בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

סיכום

וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.

תקציר

תאי האנדותל המוח עובריים יכולים לשמש ככלי חשוב במחקר של אנגיוגנזה ופיתוח neurovascular ואינטראקציות. שתי רשתות כלי הדם של המוח הקדמי העוברי, pial וperiventricular, הן במרחב ייחודיים ויש להם מקורות שונים ודפוסי צמיחה. יש תאי אנדותל מרשתות כלי דם pial וperiventricular פרופילים ייחודיים ביטוי גנים ופונקציות. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לבידוד, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מרשת periventricular כלי הדם (PVECs) של המוח הקדמי העוברי (telencephalon). בגישה זו, telencephalon נטולת קרום pial מתקבל מיום עוברי 15 עכברים טחונים, מעוכל עם collagenase / dispase, והתפזרה באופן מכאני לתוך השעיה תא בודדת. PVECs הם מטוהרים מהשעית תא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן anti-CD-31/PECAM-1 מצומדת לmicrobeads באמצעות חזק מגנטישיטת הפרדה. תאים מטוהרים בתרבית על קולגן 1 מנות תרבות מצופים במדיום תרבית תאי האנדותל עד שהם הופכים ומחוברות וsubcultured נוסף. PVECs שהושג עם מרוצף זה פרוטוקול תערוכה ופנוטיפים ציר בצורה, כפי שדמיין ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טוהר של תרבויות PVEC הוקם עם סמני תא האנדותל. בידיים שלנו, שיטה זו אמינה ועקבי תשואות אוכלוסיות טהורות של PVECs. פרוטוקול זה יהיה לטובת מחקרים שמטרתם להשיג תובנות מכניסטית לאנגיוגנזה המוח הקדמי, הבנת אינטראקציות PVEC, ושיחות צולבות עם סוגים עצביים תא ובעל פוטנציאל אדיר לאנגיוגנזה הטיפולית.

מבוא

אנגיוגנזה, נוירוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים קריטיים במערכת עצבים מרכזית (CNS) פיתוח, תיקון והתחדשות. מספר מחקרים אלגנטיים הראו כי תאי האנדותל לעורר התפשטות עצבית ולהיפך באמצעות שחרורם של גורמים מסיסים ועל ידי מגע ישיר. מצאנו את זה מוזר, כי ברוב המחקרים הללו ^1-3, ואילו אבות עצביים / תאי גזע עצביים מבודדים מהמוח העוברי, הם cocultured עם תאי אנדותל מהמוח הבוגר, מקורות רקמות מבוגרים אחרים, או עם שורות תאי האנדותל. זה עשוי בחלקו להיות בשל הקשיים הטכניים הקשורים לבידוד וculturing אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מהמוח העוברי. עם זאת, אנגיוגנזה, נוירוגנזה, ונדידת נוירונים הן אירועים מקבילים המתרחשים בסדרי גודל חזק יותר ב....

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

1. ציפוי של צלחת תרבות 35 מ"מ: פתרון סוג קולגן 1 מסופק כתמיסה מימית ב20 מ"מ חומצה אצטית (~ 100 חלבון מ"ג / בקבוקון). לדלל נפח מתאים של תמיסת קולגן לריכוז עבודה של 0.01% משימוש במים בכיתה רקמת סטרילית תרבות. מנות מעילים עם 1 מיליליטר של תמיסת קולגן ל3-4 שעות בטמפרטורת חדר (RT) או 37 מעלות צלזיוס, או הלילה ב 2-8 ° C. הסר פתרון עודף מהצלחת המצופה ולאפשר לו להתייבש במשך הלילה. יש לשטוף את הצלחת עם מים כיתה תרבית רקמה או PBS לפני הוספת מדיה. ניתן לאחסן כלים מצופים על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.

