מוח), מספריים # 2 (1; קרקפת כדי לפתוח; nonangled ), מלקחיים # 2 (1; להסיר קרקפת), מלקחי 3 # (1; להסיר גולגולת), מלקחיים # 4 (2; להסרת קרומי המוח), מספריים # 3 (1; לבררתי ברקמת מוח). לאפשר לאוויר יבש על משטח סטרילי.
  4. נגב את המיקרוסקופ תחנת עבודה ונתיחה האופקי-זרימת אוויר עם 70% אתנול.
  5. לוותר DM לתוך 2 100 מ"מ מנות סטרילי, פטרי ללכידת ראש (3 מיליליטר; מנה 1/3 גורים) ודיסקציה (1 מיליליטר;המנה 1 / גור; מקורר בקרח לפני דיסקציה). לוותר MM לתוך צלחת 1 סטרילי, 100 מ"מ פטרי למיותר ברקמת מוח (1 מיליליטר; מנה 1 / גור).

2. Dissection רקמת המוח

  1. לפני המתת חסד, בעדינות לטהר צוואר וראש של גור עם אתנול 70% באמצעות רקמות במעבדה. עם מספריים # 1, להרדים במהירות גור על ידי הסרת הראש; ראש ללכוד בצלחת פטרי שהוכנה קודם לכן. להרדים ולהשלים את הנתיחה של גור אחד לפני שתמשיך לחיה הבאה.
  2. להעביר את הראש לצלחת לנתיחה מקוררת; תחת מיקרוסקופ לנתיחה לאבטח את הראש על ידי צובט את האף באמצעות מלקחי # 1 (לחלופין, הראש יכול להיות מאובטח על ידי פירסינג המלקחיים דרך שקע העין); קרקפת פתוחה באמצעות מספריים מס '2 על ידי יצירת לחתוך-Y: תתחיל מבסיס של ראש ובזווית לכיוון העיניים. השתמש במלקחיים 3 # להסיר בעדינות את הקרקפת על ידי קילוף רוחבי, חושף את הגולגולת.
  3. באמצעות מלקחיים # 3, בעדינות להסיר רקמת חיבור בבסיסראש. כאשר בסיס גולגולת חשוף גולגולת, בזהירות פתוחה על ידי השחלה זרוע אחת של מלקחיים שבבין המוח והגולגולת (בעקבות סדק המיספרי); אחיזה; משוך בעדינות את הגולגולת כלפי מעלה לקרוע פתוח.
  4. לשבש את רקמת חיבור בצד הגחוני של המוח באמצעות מלקחי # 1, ולאחר מכן להסיר את המוח תוך שימוש באותו הכלי. הרם את המוח מתוך גולגולת באמצעות כוח כלפי מעלה מתחת לצד הגחוני של המוח.
  5. שמור על המוח במצב האנטומי שלה: צד גב כלפי מעלה כדי להמחיש את קליפת המוח מתחת למיקרוסקופ לנתיחה; לאבטח את המוח במקום על ידי הוספת טיפים של מלקחיים בצומת של המוח התיכון וקליפת המוח; להסיר לחלוטין את קרומי המוח בקליפת המוח עם מלקחיים # 4, לאחר מכן להמשיך להסיר את קרומי המוח הגחון. ברגע שהקרומים המוח הוסרו לחלוטין, להפריד את קליפת המוח משאר המוח באמצעות מלקחיים # 4. זה חיוני כדי להסיר לחלוטין את רקמת קרום מוח למקסם את טוהר מיקרוגליה וyielד.

3. רקמת מוח ממינסינג

  1. העברת הקורטקס להכין בעבר מיותר מנה; תמשיך מיותר צעד באמצעות טכניקה סטרילית בClass II בטיחות הביולוגית קבינט.
  2. רקמת בשר טחון מוח באמצעות מספריים # 3; רקמה טחונות העברת צינור חרוטי 15 מיליליטר;. לשטוף מספריים ומנה מיותרות עם 1 מיליליטר של MM כל אחד, לאסוף ולוותר על שטיפות לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל רקמה הטחון צעד שטיפה זה יהיה למקסם התשואה של מיקרוגליה על ידי הבטחה כי כל הרקמה שיורית מועברת לצינור חרוטי. השאר השעיה רקמות ללא הפרעה במשך 1-2 דקות, המאפשר רקמה טחונות להתיישב בחלק תחתון של צינור. האם לא יעלה על 2 דקות כMM אינו מכיל חומרים מזינים חיוניים.
  3. מוציא בזהירות וזורקים 2 מיליליטר של supernatant עם micropipettor 1,000 μl גנרית עם קצה פיפטה סטנדרטי, מה שהופך מסוימים לא לשבש התיישבו טחונות רקמות.
  4. הוסף 3 מיליליטר של MCM לטחון רקמות; triturate הרקמה בכל כוח באמצעות micropipettor 1,000 μl גנרית עם קצה פיפטה סטנדרטי לא ניתן להבחין רקמה מוצקה צריכה להישאר כאשר טחינה דקה הושלמה.. להוסיף עוד 3 מיליליטר של MCM עם אותו קצה פיפטה, איסוף דגימת triturated שיורי מקצה פיפטה.

