הערכת שינויים בנדיפות כללית הרדמה רגישות של עכברים לאחר התערבות תרופתי מקומית או מערכתית

סיכום

אובדן של רפלקס ליישר שימש עוד פונדקאית התנהגותיות סטנדרטית לחוסר הכרה, המכונה גם היפנוזה, בחיות מעבדה. שינויים ברגישות לחומר הרדמה נדיפים הנגרמים על ידי התערבויות תרופתיים יכולים להיות מזוהים עם מערכת מבוקרת בקפידה תפוקה גבוהה הערכה, אשר עשוי להיות מותאמת לאספקה ​​של כל טיפולי בשאיפה.

תקציר

נקודת סיום רצויה אחד מהרדמה הכללית הוא המצב של חוסר הכרה, הידוע גם בהיפנוזה. הגדרת המצב ההיפנוטי בבעלי חיים היא פחות ברורה מאשר בחולים אנושיים. הפונדקאי התנהגותי בשימוש נרחב להיפנוזה במכרסמים הוא אובדן ליישר רפלקס (LORR), או הנקודה שבה החיה כבר לא מגיבה לאינסטינקט המולד שלהם, כדי למנוע את הפגיעות של כיבה על גב. אנחנו פיתחנו מערכת להערכת LORR ב24 עכברים בו זמנית תוך שליטה בזהירות לבלבול פוטנציאלי, כוללים תנודות טמפרטורה ושונים תזרים גז. תאים אלה יאפשר הערכה אמינה של רגישות הרדמה כפי שהיא נמדדת על ידי חביון להשבה של רפלקס ליישר (RORR) בעקבות חשיפת הרדמה קבועה. לחלופין, באמצעות עלייה בשלבים (או ירידה) בריכוז חומר הרדמה, התאים גם לאפשר קביעת הרגישות של אוכלוסייה לאינדוקציה (או הופעתה), כפי שנמדדו על ידיEC ₅₀ ומדרון גבעה. לבסוף, תאי הסביבה המבוקר המתוארים כאן ניתן להתאים למגוון רחב של שימושים אלטרנטיביים, כוללים משלוח בשאיפה של תרופות אחרות, מחקרי רעלים, וניטור בזמן אמת בו זמנית של סימנים חיוניים.

מבוא

הרדמה כללית מוגדרות על ידי היכולת שלהם לגרום למצב הפיך בהיפנוזה במגוון רחב של מינים, ובכל זאת הסבר איך כיתה מגוונת כגון תרופות כל יכולה לעורר נקודת סיום ביחיד נותרת חמקמקה. מספר התיאוריות שהציג לאורך השנים, החל מהמתאם מאייר-אוברטון בין עוצמת הרדמה ומסיסות שומנים בדם, אשר הציע שיבושי קרום כלליים כבסיס ^ל1,2 היפנוזה. ראיות חדשות יותר מצביעות על כך שמטרות חלבון משפיעים על איתות עצבית לתרום להשפעות הרדמה. עכברים הוכיחו להיות מודל חיוני לחקר התיאוריות אלה בגלל ההומולוגיה בין עכברי והיענות הרדמה אנושית. למרות שעכבר לא יכול להישאל על המודעות הסובייקטיבית שלה תחת הרדמה כללית, רפלקסים פרימיטיביים מסוימים לשמש מדדים פונדקאיות כשימושיים של היפנוזה מכרסם. בימים הראשונים שלאחר לידה, עכברים לפתח שו"ת ליישר רפלקסיביתonse שמונע מהם שיוצבו באופן פסיבי במצב שכיבה ^3. המינון של הרדמה שבה עכבר מאבד את רפלקס ליישרה וקושרת היטב עם מינונים היפנוטיים אדם ^4.

ההערכה של אובדן רפלקס ליישר (LORR) הפכה לסטנדרטית במעבדה בשימוש נרחבת לבדיקת רגישות הרדמה בעכברים, כמו גם מגוון רחב של מינים אחרים, כולל עכברים, שפן ניסיונות, ארנבת, החמוס, כבשים וכלב ^5-8. המינון של חומר הרדמה שניתנה בי LORR יתרחש לחברים של מינים הוא עקבי מאוד, אבל זה יכול להיות מוזז באופן משמעותי על ידי גורמים סביבתיים. לדוגמא, חולדות שנשללה שינה רגישות יותר לשני חומרי הרדמה נדיפים ווריד ⁹ וחולדות עם יכולת אירובית גבוהה פחות רגישים לisoflurane ^10. היפותרמיה גם הוכח להקטין את המינון של חומרי הרדמה רבות הנדרשות להיפנוזה במגוון גדול של מיני ^11-14. על מנתכדי לזהות את מינון חומר ההרדמה שבי LORR מתרחש בקבוצה של חיות ניסוי מהימן, זה קריטי, כי סביבת ההערכה להיות מבוקרת בקפידה כדי למזער את הלחץ, לשמור על euthermia, ולספק כמויות שווה של תרופה לכל הנושאים. באופן לא מפתיע, גורמים גנטיים ידועים גם לשנות את רגישות ההרדמה ^15-18. כתוצאה מכך, שיקול זהיר יש לתת גם לשליטה על רקע גנטי ^19.

