משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

סיכום

משלוח תא intramyocardial במודלים עכבריים של מחלות לב וכלי דם, כגון יתר לחץ דם או אוטם שריר הלב, הוא בשימוש נרחב כדי לבדוק את הפוטנציאל הטיפולי סוגי תאים שונים במחקרי התחדשות של. לכן, תיאור מפורט ויזואליזציה ברורה של הליך כירורגים זה יעזרו להגדיר את הגבולות ואת היתרונות של ניתוחים טיפוליים תא לב וכלי דם במכרסמים קטנים.

תקציר

מחקרים קודמים הראו כי משלוח התא מקדם שיפור תפקוד לב על ידי שחרורו של ציטוקינים וגורמים המגבירים revascularization רקמת לב והישרדות תא. בנוסף, תצפיות נוספות העלו כי יש תאי גזע ספציפיים, כגון תאי גזע לב, תאי גזע mesenchymal וcardiospheres היכולת לשלב בתוך שריר הלב שמסביב על ידי הבחנה לתוך שריר לב, תאי שריר חלק ותאי האנדותל.

כאן, אנו מציגים את החומרים ושיטות כדי לספק באופן אמין תאי noncontractile לתוך הקיר של החדר השמאלי של עכברי immunodepleted. הצעדים הבולטים של הליך microsurgical זה כרוך בהרדמה והזרקת שיכוך כאבים, אינטובציה intratracheal, חתך כדי לפתוח את החזה ולחשוף את הלב ואספקה ​​של תאים על ידי מחט 30 מד סטרילי ומזרק microliter דיוק.

עיבוד רקמות בהיקף של קצירת לב, embedding, חתך וצביעה היסטולוגית הראתה כי הזרקת תאי intramyocardial הופקה נזק קטן באזור epicardial, כמו גם בקיר של החדר. תאי Noncontractile נשמרו לתוך קיר שריר הלב של עכברי מדוכאי חיסון והיו מוקפים בשכבה של רקמת fibrotic, עשוי להגן מפני לחץ לב ועומס מכאני.

מבוא

פרוטוקולי מסירת תאים שונים נבדקו במודלים עכבריים ועכברושים של מחלות לב וכלי דם, במטרה לתרגם את היעילות, היעילות ובטיחות של הליך הניסוי בחולים אנושיים. בלב מכרסם קטן, משלוח תא intramyocardial הוא השיטה ריאלי ביותר של תא משלוח ^1,2, ואילו בלב החולדה antegrade ³ ועירוי תאים ⁴ intracoronary מדרדר יכול לשמש גם. שני שיטות יש יתרונות ומגבלות. יש תא משלוח דרך מסלול intracoronary יתרונות תיאורטי על זריקה תוך שרירית ישירה בקידום הפצה סלולרי הגלובלית ^3, אבל יש לה גם את הסיכון לגרימת ^3,5 תסחיף כלילית. מגבלות על אספקת intramyocardial משויכות פגיעה מכאנית, דלקת חריפה, ^ו6,7 נזק בשריר הלב. בבני אדם, תאים לתיקון לב מועברים על ידי הזרקת intramyocardial דרך epicardial endocardial או כירורגיםלהתקרב או על ידי תוואי עורקי intracoronary ^8. הזרקה במסלולי transvascular מתאימה בחולים עם אוטם שריר הלב אקוטי וreperfused, אבל ייתכן שלא ניתן במקרה של חסימות בסך הכל או זרימה לקויה בתוך כלי השטח בוצע ^9. הזרקה ישירה לתוך הקיר של החדר על ידי הזרקת transendocardial או transepicardial היא אפשרית מבחינה טכנית, בהתאם למצב בריאות המטופל. ואכן, זה כבר הראה כי טכניקה זו היא בטוחה ^10,11, אם כי להזרקת transepicardial ניתוח חזה פתוח הוא הכרחי ולtransendocardial גישות מיפוי אלקטרו לכל חולה נדרש לבדל את האתרים של שריר הלב איסכמי או מצולק קיימא ^9.

