הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פלואורסצנציה

23.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51030

⸱

24 בפברואר 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Volcani Center, 2Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Hebrew University of Jerusalem, 3Department of Applied Sciences, Institute for Adriatic Crops and Karst Reclamation, 4The Institute of Plant Sciences, Volcani Center

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים כאן הקרינה פשוטה בשיטת הכלאה באתר (FISH) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים ברקמות חרקים וצמחים. פרוטוקול זה יכול להתארך להדמיה של ה-mRNA בהר שלם וחתכים מיקרוסקופיים.

תקציר

הקרינה הכלאה באתרו (FISH) היא שם שניתן למגוון רחב של טכניקות המשמשות בדרך כלל להמחשת תעתיקי גנים בתאי אוקריוטים ויכול להיות שונה יותר לדמיין רכיבים אחרים בתא, כגון הידבקות בוירוסים וחיידקים. לוקליזציה ויזואליזציה של וירוסים וחיידקים, במהלך תהליך ההדבקה המרחבי היא צעד חיוני שמשלים ניסויי פרופיל ביטוי כגון microarrays וRNAseq בתגובה לגירויים שונים. הבנת זיהומי spatiotemporal עם סוכנים אלה משלים ניסויים ביולוגיים להבנת האינטראקציה שלהם עם מרכיבים תאיים. כמה טכניקות להדמית וירוסים וחיידקים כגון מערכות גן כתב או שיטות immunohistochemical הן זמן רב, וחלקם מוגבלים לעבודה עם אורגניזמים מודל וכרוכים במתודולוגיות מורכבות. FISH, כי מטרות מיני RNA או DNA בתא הוא לי קל ומהיר יחסיתthod ללימוד לוקליזציה spatiotemporal של גנים ולמטרות אבחון. שיטה זו יכולה להיות חזקה וקלה יחסית ליישום, כאשר הפרוטוקולים להעסיק הכלאה קצרה, חלליות מסחריות שנרכשו, שאינן יקרים. זה חזק במיוחד כאשר הכנת מדגם, קיבעון, הכלאה, ולהדמיה מיקרוסקופית אינן כרוך בפעולות מורכבות. כאן אנו מתארים פרוטוקול ללוקליזציה של חיידקים ונגיפים ברקמות חרקים וצמחים. השיטה מבוססת על הכנה פשוטה, קיבעון, והכלאה של mounts כל חרקים ואיברים מבותרים או חלקי צמח בעבודת יד, עם 20 זוגות בסיסי בדיקות דנ"א קצרים מצומדת לצבעי ניאון על 5 'או 3' שלהם מסתיימת. פרוטוקול זה יושם בהצלחה במספר רקמות חרקים וצמחים, והוא יכול לשמש כדי לנתח את הביטוי של mRNAs או מיני RNA או DNA אחרים בתא.

מבוא

כאשר לומדים את יחסי הגומלין בין וירוסי צמח ופתוגנים אחרים עם המארחים הצמח הנגועים שלהם, זה חשוב כדי להמחיש את גורמי המחלה וחומצות הגרעין שלהם באתר, ללא קשר אם הם גורמים להשפעות שליליות על מארחיהם. זה חשוב ביותר כאשר לומד תנועת הפתוגן בתוך ובין תאי צמח. בלוקליזציה באתרו של תוצרי גנים של הפתוגן הוא צעד חיוני שמשלים את גישות אחרות ללימוד תהליך פתוגניות. פתוגנים צמח רבים, בעיקר וירוסים, המועברים על ידי חרקים, שיש יחסי גומלין מורכבים ואינטימיים עם הווקטורים שלהם. לוקליזציה של וירוסים אלו בווקטורים שלהם היא חשובה ללימוד בדרך לשידור, ואתרי אינטראקציה האפשריים בתוך הווקטור. העברת של וירוסים מסוימים צמחים וקטורי חרקים נעזרת בחיידקי endosymbiotic הנמצאים בתוך חרקים אלה. כדי לחקור את העברת וירוסי צמח ב האלה טובים יותרy הווקטורים שלהם, הוא גם חיוני כדי להמחיש את חיידקי endosymbiotic באופן כללי, ואלה שהיו מעורבים בהעברת נגיף, בפרט. Colocalization של חיידקי הווירוסים וendosymbiotic וכך רצוי לחוקר את הקשרים האפשריים בין אורגניזמים אלה בתוך מארח החרק שלהם. מלבד העברת נגיף, חיידקי endosymbiotic להשפיע על מספר היבטים של הביולוגיה של וקטורי חרקים, לוקליזציה וכך המרחבי של חיידקים אלה בחרקים היא של ריבית גבוהה וחשיבות.

