הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

15.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51021

⸱

23 בינואר 2014

 , 
1Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 2Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

במאמר זה

סיכום

וידאו זה מדגים אסטרטגיה קלה ואמינה להכנת תרבויות טהורות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי העוברי בתוך 10-12 ימים ויהיה שימושי עבור מחקר התמקד בהיבטים רבים של אנגיוגנזה מוחין.

תקציר

תאי האנדותל המוח עובריים יכולים לשמש ככלי חשוב במחקר של אנגיוגנזה ופיתוח neurovascular ואינטראקציות. שתי רשתות כלי הדם של המוח הקדמי העוברי, pial וperiventricular, הן במרחב ייחודיים ויש להם מקורות שונים ודפוסי צמיחה. יש תאי אנדותל מרשתות כלי דם pial וperiventricular פרופילים ייחודיים ביטוי גנים ופונקציות. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד לבידוד, תרבות, ואימות של אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מרשת periventricular כלי הדם (PVECs) של המוח הקדמי העוברי (telencephalon). בגישה זו, telencephalon נטולת קרום pial מתקבל מיום עוברי 15 עכברים טחונים, מעוכל עם collagenase / dispase, והתפזרה באופן מכאני לתוך השעיה תא בודדת. PVECs הם מטוהרים מהשעית תא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן anti-CD-31/PECAM-1 מצומדת לmicrobeads באמצעות חזק מגנטישיטת הפרדה. תאים מטוהרים בתרבית על קולגן 1 מנות תרבות מצופים במדיום תרבית תאי האנדותל עד שהם הופכים ומחוברות וsubcultured נוסף. PVECs שהושג עם מרוצף זה פרוטוקול תערוכה ופנוטיפים ציר בצורה, כפי שדמיין ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. טוהר של תרבויות PVEC הוקם עם סמני תא האנדותל. בידיים שלנו, שיטה זו אמינה ועקבי תשואות אוכלוסיות טהורות של PVECs. פרוטוקול זה יהיה לטובת מחקרים שמטרתם להשיג תובנות מכניסטית לאנגיוגנזה המוח הקדמי, הבנת אינטראקציות PVEC, ושיחות צולבות עם סוגים עצביים תא ובעל פוטנציאל אדיר לאנגיוגנזה הטיפולית.

מבוא

אנגיוגנזה, נוירוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים קריטיים במערכת עצבים מרכזית (CNS) פיתוח, תיקון והתחדשות. מספר מחקרים אלגנטיים הראו כי תאי האנדותל לעורר התפשטות עצבית ולהיפך באמצעות שחרורם של גורמים מסיסים ועל ידי מגע ישיר. מצאנו את זה מוזר, כי ברוב המחקרים הללו 1-3, ואילו אבות עצביים / תאי גזע עצביים מבודדים מהמוח העוברי, הם cocultured עם תאי אנדותל מהמוח הבוגר, מקורות רקמות מבוגרים אחרים, או עם שורות תאי האנדותל. זה עשוי בחלקו להיות בשל הקשיים הטכניים הקשורים לבידוד וculturing אוכלוסיות טהורות של תאי האנדותל מהמוח העוברי. עם זאת, אנגיוגנזה, נוירוגנזה, ונדידת נוירונים הן אירועים מקבילים המתרחשים בסדרי גודל חזק יותר במוח העוברי מאשר במוח המבוגר הנורמלי. רשת כלי דם periventricular של embryoniמוח קדמי ג (telencephalon) מקורו בכלי הממוקם בתוך primordium הגרעינים הבזליים ומתפתח בצורת הדרגתית מסודר מגחון להגבה telencephalon ידי היום עוברי 11 (E11) 4,5. מקלעת זו של כלי שיט של רשת כלי דם periventricular נבדלת כלי pial מבוסס על מקורות, מיקום האנטומי, דפוסי צמיחה, ורגולציה התפתחותית 4,5. הכיוון של התפשטות של שיפוע אנגיוגנזה periventricular תואם את שיפוע neurogenetic הרוחבי telencephalic. בתוך telencephalon, שיפוע אנגיוגנזה periventricular והשיפוע של נוירונים GABA הנודדים בעקיפין חופף מרחבית, כמו גם 6. עם כל כבוד לעיתוי, שיפוע אנגיוגנזה הוא מראש של שיפוע השיפוע ונוירון GABA neurogenetic ידי על יום. לכן, תאי האנדותל periventricular הם מרחב ובזמן בעמדה טובה כדי לספק רמזים קריטיים לתמוך נוירוגנזה telencephalic ו4,6 נדידת נוירונים. לכן, שימוש בתאי אנדותל periventricular עובריים בניסויי coculture עם אבות ו / או נוירונים עצביים יספק מודל חיובי יותר ללימוד אינטראקציות עצבים וכלי דם ובפיתוח אפיקים חדשים לטיפול במחלות ניווניות או פגיעה המוחית איסכמי / טראומטית.