4. תאים בקליפת מוח גידול

  1. צנטריפוגה הרקמה הטחון עד גלולה תאים (XG 215; 5 דקות, RT; צנטריפוגות הקלינית עם הרוטור דלי מתנדנד). חזרו תאי pelleted לארון הבטיחות ביולוגית, להסיר ולבטל את supernatant; עדינות resuspend התא גלולה (2 מיליליטר / צינור; MCM); להוסיף resuspension התא לבקבוק שהוכן בעבר T-75; מכסה את הבקבוק ומניח אותו בצורה אופקית לתוך חממת humidified, סטנדרטית תרבית רקמה (37 ° C CO, 2 5%). אפשר התאים כדי לדגור על 24 שעות.
  2. לאחר 24 שעות, לטפוח בעדינות בקבוק נגד כף היד לשבשפסולת רקמות. בדקו תאים לפני ואחרי ההקשה על מנת להבטיח הסרה מלאה של פסולת. בקבוק סט אנכי; להסיר ולסלק תקשורת; להוסיף MCM הטרי לתחתית של הבקבוק (12 מיליליטר; 37 מעלות צלזיוס); כובע ומניח בחזרה לתוך החממה, בצורה אופקית.
  3. בדקו תאים מדי יום לזיהום וכדי לפקח על צמיחה.
  4. כ 17-21 בימים במבחנה (DIV), תאי microglial יהיו מוכנים לקציר מתרבות גליה המעורבת. כדי לקבוע אם תאים מוכנים, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. Microglia מוכן לקציר, כאשר ב ~ confluency 40%. הם מופיעים כתאים קטנים, בהירים, כדוריים, גדל כmonolayer על גבי גליה אחרת.

5. בידוד של Microglia ממעורב גלייה תרבות

  1. כדי לבודד מיקרוגליה, במרץ ברז בקבוק נגד ספסל מעבדה. תסיסה זו מסייעת מיקרוגליה נפרדים מתאי גליה אחרים בשל המאפיינים נמוך דבקות של מיקרוגליה.
  2. חותם T-75 כובעי בקבוק עם Parafilm ולסובב את תרבויות גליה המעורבות (200 סל"ד; 37 מעלות צלזיוס; 5 שעות). שימוש, שייקר סיבובי nonhumidified טמפרטורה מבוקרת אל תאפשר לתאים כדי ללחוץ למשך זמן ארוך יותר מ -5 שעות ראייה לבדוק. מיקרוגליה שהרימו את משטח הבקבוק אחרי 5 שעות, תוך שימוש במיקרוסקופ שלב בניגוד הפוך. Microglia בהיר, כדורי, תאים חופשיים צף. יהיה שכבת שיורי של האסטרוציטים וoligodendrocytes הקפדה על החלק התחתון של הבקבוק.
  3. לאסוף תקשורת supernatant המכילה מיקרוגליה לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי חרוטי; מיקרוגליה גלולה (215 XG; 5 דקות, מתנדנד הרוטור דלי).
  4. Resuspend את כדור microglial בmicroglial החם צמיחה בינונית (MGM; ממ בתוספת: פירובט נתרן 1 מ"מ, 0.6% v / vglucose, L-גלוטמין 1 מ"מ, 100 P מיקרוגרם / מיליליטר / S, 5% V / V FBS; ~ 2 מיליליטר / בקבוק), לקבוע את ריכוז התאים באמצעות hemocytometer, וצלחת 1 x 10 5 תאים / גם בפורמט צלחת 24 גם עלפלסטיק או תלושי סטרילי כיסוי זכוכית (500 μl / טוב; MGM). שימוש בהליך זה תשואת מיקרוגליה הממוצעת היא קליפת 7.5 x 10 5 תאים / גור.
  5. 24 שעות לאחר ציפוי, להסיר את כל אמצעי התקשורת ובתאי refeed עם MGM הטרי (37 ° C) להסרת תאים ופסולת צפים. שלב זה הוא קריטי להישרדות תא ולשמור על מיקרוגליה שקטים. תאים עשויים להיות מנוצלים לניסויים מייד לאחר refeeding.