חשוב מכך, במחקרים לטיפול בתא הבחירה של התא הטוב ביותר כדי להיות מושתלים היא עדיין תחת חקירה. ניתוחים לטווח קצר (4 שבועות) הראו כי הזרקה של תאי גזע לב המוגדרים כcardiospheres 12 או תאי אוכלוסיית צד ממח עצם ¹³ מושרה התאוששות תפקודית לב ^ב14 ועכברוש ¹⁵ מודלים Murine של אוטם שריר הלב על ידי הפחתת גודל צלקת ומוות של תאים. השתלה אלוגנאית של cardiospheres במודל אוטם שריר הלב חולדה ללא דיכוי חיסוני נמצאה להיות בטוח, קידמה התחדשות לב, ושיפור בתפקוד לב באמצעות גירוי של מנגנוני תיקון אנדוגני ^15. תאי אב Lin-/c-kit + מבוגר בלב הוצגו להיות עצמי חידוש, clonogenic, וmultipotent במבחנה ובחי, וכאשר הוא מוזרק לתוך לב חולדה איסכמי מחדש חלקים גדולה של קיר שריר הלב הפגוע ¹⁶ והיו לי יכולת ליצור עורקים הכליליים מוליך וגודל בינוני ^17. נתונים מבטיחים אלה מונע על שלב I ו-II של ניסויים קליניים בבני אדם: הזרקה של תאי גזע mesenchymal עצמיים ואלוגנאית (MSC) ^18, cardiospheres ¹⁹, או תאי c-Kit חיוביים גזע לב (CSC) 20 בלב אדם איסכמי כל הראו השפעות מועילות בתפקוד לב במחקרים לטווח ארוכים. עם זאת, מעקב ארוך טווח נרחב ומטה אנליזה רטרוספקטיבית, הוכיחו כי טיפול בתאי גזע מספק יתרון משמעותי לחלק מחולים, אבל לא באחרים עם מגוון של תוצאות בלתי צפויות ^21. יתכן כי מגבלות אלה יחייבו את העיצוב של פרוטוקולים ספציפיים של משלוח תא עבור כל אדם ובכל מחלה.

במודלים של עכבר וחולדה, מחקרים ארוך טווח עולים כי הזרקת תאים לא שפרה את תפקוד לב (12 חודשים) נוספת. ואכן, שתלי של cardiomyocytes גזע העוברי האנושי שמקורם בתא (hESC-CM) היו מבודדים במידה רבה משריר לב המארח בשכבה של רקמת fibrotic ^22,23. תוצאות דומות נצפו לאחר השתלת intramyocardial של myoblasts שלד ללב של עכברי infarcted ^24. Furthermoמחדש, ביכולות ארוכות הטווח של MSCs אלוגנאית כדי לשמור על תפקוד בלב infarcted היו מוגבלות על ידי המעבר מimmunoprivileged למדינת immunogenic לאחר התמיינות ^25.

אם ניקח בחשבון את האתגרים וסיכויים שתוארו לעיל, אנו מראים כאן כיצד להעביר את התאים על ידי הזרקת intramyocardial בעכברים. אנו צופים כי תאים ללא מאפייני התכווצות cardiomyocyte אינם קשורים לשריר לב המארח ויוצרים מסה מלוכדת עם מחסום fibrotic דק. אמנם בחלק ממקרי תוצאה זו עשויה להיות יתרון, הניתוח הבא עשוי להיות שימושי כדי להבין כיצד engraftment התא עשוי להיות מווסת כדי ליצור מבני שריר הלב פונקציונלי מחוברים גם כן.

פרוטוקול

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם בינלאומי (הוראת 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי) ו( Office Home בריטניה, חוק 1986) הלאומי תקנות. ההליכים המתוארים במסמך זה הם חלק מתכנית העבודה תחת רישיון הרשויות בבריטניה שלנו ולא היה מבוצעים במטרה של הקלטה.

1. הכנת תאים

פרוטוקול זה מתאר את הכנתו של קו תאים ספציפי (כליה עוברי אנושית, HEK293 תאים) למטרות הדגמה. פרוטוקולי תא ספציפי חייבים להיות מועסקים לגידול וסופו של דבר תאי גזע pluripotent או מבוגר לשושלות תאים ספציפיים.