וירוס סלסול עלים צהובים עגבניות (ירליות) (Begomovirus, Geminiviridae) הוא מורכב החשובה ביותר נגיפית המחלה של עגבניות מעובדות בעולם 1-4. ירליות היא וירוס מוגבל השיפה והווקטורים באופן בלעדי על ידי Bemisia tabaci כנימות 5,6. מודל המתאר את טרנסלוקציה של begomoviruses בוקטורי כנימותיהם הוצע 6-9. שני מחסומים ספציפיים הם חצו באופן פעיל during שידור circulative זה: midgut / hemolymph ומחסומי בלוטת hemolymph / רוק. תהליך העברת זה השערה הוא שמתווך על ידי קולטנים ידועים אשר מזהים את הקופסית הווירוס. הוא חשב ירליות לחצות ב ' midgut tabaci 6,10, והוא נספג דרך בלוטת הרוק העיקרית 6 לפני שהוא מוזרק לתוך הצמח. בhemolymph הכנימות, ירליות אינטראקציה עם חלבון GroEL מיוצר על ידי חיידק endosymbiotic המשני החרקים Hamiltonella. אינטראקציה זו מבטיחה הובלה בטוחה של ירליות בhemolymph, ומגנה עליו מפני התקפה של המערכת החיסונית החרקים 11. Hamiltonella וPortiera, endosymbiont העיקרי של כנימות עש, הם שוכנו בbacteriocytes, חרק תאים הנמצאים בחיידקי hemolymph וendosymbiotic בית 11. B. tabaci נמלי חיידקי endosymbiotic נוספים כולל Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, ופריטשEA, אשר יכול להיות מקומי בתוך או מחוץ לbacteriocytes, ויש להם השפעות מגוונות על הביולוגיה של החרקים 12.

מספר דיווחים, ניסו ללמוד את הלוקליזציה של ירליות בצמחים וכנימות עש באמצעות פרוטוקולים זמן רב ויקרים, כגון הילוכים מיקרוסקופית אלקטרונים (TEM), נוגדנים ו-RNA באתרם על סעיף בעובי מיקרוסקופי 10,13, מחקר שנערך לאחרונה תאר את הלוקליזציה של וירוסי צמח בתוך המארחים הצמח ווקטור שלהם על ידי שימוש בפרוטוקול פשוט 14. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט ללוקליזציה של ירליות בB. tabaci גזור midguts ובלוטות רוק, ובסעיפים שהוכן מצמחים נגועים ב-ירליות. בנוסף, אנו מתארים את הלוקליזציה של Portiera, endosymbiont העיקרי של B. tabaci, וendosymbionts המשני שלה Hamitonella, Rickettsia וArsenophonus. פרוטוקול זה מבוסס על שימוש בבדיקות דנ"א קצרים, כישכותרתו fluorescently ב -5 בסופו של הדבר 'שלהם, ובאופן ספציפי להכליא רצפים משלימים ברצפי גנים נגיפיים או חיידקים. עיבוד הדגימה הוא קל יחסית ואת האות המתקבלת היא מאוד ספציפית. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי למקם וירוסים, חיידקים ומזיקים אחרים במארחי צמחים, בעלי החיים וחרקיהם, והוא יכול עוד לשמש בתרגום ה-mRNA בכל רקמה נתון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנות כלליות כנימות, צמח, ווירוס לניתוח FISH

  1. כנימות עש האחורי B ו-Q biotype על שתילי גפן (Gossypium hirsutum ל קורות חיים. Acala) ולשמור בתוך כלובי חרקים הוכחה וחדרי צמיחה בתנאים סטנדרטיים של 25 ± 2 מעלות צלזיוס, 60% לחות יחסית, ואור 14-HR / photoperiod הכהה 10-HR.
  2. לבצע PCR לבדיקת זיהום עם endosymbionts באמצעות פריימרים endosymbiont ספציפי כמו 15-19 שתואר קודם לכן.
  3. לרכוש שתילי עגבניות (Solanum esculentum קורות חיים. אומצה) ממשתלה מסחרית או זרעי עגבניות צמח.
  4. לשמור באותם תנאי הגידול שתוארו לעיל, עד הצמחים מגיעים לשלב אמיתי עלה ארבעה, הגיל המתאים ביותר עבור חיסון בתיווך כנימות של 15 ירליות (ראה סעיף 4.1 בהמשך).