אנו מדגישים את החשיבות של הסרת קרום pial, לא רק כדי להגביל את זיהום תאי אפיתל, אלא גם כדי להפריד בין תאי האנדותל pial אשר מולקולריים ומובחנים מבחינה פונקציונלית מתאי האנדותל של הרשת periventricular כלי דם 4,6 (PVECs מכונה להבדיל מECs pial) . כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו משתמשים באופן שיגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג תשואה עשירה וטהורה של PVECs. תאי האנדותל אלה הוכנו מforebrains העוברי בודד מעכבר מתוזמן בהריון אחד. הם יכולים להיות מורחבים, subcultured, וקפוא למטה בהצלחה לשימוש עתידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

  1. ציפוי של צלחת תרבות 35 מ"מ: פתרון סוג קולגן 1 מסופק כתמיסה מימית ב20 מ"מ חומצה אצטית (~ 100 חלבון מ"ג / בקבוקון). לדלל נפח מתאים של תמיסת קולגן לריכוז עבודה של 0.01% משימוש במים בכיתה רקמת סטרילית תרבות. מנות מעילים עם 1 מיליליטר של תמיסת קולגן ל3-4 שעות בטמפרטורת חדר (RT) או 37 מעלות צלזיוס, או הלילה ב 2-8 ° C. הסר פתרון עודף מהצלחת המצופה ולאפשר לו להתייבש במשך הלילה. יש לשטוף את הצלחת עם מים כיתה תרבית רקמה או PBS לפני הוספת מדיה. ניתן לאחסן כלים מצופים על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.
  2. הכן הנשר בינוני של Dulbecco המלא השתנה (DMEM). מוסף DMEM (500 מיליליטר) עם FBS 10% ופתרון האנטיביוטיקה antimycotic (ריכוז 1x; 1 ml/100 מיליליטר). ניתן לאחסן DMEM המלא על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
  3. הכן aliquot (50 מיליליטר) של DMEM עם DNase אני (0.001 מ"ג / מיליליטר), (המכונה DMEM-DNase אני).
  4. הכן aliquot אחר (10 מיליליטר) של DMEM עם collagenase וdispase (1 מ"ג / מיליליטר) (המכונה DMEM-collagenase/dispase).
  5. הכן תא האנדותל תרבות בינונית (ECCM 500 מיליליטר), בתוספת EGF (5 מיקרוגרם), ECGs (100 מ"ג) ו -5 μl של פתרון האנטיביוטיקה antimycotic. ניתן לאחסן ECCM על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
  6. Prewarm כל אמצעי התקשורת לפני השימוש.
  7. הכן את חיץ טיהור: PBS, pH 7.2 עם BSA 0.5% ו2 מ"מ EDTA. שמור על חיץ קר (2-8 ° C).

2. ההסרה של עוברים וDissection של telencephalon

כל הניסויים באמצעות חיות מעבדה מאושרים על ידי ועדות טיפול בבעלי חיים ושימוש בבית החולים מקלין ותואמים את הנחיות NIH לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה.