6. טיפולים לדוגמא

  1. לחשוף תאים ל10 ננוגרם / מיליליטר של פאם 3 צסק"א 4 (פאם), 10 ng / ml lipopolysaccharide (LPS) או שליטה ברכב; דגירה עבור 2 או 24 שעות בחממת humidified (37 ° C CO, 2 5%).

7. ניתוח Microglia לפונקציונלי Ex vivo באמצעות Immunofluorescent הדמיה וImmunocytochemistry

  1. לאחר טיפול, תקשורת ותרבות תא קציר בצינורות microfuge (1.5 מיליליטר) וcentrifuge באמצעות microcentrifuge שולחן (2 דקות; 900 XG) כדי לנקות את התקשורת. מעביר את supernatant לצינור microfuge נקי; assay באופן מיידי, או בחנות ב-20 ° C עד מוכן לשימוש. לנתח ריכוז TNF-α בsupernatant תרבית תאים באמצעות ערכת עכבר זמינה מסחרי α-TNF ELISA.
  2. שטוף תאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), ולתקן את התאים עם 4% (w / v) paraformaldehyde / 4% (w / v) pH סוכרוז / PBS 7.4 (PFA 4%; 15 דקות, RT). בעקבות קיבוע, לשטוף את התאים עם PBS במשך 5 דקות עם רעד עדין על שייקר מסלולית.
    1. Immunofluorescence / Immunocytochemistry. לאחר הקיבוע וPBS לשטוף, מיקרוגליה תהליך לimmunocytochemistry. כל הצעדים שבוצעו עם רעד עדין. Permeabilize תאים בPBS/0.1% טריטון X-100; תאי בלוק בPBS/10% נסיוב עזים נורמלים למשך שעה אחת. דגירה תאי O / N ב 4 ° C עם נוגדן ארנב נגד NF-κB (מקטע p65; 1/1, 250) או נוגדן ארנב נגד איבא-1 (1/750) בחסימת מאגר. חזותיize אנטיגן: נוגדן מורכב הבא דגירה עם עז מצומדות fluorescently נוגדנים נגד ארנב IgG משניים (1 שעות, 1/1, 000). הסר את שני נוגדנים מאוגדים על ידי שטיפה עם PBS/0.1% X-100 טריטון (3x 5 דקות).
    2. תאי כתם דלפק עם 4 ',6-diamidino-2-phenylindole / PBS (DAPI; 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר). כדי להמחיש את גרעין התא כל מיקרוגליה נגזרים מ+ / CX3CR1-GFP - העכברים להביע את ה-GFP. לנצל מסנן גל 350 ננומטר לדמיין DAPI; מסנן 488 ננומטר אורך גל לדמיין GFP, ומסנן גל 594 ננומטר לדמיין p65 וייבא-1 immunocomplexes.
  3. כיסוי ההר מחליק באמצעות פתרון הרכבה מימית ולדמיין מיקרוגליה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שמירה על immunophenotype ופונקציונליות של מיקרוגליה vivo לשעבר בבידוד היא קריטית כדי להיות מסוגל לנצל את התאים האלה כמודל חקירה לביולוגיה microglial. על מנת להדגים את השימור המוצלח של immunofunctionality מיקרוגליה תוך שימוש בשיטה הנוכחית, אנו מבודדים מיקרוגליה בקליפת המוח מילודי P3 (CX3CR1-GFP + / - וC57BL / 6) ותרבויות שטופלו או LPS או פאם.