2. טיפול בחרקים, קיבוע, Probe עיצוב, הכלאה, ויזואליזציה לאנדוFISH סימביונט

  1. לאסוף 10 כנימות עש בוגר על ידי שאיפה מצמחי כותנה, או לבחור 10 -3 או 4 נימפות instar ה מעלי גפן.
  2. מייד לטבול במקבע של Carnoy (חומצת כלורופורם אתנול-אצטית קרחונית, 06:03:01, כרך / כרך) בתוך צינורות Eppendorf. תקן עבור 2 שעות ללילה (רצוי למשך לילה).
  3. להסיר לחלוטין את מקבע והדהות ב6% H 2 O 2 באתנול במשך שעה 2.
  4. לשמר את הדגימות באתנול מוחלט במשך כמה ימים עד מספר שבועות בטמפרטורת חדר, או להמשיך לשלב הבא.
  5. בדיקות עיצוב פריימרים DNA הפוך משלימים המבוססים על גנים RNA ריבוזומלי 16s של כל חיידק. לעיצוב הבדיקות, לקחת בחשבון אותם השיקולים לעיצוב primers PCR. השתמש בבדיקות oligonucleotide BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', RB1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', BTH 5'-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 "וars2 5'-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 "למיקוד ספציפי של Portiera, Rickettsia, Hamilonella, וArsenophonus, בהתאמה.
  6. בדיקה ניאון להכליא דגימות לילה בחושך במאגר הכלאה (20 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0, 0.9 M NaCl, 0.01% [wt / כרך] נתרן גופרתי dodecyl, [כרך / כרך] פוראמיד 30%) המכיל 10 pmol לכל מיליליטר . שלב את הבדיקה יותר מפעם אחת עם צבעי ניאון שונים במידת צורך. השתמש whiteflies noninfected עם החיידק הממוקד ודגימות ללא בדיקה בקרות שליליות.
  7. הר את הדגימות כולה, בשקופית מיקרוסקופ, בחיץ ההכלאה הכיל עם חוסם נוזלי, מכסים בפיסת כיסוי, חותמים עם לק, ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal.

3. כנימות האיברים Dissection, קיבוע, הכלאה, ויזואליזציה לדגי ירליות

  1. לאסוף כנימות עש בוגרים שגדלו ברציפות על צמחי עגבנייה נגועות ב-ירליות על ידי שאיפה וanesthetize על ידי חשיפה למגבת נייר ספוגה באצטון. לחשוף whiteflies רק 1-2 דקות כמו חשיפה ארוכה מדי לאצטון יכולה לתקן רקמות כנימות עש. השתמש whiteflies nonviruliferous גדל על שיחי עגבניות noninfected ולא דגימות בדיקה עבור פקדים כדי לאשר הכלאה ספציפית.
  2. כנימות עש ההר במיקרוסקופ הדיכאון מחליק לנתיחה איברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
  3. משכו ממנו את הראש החרק מprothorax ולנתח בלוטות רוק ב1x PBS בתוספת כתם כחול toluidine 1% להדמיה טובה יותר, בשל גודלם הקטן. לאפשר ספיגת הכתם במשך 2-3 דקות.
  4. משוך את החרקים לגזרים בצומת שבין בית החזה והבטן להתבונן ולגרש את midgut. לגרש את התוכן של הבטן על ידי דחיפה עם מלקחיים בקצה הבטן.
  5. בעדינות להסיר את PBS וtoluidine כחול ומניתוחים מוצלחים ובעדינות להוסיף 300 μl של המקבע של Carnoy לתקן האיברים למשך 5 דקות.
  6. dd מקבע מצד אחד של גם בדיכאון ולא מהחלק העליון כדי למנוע תנועה בלתי מבוקרת של האיברים גזורים. ברגע שנוגע במקבע, האיברים ידבק הזכוכית, וכל התהליך שהם לא יזוזו.
  7. הסר מקבע ולהוסיף 500 μl של חיץ הכלאה בתוספת 10 pmol של חללית ניאון DNA Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ", אשר משלים רצף בגן חלבון מעיל ירליות.
  8. להכליא לילה בטמפרטורת חדר בחושך על ידי דוגרים השקופית עם הדגימה בתוך תא לח קטן מורכב מקופסא פלסטיק הקטנה עם נייר מגבת רטוב בתחתית.
  9. בעקבות ההכלאה, להרים את האיברים עם כלי לנתיחה קנס ומהירות להעביר אותם לשקופית מיקרוסקופ טרי המכילה 30 μl של חיץ הכלאה חדש בתוספת DAPI (0.1 מ"ג / מיליליטר ב 1x PBS) והכיל עם חוסם נוזלי.
  10. לכסות את הדגימות עם תלוש כיסוי, לאטום שנינותמסמר h פולני ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal.