  1. השתמש בעכברים בעיתוי הריון CD1 (יום עוברי 15). היום של גילוי תוסף נרתיק נחשב יום עוברי 0 (E0). סכרי CD1 בדרך כלל מייצרים המלטות גדולות, ולכן 10-12 עוברים צפוי מסכר בהריון.
  2. לhysterotomy, להרדים עכברים בהריון עם זריקת intraperitoneal של קטמין / Xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) (100 מ"ג / קילוגרם). לעכברים כ 20-30 גרם, לספק 0.3 מיליליטר של חומר הרדמה 10 מיליליטר / קילוגרם קטמין / Xylazine ולהבטיח שכאב והמצוקה היא מינימאלית במהלך זריקות intraperitoneal של חומר ההרדמה. השתמש ביד איפוק לזריקות.
  3. בדוק הרדמה עמוקה על ידי קמצוץ הבוהן. הסר את העוברים מעכברים בהרדמה עמוקה. לערוף כל עובר מייד עם ההסרה מהאם. מניחים את הראשים העובריים בצלחות פטרי סטרילית בקרח הקר PBS.
  4. עקוב כריתת רחם על ידי המתת חסד מיידית עם מנת יתר של חומר הרדמה (130 מ"ג / pentobarbital קילוגרם, ה-IP), שיטה להמתת חסד, אשר עולה בקנה אחד עם הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים: 2013 Edition.
  5. תחת מיקרוסקופ סטריאו, להסיר את המוח מהראש במספריים microtip בסדר ומלקחיים בסדר. הערה: לנתח באיכות גבוההיון הוא חיוני כדי להסיר בהצלחה את קרום pial מהמוח העוברי. זו מושגת על ידי תרגול. מלקחיים בסדר ומספריים microtip גם כלים מרכזיים להשגת נתיחה טובה.
  6. השתמש במלקחיים כדי לקבל אחיזה איתנה על המוח ומספרי microtip לקלף את קרום pial. הסר את mesencephalon וmetencephalon ולבודד את telencephalon. העבר telencephalon pial נטול מכל העוברים למנת תרבות 35 מ"מ עם 2 מיליליטר PBS בקרח.

3. בידוד תא

  1. ברר בtelencephalon ל1-2 ברי מ"מ עם להב סכין מנתחים ולאסוף רקמה בצינור פלקון 15 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של DMEM המלא.
  2. לנתק את הרקמה בעדינות אך ביסודיות עם טפטפת מיליליטר 1 עד גושים נעלמים והשעיה חלבית מושגת.
  3. צנטריפוגה תאים ניתקה ב800-1,000 XG במשך 5 דקות ב RT.
  4. להסיר את supernatant וגלול resuspend ב DMEM-DNase I. בזהירות בעדינות לנתק את ceLLS שוב באמצעות פיפטה 1 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 800-1,000 במשך 5 דקות ב RT.
  5. Resuspend את הכדור בDMEM המלא החם. תאי סינון דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר סטרילי. איסוף תאים מסוננים ולשמור על קרח.
  6. לאסוף את תא החלקים נשמרו ברשת ולעכל נוסף עם DMEM-collagenase/dispase (2 מיליליטר) ל1-2 דקות ב RT. לשטוף 3x תאי DMEM-DNase אני באמצעות צנטריפוגה ב800-1,000 XG במשך 5 דקות ב RT. בריכת תאים אלה עם התאים המסוננים שנאספו בשלב 3.5. שטוף תאים בסך הכל פעם אחת עם DMEM מלא. המשך כדי לקבוע מספר תא וצעדי תיוג מגנטיים. הערה: חשוב לקבל השעיה תא בודד לפני תיוג מגנטי.