תוצאות

האפיון פנוטיפי של PVECs מהיום 1-12 מוצג על ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד (איור 2). התאים מחוברים לצלחת על מאפיין מורפולוגיה מופע יום 1 של חלוקת תא (איור 2 א). בין 5-8 ימים, מעבר PVECs מאבן חלוק לציר מורפולוגיה בצורה אופיינית לתאי האנדותל ודומים יותר למצבו בvivo (2B דמויות ו2C). ביום 12 תרבות PVEC משיגה מפגש מלא (איור 2 ד). ניתן subcultured PVECs קלות להרחיב את המושבה (איורים 2E-G). הטוהר ש.......

דיון

PVEC של יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר תאי בוגרים מוח אנדותל וECs ממקורות רקמות אחרים ללימודים המתמקדים באינטראקציות עצבים וכלי דם וגם יש פוטנציאל טיפולי. להכנת PVEC, זה קריטי עם תחילת נתיחה כדי לעבוד מהר כדי להשיג את כדאיות טובה שכן תאים מתים עלולים להיקשר nonspecifically לmicrobeads CD31. בנוסף, אם ההשעיה תא בודד לא תושג לפני צעד התיוג המגנטי, זה יביא לפתרון בעיות שכן גושי תא יהיה לסתום את העמודה. יתרון של שיטה זו הוא שאין צורך בדגירה עם טריפסין לנתק את התאים מחרוזים מגנטיי.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DNase I	Sigma	D-4527
קולגן, תמיסה מסוג 1 מזנב חולדה	סיגמא	C3867
איכות DPBS	ביולוגית	114057-131
EDTA	פישר סיינטיפיק	M4055
BSA	סיגמא	A2058
טור MS	Miltenyi Biotech	130-042-201
מיקרו-חרוזים CD31	Miltenyi Biotech	130-097-418
מפריד MACS	Miltenyi Biotech	130-042-102
מעמד רב MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
מסננת תאים 70 ומיקרו; מ	BD ביוסיינס	352350
תמיסת אנטיביוטיקה ואנטי-פטריית	סיגמא	A5955
FBS	סיגמא	F4135
קולגנאז/דיספאז	רוש	10269638001
DMEM	לונזה	12-604F
צלחת תרבית 35 מ"מ	BD Bioscience	353001
15 מ"ל שפופרת פלקון	BD Bioscience	352097
50 מ"ל שפופרת בז	BD Bioscience	352098
ערכת ECCM	BD Bioscience	355054	כוללת תוסף צמיחת תאי אנדותל, EGF ומעכב טריפסין
פולי סויה תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS)	BD Bioscience	354006
יישומי תא	RBECGM	R819-500
DMEM F12	לייף טכנולוג'יז	10565-018
GlutaMAX	Life Technologies	305050-061
מים בדרגת תרבית רקמה	Life Technologies	15230162
0.25% טריפסין	טכנולוגיות חיים	15050
מעכב טריפסין פולי סויה	BD Bioscience	5425
Matrigel	BD Bioscience	354234
Qtracker 655 ערכת תיוג תאים	Life Technologies	Q25021
קרום פלזמה CellLight-RFP, BacMam 2.0	Life Technologies	C10608
נוגדן ביוטינילציה לאיזולקטין B4	Sigma	L2140
גורם אנטי-פון ווילברנד	סיגמא	F3520
אנטי-CD31/PECAM-1	BD פארמינגן	550274
מדיית הרכבה קשיח VECTASHIELD עם DAPI	Vector Laboratories	H-1500
קטמין	באטלר שיין אספקת בריאות בעלי חיים	44028
מעבדות קסילזין	לויד	1009
סטריאומיקרוסקופ	מוטי	SMZ-168
המוציטומטר	פישר סיינטיפיק	267110
מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס CK-40	CK-40
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	Olympus FSX-100	FSX-100
מלקחיים עדינים	מכשיר כירורגי Roboz	7 inox
מספריים מיקרוטיפ עדינים	Roboz מכשיר כירורגי	RS5611

ערכת