4. טיפול בצמח, יד חתך, קיבוע, וכלאה לדגי ירליות

  1. לחסן שתילי עגבניות עם ירליות באמצעות חיסון בתיווך כנימות viruliferous. ניתן לאתר את הנגיף בשיטת FISH זה בצמחי symptomless שבוע לאחר חיסון. תסמיני מחלה אופייניים הם לאחר חיסון שלושה שבועות נראה לעין. השתמש בצמחי עגבניות noninfected ולא דגימות בדיקה עבור פקדים כדי לאשר הכלאה ספציפית.
  2. השתמש בסכין גילוח חד היסטולוגית להכנת 2-4 סעיפי יד לחתוך סנטימטר אורך או רוחב של עגבניות גבעולים ועלים.
  3. בצינורות Eppendorf, לתקן את הסעיפים במקבע של Carnoy לשעה 2 בלילה בטמפרטורת חדר.
  4. הסר מקבע ולשמר את החלקים באתנול מוחלט במשך כמה ימים עד מספר שבועות בטמפרטורת חדר, או להמשיך לשלב הבא.
  5. שטוף את החלקיםשלוש פעמים, 1 דקות כל אחד, בחיץ הכלאה.
  6. להכליא חלקים עם 500 μl של חיץ הכלאה בתוספת 10 pmol של חללית ניאון oligonucleotide Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 "אשר משלים רצף בגן חלבון מעיל ירליות.
  7. שטוף את החלקים שלוש פעמים, 1 דקות כל אחד, בחיץ הכלאה.
  8. סעיפי הר שלם בחיץ הכלאה בתוספת DAPI (0.1 מ"ג / מיליליטר ב 1x PBS) והכילו עם חוסם נוזלי, לכסות עם coverslip, חותמים עם לק ולהציג תחת הקרינה או מיקרוסקופ confocal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המערכת למדה בכתב היד הזה מוצגת באיור 1 וכוללת צמח נגוע עם ירליות, מבוגרים ונימפה של B. הכנימות tabaci, והתמונות של האנטומיה הפנימית של הכנימות המראות את הדרך לטרנסלוקציה ירליות בחרקים. איור 2 מראה דגים כפולים בכנימות בוגרות לסימביונט העיקרי Portiera וסימביונט המשני Arsenophonus. איור 3 מציג FISH הכפול עבור Portiera וHamiltonella, ו איור 4 מראה FISH הכפול עבור Portie...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן ללוקליזציה של וירוס צמח במארח מפעלה ווקטור חרקים, חיידקים וendosymbiotic במארח הכנימות הספציפיים שלהם, יכול להיות מותאם ללוקליזציה של וירוסים אחרים בצמחים ואפילו ברקמות של בעלי חיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי למקם חיידקים פתוגניים endosymbiotic ומיקרואורגניזמים אחרים במערכות צמחים ובעלי חיים. השיטות שתוארו מסתמכות על רעיון פשוט של הכלאה בין בדיקה קצרה, fluorescently שכותרתו oligonucleotide DNA וה-DNA היעד או מולקולת RNA בתא. התוצאה היא הכלאה ספציפית, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר במעבדה גאנם נתמכה על ידי מענק מחקר לא. 908-42.12/2006 מהקרן הגרמנית ישראלית (GIF), מענק לא. IS-4062-07 מארצות הברית וישראל דו הלאומית קרן החקלאות ארצות המחקר ופיתוח (BARD), ומענק מחקר לא. 884/07 מקרן הלאומית למדע (ISF) לMG

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תווית פלואורסצנטית  בדיקותMetabion20 bp HPLC רצף מטוהרשתוכנן על ידי הלקוח
Toluidine blueSigma-Aldrich89640
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'L3771ביולוגיה מולקולרית כיתה
פורממידסיגמא-אולדריץ'F9037ביולוגיה מולקולרית כיתה
Tris-HClSigma-AldrichT5941כיתה ביולוגיה מולקולרית
חומצה אצטית קרחוניתסיגמא-אולדריץ'320099בדרגת ביולוגיה מולקולרית
טד פלה בע"מ.ברקוד 22309
חוסם נוזלים

מקורות

  1. Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
  2. Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
  3. Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
  4. Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
  5. Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
  6. Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
  7. Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
  8. Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
  9. Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
  10. Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
  11. Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
  12. Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
  13. Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
  14. Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
  15. Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
  16. Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
  17. Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
  18. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
  19. Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
  20. Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FISHFISHDNARNA
פלואורסצנציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.