1. לגדל תאי DMEM תקשורת (גלוקוז גבוהה, 4,500 מ"ג / ליטר) המכיל 1% פירובט נתרן, 2 גלוטמין מ"מ, פן / סטרפטוקוקוס אנטיביוטיקה 1% ו10% בסרום שור עוברי (FBS). צלחת 10 סנטימטר אחד יש בדרך כלל לפצל ב1:3 תקשורת בתוספת טרי כל יומיים.
2. טיפול בתאים במתינות עם trypsב1x ו resuspend במדיום DMEM כפי שמתוארים ב1:1.
3. ספירת תאים בתא hemocytometer ולאסוף 3 x 10 ⁶ תאים לתוך צינור נפרד.
4. צנטריפוגה בהרוטור דלי נדנדה ב100 גרם במשך 5 דקות.
5. בטל supernatant ולשטוף את התא גלולה עם חיץ פוספט סטרילי 2x.
6. Resuspend ב PBS 1x בריכוז של 10 ^6/50 ul להזרקה לתוך החדר השמאלי של עכברי immunodepleted.

2. תנאי Presurgical

1. לשמור על עכברי immunodepleted (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) עם כדורי סטרילי מזון ומים במבודד טמפרטורה מבוקרת (22 מעלות צלזיוס; טבלת 1) לפני כל ניתוח.
2. לבצע ניתוח של עכברי immunodepleted תחת הזרימה למינרית. נקה את אזור העבודה עם אתנול 70% וחיטוי כלים כירורגיים (מלקחיים ומספריים).
3. הפעל כריות חימום לניתוח ולהחלמה. כריות חימום חשובותכדי לחסום את הירידה של טמפרטורת גוף מתרחשת בזמן ולאחר ניתוח.
4. מניחים כלוב נקי וautoclaved על כרית התאוששות לחימום.
5. להעביר את העכברים בכלוביהם המקוריים מהמבודד לניתוח החדר לתוך שקית autoclaved סטרילי.
6. לשקול את העכבר ובהתאם למשקל הגוף להזריק תת עורית (SC) תמיסה המכילה medetomidine וקטמין הידרוכלוריד בדילול מלא ב0.9% תמיסת מלח סטרילית כדי להרדים את העכבר, כמו גם להירגע השרירים (medetomidine 1 מ"ג / קילוגרם; קטמין הידרוכלוריד 75 מ"ג / קילוגרם).
7. הסר את העכבר מהכלוב כאשר בהרדמה מלאה (בתוך 1-2 דקות, לא הבוהן קמצוץ רפלקס לאחר גירוי)
8. להחיל את אזור גרון קרם להסרת שיער בצד השמאל של החזה ו. לאחר כמות מתאימה של זמן (כ 2-5 דק '), לנגב את השערות רופפות עם רקמת מים רטובים.
9. מניחים את העכבר בלוח הניתוח במצב שכיבה. מןנקודת מבטו של המנתח העמדה היא למטה את הראש אנכי, זנב.
10. הזרק פתרון במשככי כאבים ב0.1-0.2 מיקרוגרם / g בדילול מלא בתמיסה סטרילית תמיסת מלח (עצירות) לתוך תת עור הגפיים האחורי ולכסות את האזור המגולח עם יוד povidone הפתרון אספטיים באמצעות מטוש צמר גפן קצה.
11. פוקוס מיקרוסקופ (האובייקטיבי 2.5x) באזור הגרון.