4. תיוג מגנטי

  1. פרוטוקול זה מראה את התיוג המגנטי של 10 7 תאים. למספרים סלולריים נמוך מ10 7, להשתמש באותו נפח ומגיבים למספרים סלולריים גדול מ10 7, בהיקף של עד כל הכרכים מגיב וכרכים בסך הכלבהתאם (למשל עבור 2 x 10 7 תאים בסך הכל, השתמש פעמיים בנפח של כל ריאגנטים מצויינים). שמור את כל חומרים כימיים ותאים בקרח.
  2. לקבוע את מספר סלולרי עם hemocytometer.
  3. צנטריפוגה השעיה תא XG 300 10 דקות ב RT. לשאוב supernatant לחלוטין.
  4. הוספת 90 μl/10 7 תאים של חיץ טיהור לתא גלולה ואחרי 10 μl של microbeads CD31. Microbeads המסופק על ידי יצרן הם מצומדת לmonoclonal נוגדן CD31 אנטי עכבר.
  5. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות במקרר. הערה: בטמפרטורות גבוהות ו / או זמן דגירה ארוך יותר בתיוג מגנטי עלולות לגרום ספציפי מחייב.
  6. שטוף תאים על ידי הוספת 1-2 ml/10 7 תאים של חיץ טיהור ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות. הסרת תאי supernatant ו resuspend ב 500 μl של חיץ טיהור. המשך להפרדה מגנטית או צעד טיהור.

5. פוrification

  1. מקום עמודת MS בשדה המגנטי של MACS מפריד.
  2. יש לשטוף את העמודה עם 500 μl של חיץ טיהור.
  3. החל השעיה תא על הטור. טען מספר המתאים של תאים לעמודת MS כמספר תאים גבוהים יותר עשוי לסתום את העמודה. זהירות: כל עמודת MS יכול להכיל מספר מרבי של 2 x 10 7 תאים, למספר תא גבוה יותר, להשתמש יותר עמודות.
  4. איסוף וזורקים זרימת דרך המכילה תאים ללא תווית.
  5. לשטוף טור עם 500 μl של חיץ טיהור שלוש פעמים. במהלך שלבים לשטוף, לוודא כי מאגר העמודה ריק לפני הוספת aliquots חיץ טיהור שלאחר מכן.
  6. הסר את העמודה ממפריד MACS ולמקם אותו על צינור פלקון 15 מיליליטר.
  7. בוכנה מסופקת יחד עם עמודת הטרשת הנפוצה. פיפטה 1 מיליליטר של חיץ טיהור על טור MS ומייד לשטוף את התאים שכותרתו מגנטית על ידי תקיפות דוחפים את הבוכנה לתוך הטור.
  8. cel פלייטls על צלחת תרבות 35 מ"מ precoated עם סוג קולגן 1 ולגדל תאים בECCM בחממה מוגדרת 37 ° C עם 95% O 2 ו 5% CO 2.
  9. לשנות את המדיום כל ארבעה ימים. השתמש PVECs לניסויים או תת לאחר 10-12 ימים כאשר המנה היא מחוברת.

6. תת של PV ECS

  1. הסר את ECCM ולשטוף monolayer של PVECS עם 1-2 מיליליטר של PBS סטרילית.
  2. בעדינות להוסיף 1.5 מיליליטר של 0.25% פתרון טריפסין-EDTA כדי לכסות את monolayer התא.
  3. להחזיר את הצלחת אל האינקובטור. בתוך 5-7 דקות, תאים להתנתק מהמשטח של המנה.
  4. אחרי התאים יש מנותקים, מייד להוסיף נפח שווה של מעכבי טריפסין וtriturate מספר פעמים.
  5. להעביר את תאי צינור פלקון 15 מיליליטר סטרילי. צנטריפוגות הצינור ב XG 500 למשך 5 דקות.
  6. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר של ECCM prewarmed.
  7. זרעי התאים להרחבת התרבות, imהזדקנות או מבחני אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

האפיון פנוטיפי של PVECs מהיום 1-12 מוצג על ידי מיקרוסקופ אור שלב בניגוד (איור 2). התאים מחוברים לצלחת על מאפיין מורפולוגיה מופע יום 1 של חלוקת תא (איור 2 א). בין 5-8 ימים, מעבר PVECs מאבן חלוק לציר מורפולוגיה בצורה אופיינית לתאי האנדותל ודומים יותר למצבו בvivo (2B דמויות ו2C). ביום 12 תרבות PVEC משיגה מפגש מלא (איור 2 ד). ניתן subcultured PVECs קלות להרחיב את המושבה (איורים 2E-G). הטוהר ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