כפי שמודגם באיור 1 א ', בידוד של מי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליך הנוכחי מציע שיטה יעילה לבידודה של מיקרוגליה בקליפת המוח של עכברים בילוד. הליך זה יש יתרון כפול של 1) immunophenotype מיקרוגליה לשמר ופונקציונליות, כפי שנקבע על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, וELISA; ו, 2) המאפשר למיקרוגליה להבשיל בנוכחות של תאים אחרים גליה (האסטרוציטים וoligodentrocytes) לפני בידוד, אשר עשוי להקל על תאי תאי אינטראקציות חשובות בתקופת התבגרות תרבות גליה. חשוב מכך, תאים מבודדים הציגו כדאיות גבוהה ואחידות עם פונקציונליות השתמרה וimmunophenotype vivo ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי המחקר נערך בהעדר כל יחסים מסחריים או כספיים שיכול להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIEHS R01ES014470 (KMZ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
גלוקוזסיגמאG8270הכינו תמיסת מלאי של 20% עם מי MilliQ; עיקור מסנן; אחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C; חיי מדף: 3-6 חודשים. משמש לייצור MCM ו-MGM.
נתרן פירובט 100 מ"מ (100x)HycloneSH30239.01יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
פניצילין/סטרפטומיצין 10,000 יחידות/מ"ל (100x)Gibco15140-122חנות ב-20 מעלות צלזיוס.
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)Gibco25030-081חנות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס משמש לייצור MCM ו-MGM.
סרום בקר עוברי (מוגדר)HycloneSH30070.03מסנן סטריליזציה; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס משמש לייצור MCM ו-MGM.
Minimum Essential Medium Earle's (MEM)Cellgro15-010-CVללא L-גלוטמין. מכיל מלחי ארל. משמש לייצור MCM, MGM ו-DM.
סרום סוסיםGibco16050מסנן סטריליזציה; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. משמש לייצור MCM ו-MGM.
תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS)Cellgro21-021-CVללא סידן ומגנזיום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. משמש להכנת מ"מ.
HEPES 1 MGibco15630-031חנות ב -4 מעלות צלזיוס משמש לייצור MM.
T-75בקבוק קורנינג430641
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דילקטט (DAPI)InvitrogenD3571משמש לצביעה של גרעין התא.
ארנב נגד Iba1Wako019-19741משמש בדילול 1/750 לצביעה ICC של Iba1. 
ארנב נגד NFκ B (עמ' 65)Abcam7970משמש בדילול של 1/1,250 לצביעה ICC עבור עמ' 65.
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA11012משמש בדילול של 1/1,000 להדמיה של קומפלקס אנטיגן: נוגדנים ב-ICC.
10 מ"ל פיפט סרולוגי חד פעמיפישר סיינטיפיק13-678-11E
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חד פעמיפישר סיינטיפיק05-539-8
15 מ"ל צינור צנטריפוגה חד פעמיפישר סיינטיפיק05-539-12
צלחת פטרי פוליסטירן סטריליפישר סיינטיפיק875713100 מ"מ x 15 מ"מ
מספריים: ישר מצמבאום (מספריים #1)Roboz כירורגיRS-60101; 5 אינץ'; משמש להסרת
מספריים לראש: Vannas
(מספריים #2)		Fine Science Tools15000-081; לא זוויתי; קצה חיתוך 2.5 מ"מ; משמש לפתיחת קרקפת
מספריים: סטודנט ואנאס (מספריים #3)Fine Science Tools91501-091; מעוקל; משמש לטחינת רקמת מוח
מלקחיים: Dumont #7
(מלקחיים #1)		Fine Science Tools91197-002; משמש לאבטחת האף ולהסרת קליפת המוח 
מלקחיים: Dumont #2
(מלקחיים #2)		Fine ScienceTools 11223-201; משמש להסרת קרקפת
מלקחיים: Dumont #3
(מלקחיים #3)		Fine Science Tools11231-301; משמש להסרת גולגולת
מלקחיים: Dumont #5a
(מלקחיים #4)		Fine Science Tools11253-211; משמש להסרת קרומי המוח
<חזק>שולחן של ציוד ספציפי
מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו זום אולימפוסSZ4060ממוקם בתוך ארון זרימה למינרית-אופקית
ארון זרימה למינארי-אופקיNuaireNU-201-330
ארון בטיחות ביולוגיLabconco3440001Class II
מעטפת מים CO2 חממהVWR97025-836מוגדר ל-37 מעלות; C, 5% CO2
Swing-out דלייםFisher Scientific75006441לשימוש עם רוטור מתנדנד החוצה
רוטור מתנדנדFisher Scientific75006445רדיוס מקסימלי: 19.2 (ס"מ)
Sorvall Legend RT+ צנטריפוגה
(צנטריפוגה קלינית)		Fisher Scientific75-004-377עם רוטור מתנדנד
AccuSpin Micro 17 מיקרוצנטריפוגה
( מיקרוצנטריפוגה שולחנית)		פישר סיינטיפיקS98645עם רוטור מיקרוליטר (24 x 1.5/2.0 מ"ל; חתול #: 75003524)   
מיקרוסקופ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
  3. Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
  4. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
  5. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
  6. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  8. Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
  9. Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
  10. Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
  11. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
  12. Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
  13. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  14. Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
  15. Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
  16. Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
  17. Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
  18. Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
  19. Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
  20. Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
  21. Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
  22. Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
  23. Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
  24. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
  25. Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
  26. Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
  27. Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
  28. Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
  29. Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
  30. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  31. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
  32. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
  33. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
  34. Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
  35. Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
  36. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  37. Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
  38. Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
  39. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
  40. Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cortical Microglia IsolationMicroglia ImmunophenotypeMurine NeonatesMechanical AgitationMixed Glial CulturesImmunofluorescence MicroscopyELISAMeningeal Tissue RemovalRotary ShakerCell Culture Plates

מאמרים קשורים