3. תנאי כירורגי

1. במספריים קהים לעשות חתך בעור הגחון קו האמצע של כ 0.5-1 סנטימטר אורך מעט מתחת לסחוס cricoid. להפריד את העור מרקמות חיבור כדי להמחיש את בלוטות הרוק.
2. לפצל את בלוטות הרוק בחלוקת קו האמצע הטבעי שלהם בו זמנית על ידי משיכת כל צידת חלק עם מפשק חזה מלקחיים ומגנטיים ולחשוף את קנה הנשימה.
3. משוך את הלשון בעדינות לצד לחשוף את הגרון. חלק את צינור אינטובציה בזהירות לתוך קנה הנשימה. קצה הצינור גלוי דרך l מוצגarynx וקנה נשימה. חשוב מכך, אם הצינור הוא ב, אבל לא נראה בבירור, זה בוושט. הסר אותו ולשנות את המיקום של קצה הצינור.
4. חברו את הצינור למכונת ההנשמה. הגדר את נפח הפעימה ב200 μl ושבץ 150 / דקה. אבטח את צינורות האוורור בלוח הניתוח עם קלטת.
5. עם מספריים ומלקחיים בוטים, להפוך את זנב אנכי בראש 1 - ל1.5 ארוך סנטימטר חתך בעור מעל אזור בית החזה השמאלי.
6. שחרר את העור משכבות רקמה / שריר חיבור ושרירי חזה הגדולים וקטנים מבלי לבצע חתכים.
7. לבצע פתיחת בית החזה בין הצלעות השלישית והרביעית באופן הבא:
   1. לנקב את שכבת השרירים הבינה צלעיים על ידי צביטה ומגרד עם מלקחיים קטנים, מעוגלים.
   2. ברגע ששכבת השרירים הבינה צלעיים מחוררים, מניח את מפשק החזה כדי לפתוח את חלל החזה מקסימאלי. החלקים העליונים ואמצעיים של החדר השמאלי (LV) עם האפרכסת שמעליה (אטריום) שלה הםעכשיו נראה לעין.
8. הכן את מזרק דיוק עם תאים. המזרק צריך להיות מסוגל לספק כמות נפח 10 ul לכל זריקה. יצוק מחט G 30 בקצה של המזרק.
9. לתקן עם קלטת צינורית פלסטיק קטנה (מ20 G introcan-W) על המחט, והשאיר נחשף 1 מ"מ בלבד כולל הטיפ הפתוח של המחט. זה ימנע את המחט מחירור קיר חדר שמאל כולו והזרקת התאים לתוך חלל החדר השמאלי.
10. בעזרתו של אובייקטיבי 5X, לדמיין בהגדלה זה החדר השמאלי ומזריק את התאים לתוך הקיר של החדר השמאלי ב5 מקומות שונים (כל זריקה תספק 10 ul עבור סכום כולל של 106 תאים המוזרקים). אם הזריקה היא מוצלחת, אזור לבן והעדר לגל גדול של התאים יהיו גלויים (אם הזריקה לא הייתה מוצלחת, בעלי החיים לא יורשו אנליזה פונקציונלית).
11. הסר את מפשק. סגור את קיר בית החזה ב y מצרף שתי צלעות נפרדות עם שני תפרים של 6-0 תפר משי.
12. לחות שרירי החזה ועור עם קצה כותנה הספוג PBS 1X והניח בעדינות את שרירי גב למצב המקורי עם המלקחיים.
13. סגור את העור עם תפרים של 3-4 6-0 תפר משי. תפר את החתך בגרון עם 2-3 תפרים כדי לסגור את העור.
14. הזרק atipamezole (1 מ"ג / קילוגרם ריכוז סופי) לחזור השפעות ההרדמה.
15. ברגע שהעכבר מתחיל לנשום באופן עצמאי, מוציא את הצינור מקנה הנשימה ולשים את העכבר על הצד הימני שלה. העכבר צפוי להתאושש תוך מספר דקות.
16. כאשר העכבר מתחיל להסתובב וללכת, למקם אותו בכלוב החם ההתאוששות (כלוב IVC קטן עם ראש סגור מסונן) לשעה.
17. השאר את החיות לילה בתיבה מבוקרת מחוממת (37 מעלות צלזיוס).
18. למלא צלחת עם מים ומזון גלולה כדי לתמוך בהתאוששות במהלך 2 הימים הראשונים שלאחר ניתוח.

ss = "jove_title"> 4. ניתוח שלאחר ניתוח

עשרה לבבות הוזרקו תאים ו10 לבבות לא הזריקו שליטה מנותחים בהיסטולוגיה כדלקמן:

1. לבצע ניתוח של התאים המורכבים 1 שבוע לאחר ההזרקה (איורים 1 ו -3).
   1. לאחר המתת חסד על ידי מנת יתר של isoflurane, ינקב את לבם עם 20 מיליליטר של paraformaldehyde 4% (PFA) כדי לתקן את הרקמה. מייבשים את הרקמה קבועה בהגדלת אחוזי אתנול (מ70-100%) ולהטביע בבלוקי פרפין.
   2. סעיף הלבבות בפרפין עם microtome במיקרומטר 5 ואת הכתם עם hematoxylin ו eosin לניתוח צורני.
   3. דמיין רקמת חיבור באמצעות כתם Trichrome של מייסון.
   4. לנתח את התמונות תחת מיקרוסקופ סורק שקופיות (איורים 1 א, 2 א, 3 א, 3 ב, 3 ג ו) ולדמיין את כל הלב בתצוגת ציר קצר באמצעות מיקרוסקופ סורק שקופיות דיגיטלי (figuמיל 1B ו 1C).
2. לאחר הניתוח לעיל, deparaffinize רקמות הלב בקסילן, רעננותם על ידי השריית דגימות בהפחתת אחוזי אתנול (מ100% למים) ותהליך הסריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM) כדלקמן:
   1. דגירה בלוקים deparaffinized עם 1% חומצה טאני ב0.1 חיץ פוספט M במשך שעה 1.
   2. מייבש את הדגימות בהגדלת אחוזי אתנול (25-100%).
   3. דגימות יבשים עם HMDS (hexamethyldisilazane).
   4. הר את הדגימות בסטאבס עם אצ'יסון הכסף דאג ומעיילם עם הזהב ופלדיום.
   5. צפה בדוגמאות במיקרוסקופ אלקטרונים סורק אנליטית (איור 2 ב).

תוצאות

אנו מזריקים HEK293 תאים, שניתן להבחין מתאי הלב על ידי המורפולוגיה שונה שלהם (איור 1), עם צורה מרוצפות בהשוואה לשריר הלב המוארך (איור 1 א). תאי HEK293 היו יותר תגובתי לצבע hematoxylin (צבע כחול) בהשוואה לשריר לב (בצבע ורוד), סביר להניח כי התוכן שלהם המוגבר הגרעיני (איור 1 א). כדי להבדיל עוד יותר את התאים המוזרקים מן הרקמה המארחת, HEK293 תאים תויגו עם DAPI 2 שעות לפני הזריקה. שכותרתו תאים היו גלויים לעין ברקמת שריר הלב כפי שמוצגים <...

דיון

בכתב היד הזה, שהראינו כיצד לבצע הזרקת intramyocardial של תאים בלב עכברי. כהוכחה של מתודולוגיה זו, יש לנו להשתמש HEK293 תאים. חשוב להדגיש, כי תאי HEK293 אינם משמשים בכל מחקר טיפול בתא, ולכן הממצאים של כתב היד הזה אינם מתאימים לתרגום ישיר לגישה טיפולית. עם זאת, העובדה כי תאי HEK293 אינם תאי התכווצות ולא transdifferentiate בסוגי תאים אחרים ממקדת את תשומת לב בהיבטים טכניים כגון מאפיינים של התאים כדי להיות מועבר ואת המסלול של משלוח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
	מבודד	Pfi	דרושה הצעת מחיר
כרית חימום	Vet Tech Solutions	HE006	עבור בעלי חיים קטנים
Medetomidine	השירות		מרשם וטרינרי הוא הכרחי
קטמין הידרוכלוריד	השירות		מרשם וטרינרי הוא הכרחי
Atipamezole	השירות הווטרינרי הלאומי	מרשם וטרינרי הוא הכרחי
סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים	Jeol	JSM-6610
מספריים קהים	FST	14084-09
Minivent	הרווארד מנגנון	73-0043	כולל מתאם Y קטן (73-0027) וצינורית אינטובציה (73-2844)
מלקחיים	FST	11052-10
מערכת נסיגה	FST	18200-20	ערכה לבעלי חיים עד 200 גרם
30 G 12 מ"מ; ½ אינץ'	BBraun	A210
מזרק מיקרוליטר	משובח ESSLAB	81201	כולל גם מתקן חוזר של המילטון PB 600-1 מספר קטלוגי 83700
6-0 תפר משי	Ethicon	W1614T

מערכות הווטרינרי הלאומי הווטרינרי הלאומי קרם להסרת שיער חנויות מסחריות Buprenorphine NVS מרשם וטרינרי הוא הכרחי Leica MZFLIII מיקרוסקופ Leica דגם S6E עם מעמד זרוע נדנדה TS0 Hamamatsu Nanozoomer סורק שקופיות דיגיטלי סדרת Hamamatsu RS צהוב