אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP). פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם הנגרם CLP מוצגים כאן: פרוטוקול למדידת autophagy באמצעות עכברים (GFP)-LC3, ופרוטוקול למדידת היווצרות autophagosome על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP), הגורם לאלח דם polymicrobial. כאן, פרוטוקול מסופק לגרום אלח דם של חומרה שונה בעכברים תוך שימוש בטכניקת CLP. Autophagy הוא תגובת רקמה בסיסית ללחץ ופלישת הפתוגן. שני פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם ניסיוני מוצגים גם כאן. (אני) עכברים הטרנסגניים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק חלבון היתוך (GFP)-LC3 חשופים לCLP. שיפור מקומי של אות ה-GFP (puncta), כassayed או על ידי מבחני immunohistochemical או confocal, יכול לשמש כדי לזהות היווצרות autophagosome משופרת, ולכן הפעלה שונתה, של מסלול autophagy. (II) היווצרות vacuole autophagic המשופרת (autophagosome) לאזור רקמת יחידה (כסמן של גירוי autophagy) ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. המחקר של תגובות autophagic לאלח הדם הוא חינמון קריטיonent להבין את המנגנונים שבאמצעותם רקמות מגיבות לזיהום. ממצאי מחקר בתחום זה עשויים בסופו לתרום להבנת הפתוגנזה של אלח דם, המייצגת את אחת בעיות עיקריות ברפואה בטיפול נמרצת.
מבוא
אלח דם, תגובה דלקתית מערכתית לזיהום, מייצג גורם מוביל למוות בחולים ביקורתי חולים 1. זיהומי התוך בטני, לעתים קרובות מובילים לאלח דם polymicrobial, חשבון 20% מהמקרים אלח דם, שבו יש תמותה משמעותית של עד 60% 2. התמותה הקשורים אלח דם נובעת בעיקר מבעיות של מרובי איברים עם כשל איברים לאחר 3,4. יש צורך בחקירה נוסף לתוך המנגנון הפתוגני של מחלה זו בדחיפות כדי לקדם את הפיתוח של טיפולים חדשניים ויעילים יותר.
שיטת קשירה ולנקב cecal (CLP) היא הליך נפוץ לאלח דם דוגמנות in vivo. כcecum מלא בחיידקים, תוצאות לנקבו בדלקת הצפק polymicrobi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש בריגהם ובשטח בית הספר לרפואה בבית החולים / הרווארד נשים אישרה את הנהלים הבאים.
1. Cecal קשירת ונקר
השתמש בעכברים מאותו הרקע (C57Bl / 6), זכר, 8-10 שבועות. נקבות עכברים עמידים יותר מאשר גברים נגד הקטלניות-Induced אלח דם. עכברים מבוגרים מ -8 שבועות להפיק תוצאות משתנים פחות מעכברים צעירים במונחים של הישרדות לאחר CLP. כ N = יש להשתמש 10 עכברים לכל קבוצה בהשוואה לניתוח לשרוד. N = 3-5 עכברים הוא נאותים למבחני autophagy.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בקטרמיה קיימת בעכברים מוקדם ככל 6 שעות לאחר אלח דם CLP-Induced 14. סימנים קליניים של אלח דם (כוללים צמרמורות, tachypnoea ופעילות מוטורית לקויה) מופיעים כ 12 שעה לאחר ההליך. עכברים נתון CLP מתחילים למות בסביבות 18 שעות לאחר האינדוקציה של דלקת הצפק. חמור יותר הוא אלח הדם מוגבר יותר קטלני 15. בפירוט, אלח דם בדרגה גבוהה גורם לתמותה 100% בתוך 2-3 ימים, בעוד שתוצאות אלח דם באמצע כיתה בתמותה סביב 60% ב 7 ימים לאחר CLP (מעבר למגבלת זמן זו, לא הייתה מקרי מוות צפויים) .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
היתרון העיקרי של CLP הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור אלח דם של חומרות שונות (כלומר מנמוך לכיתה גבוהה באמצע ו). חומרה של אלח דם הנגרם מושפעת אורך cecum ligated (שהקובע החשוב ביותר), בגודל של מחט המשמשת לניקור ומספר החורים ביצעו 15. בנוסף, זן העכבר והמין יכולים להשפיע על החומרה של אלח דם; מספר זנים רגישים יותר מאחרים וגברים הם בדרך כלל רגישים יותר מאשר נקבות 19,20. הגורמים הנ"ל נלקחו ביחד לקבוע את התמותה הנגרמת CLP.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להכריז
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי NIH HL108801 P01 מענקים, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, לAMK צ'וי. ס Ryter קיבל תמיכה ממשכורת אבלייס הנשימה מכון המחקר.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכברים טרנסגניים GFP-LC3 | ריקן (יפן) | RBRC00806 | GFP-LC3#53 |
| קסילזין | הנרי-שיין | 568-0606 | קסילזין HCl הזרקת וטרינר |
| קטמין | הנרי-שיין | 995-2949 | קטסט 100 מ"ג/מ"ל |
| EtOH | פישר | A405-20 | כיתה היסטולוגיה |
| EtOH | פישר | A407-1 | לעיקור |
| תפרים כירורגיים משי 6-0 | אוונס & מינורי | 2300-0078OG, 017624 | |
| בופרנורפין-HCl | הנרי-שיין | 614-5157 | בופרנקס אמפולס |
| פרפורמלדהיד (37%) תמיסה | JT Baker | S898-09 | |
| קסילנים | פישר | X3P-1GAL | |
| נוגדן חד שבטי נגד GFP | Life Technologies | G10362 | |
| Hoescht | Sigma | 944403 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| OCT | VWR מדעי | 25608-930 | |
| סודן שחור | סנטה קרוז | sc-203760 | |
| EM כיתה גלוטרלדהיד 2.5% בנתרן קקודילאט | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 15960 | |
| תחמוצת פרופילן | סיגמא | 240397 | |
| אגר 100 שרף | אגר מדעי | R1045 | |
| dodecenylsuccinic anhydride | Sigma | 46346 | |
| methylnadic anhydride | Sigma | 45359 | |
| N-benzyldimethylamine | Sigma | 185582 |
מקורות
- Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathology and treatment of sepsis. N. Engl. J. Med. 348, 138-150 (2003).
- Anaya, D. A., Nathens, A. B. Risk factors for severe sepsis in secondary peritonitis. Surg. Infect. 4, 355-362 (2003).
- Bone, R. C., Grodzin, C. J., Balk, R. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