PVEC של יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר תאי בוגרים מוח אנדותל וECs ממקורות רקמות אחרים ללימודים המתמקדים באינטראקציות עצבים וכלי דם וגם יש פוטנציאל טיפולי. להכנת PVEC, זה קריטי עם תחילת נתיחה כדי לעבוד מהר כדי להשיג את כדאיות טובה שכן תאים מתים עלולים להיקשר nonspecifically לmicrobeads CD31. בנוסף, אם ההשעיה תא בודד לא תושג לפני צעד התיוג המגנטי, זה יביא לפתרון בעיות שכן גושי תא יהיה לסתום את העמודה. יתרון של שיטה זו הוא שאין צורך בדגירה עם טריפסין לנתק את התאים מחרוזים מגנטיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי ברית לאומית לחקר סכיזופרניה ודיכאון (NARSAD) פרס חוקר צעיר ומכונים הלאומיים לבריאות מענק R01NS073635 לAV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DNase ISigmaD-4527 
קולגן, תמיסה מסוג 1 מזנב חולדה סיגמאC3867 
איכות DPBSביולוגית114057-131 
EDTAפישר סיינטיפיקM4055 
BSAסיגמאA2058 
טור MSMiltenyi Biotech130-042-201 
מיקרו-חרוזים CD31Miltenyi Biotech130-097-418 
מפריד MACSMiltenyi Biotech130-042-102 
מעמד רב MACSMiltenyi Biotech130-042-303 
מסננת תאים 70 ומיקרו; מBD ביוסיינס352350 
תמיסת אנטיביוטיקה ואנטי-פטרייתסיגמאA5955 
FBSסיגמאF4135 
קולגנאז/דיספאזרוש10269638001 
DMEM לונזה12-604F 
צלחת תרבית 35 מ"מBD Bioscience353001 
15 מ"ל שפופרת פלקון BD Bioscience352097 
50 מ"ל שפופרת בזBD Bioscience352098 
ערכת ECCMBD Bioscience355054כוללת תוסף צמיחת תאי אנדותל, EGF ומעכב טריפסין
פולי סויה תוסף צמיחת תאי אנדותל (ECGS)BD Bioscience354006 
יישומי תאRBECGMR819-500 
DMEM F12 לייף טכנולוג'יז10565-018 
GlutaMAXLife Technologies305050-061 
מים בדרגת תרבית רקמהLife Technologies15230162 
0.25% טריפסיןטכנולוגיות חיים15050 
מעכב טריפסין פולי סויהBD Bioscience5425 
MatrigelBD Bioscience354234 
Qtracker 655 ערכת תיוג תאיםLife TechnologiesQ25021 
קרום פלזמה CellLight-RFP, BacMam 2.0Life TechnologiesC10608 
נוגדן ביוטינילציה לאיזולקטין B4SigmaL2140 
גורם אנטי-פון ווילברנדסיגמאF3520 
אנטי-CD31/PECAM-1BD פארמינגן550274 
מדיית הרכבה קשיח VECTASHIELD עם DAPIVector LaboratoriesH-1500 
קטמיןבאטלר שיין אספקת בריאות בעלי חיים44028 
מעבדות קסילזיןלויד1009 
סטריאומיקרוסקופמוטיSMZ-168 
המוציטומטרפישר סיינטיפיק267110 
מיקרוסקופ הפוךאולימפוס CK-40CK-40 
מיקרוסקופ פלואורסצנטיOlympus FSX-100FSX-100 
מלקחיים עדיניםמכשיר כירורגי Roboz7 inox 
מספריים מיקרוטיפ עדיניםRoboz מכשיר כירורגיRS5611 
ערכת

מקורות

  1. Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
  2. Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
  3. Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
  4. Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
  5. Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
  6. Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
  7. Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
  8. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
  9. Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
  10. Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  11. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD31
בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.