פיתחנו מנגנון שמבטיח אספקת חומר הרדמה גזים זהה לכל אחד מ24 עכברים תוך שמירה על סביבת C 37 ^o קבועה. העיצוב הגלילי השקוף של תאי החשיפה שלנו מאפשר להערכת LORR המהיר ושילוב קל של מדידות פיסיולוגיות telemetric. מערכת זו הוכח כדי למדוד במדויק isoflurane, halothane, ואינדוקצית sevoflurane ₅₀ EC וזמן הופעתה בwild-type עכברים ^20. יש לנו גם בשימושבמערכת זו כדי לצפות שינויים ברגישות לחומר הרדמה בעכברים עם מוטציות גנטיות ונגעי ההיפותלמוס ממוקדים ^21-23. כאן אנו מתארים שתי דרכים שבהן רגישות הרדמה ניתן להעריך לאחר התערבות תרופתית באמצעות מנגנון הסביבה המבוקר שלנו. phenotyping מצב היציב של אינדוקציה הרדמה נדיפים ורגישות הופעה דורש 8-10 שעות וכתוצאה מכך הוא מותאם ביותר ללימודים שבתנאי ניסוי לא משתנים, כמו בהתערבויות תרופתיים כרוניות או ארוכות טווח. עם זאת, לטיפולים, משחק קצר תופעות שיתפזרו באופן משמעותי לאורך זמן אנחנו גם להציג הליך פשוט כדי להעריך את השינויים בליישר רפלקס הבא microinjections stereotactically הממוקד או טיפולים תרופתיים תוך ורידי המשפיעים הופעת הרדמה באופן משמעותי. בדיקות אלה מייצגות קבוצה קטנה של היישומים הפוטנציאליים עבור מערכת של הסביבה מבוקרת זו, אשר יכולה להיות מותאמת לכל מספר של Subjects של מגוון מינים כדי לקבל כל סוג של טיפול בשאיפה.

פרוטוקול

כל ההליכים כרוכים בבעלי חיים המפורטים במסמך זה אושרו על ידי האוניברסיטה והעדה מוסדי הטיפול בבעלי חיים ושימוש של פנסילבניה.

1. סקירה כללית של מנגנון הבדיקה

1. מנגנון הבדיקה מורכב מ24 תאים גליליים אקריליק ברורים 10 סנטימטר אורך ו 5 ס"מ קוטר (נפח כולל של 200 מיליליטר). גודל זה הוא מתאים לעכבר בוגר 25 גרם טיפוסי. יש לשכות יציאות בכל קצה לכניסת גז וחשמל. הסוף לשקע הוא נשלף, כך שעשויים להיות טעונים בעלי חיים בקלות אל תוך החדר. פתחי יציאת גז חתומים בזהירות עם סרט טפלון, בעוד אטמי הגומי O-טבעת משמשים לאטום את הסוף להסרה של התאים גליליים.
2. כל תא הוא רכוב על מדף שיושב בתוך אמבט מים. המתלה מצוידת, כך שהחלק התחתון בלבד של התאים (מתחת לפתחי כניסת הגז) הוא שקוע. ליציבות, הקצה האחורי של החדר נשען על תמיכה, כך שכל chambאה יושב בצורה אופקית. זה מבטיח מגע אפילו של כל החדר עם האמבטיה.
3. צינורות פוליאתילן מתחבר מיכל חמצן למאדת הרדמה, ולאחר מכן עוברים דרך L / מד זרימת דקות 10. הצינור מתפצל ל25 נגדים בקוטר קטן באורך שווה, כדי להבטיח זרימה שווה מועברת לכל אחד מהתאים 24 ומנתח סוכן.
4. קווי אבק לצאת מכל חדר בקצה השני של כניסת הגז. זה מקדם את הזרימה חד כיווני שמונעת נשימה חוזרת של נשף פחמן דו חמצני. קווי הוואקום לשלב בסעפת כדי להתחבר לקו יניקה בתוך הבית. שסתום קופץ מלאורך קו הוואקום העיקרי מבטיח תנאי לחץ אטמוספרי בתוך כל תא.
5. האמבטיה מלאה במספיק מים כדי ליצור קשר עם החלק התחתון של כל תא באופן מלא. המים מופצים דרך האמבטיה ומתוחזק בC 37 ^o מתמדת על ידי משאבה.

2. בדוק את מערכת לפני החשיפה

1. Cלעזאזל שהטמפרטורה של אמבט המים היא 37 C ^o לאורך האמבטיה.
2. זרימת חמצן בשיעור של 5 ליטר / דקה (200 מיליליטר / דקה לכל תא + מנתח סוכן). להטביע כל תא מתחת למים ולחפש בועות או כניסה של מים לתוך התא, אשר שניהם מעידים על הדלפות. לאטום כל הדלפות לפני תחילת הניסוי.
3. לכל חדר, להתחבר 500 מד זרימת מיליליטר / דקה בתור אחרי קאמרי לוודא כי תזרים מאוזנים על פני כל אחד מ25 קווי הגז. הדבר מבטיח כי תזרים קלט 5 ליטר / דקה יחולק באופן שווה, כך שכל תא מקבל 200 זרימת מיליליטר / דקה. כל תא אינו מקבל את הזרימה הצפויה צריך להיות הזרימה שלה וצינורות יצוא בדקו עבור חסימות.
4. כייל את מנתח הסוכן כדי להבטיח קריאה של isoflurane 0.00% כאשר 100% חמצן זורם.

3. משדר טמפרטורת שתל

1. שבוע לפני הרגלה, להרדים כל עכבר עם isoflurane 2%.
2. לחטא את אזור צוואר הגב עם בטאדין.
3. להזריק תת עורי משדר טמפרטורה בין השכמות באמצעות מחט מזרק סטרילי, ארוזה מראש.
4. לפקח על אתר ההזרקה יומי לזיהום והגירה של המשדר.

4. להרגיל בעלי חיים לתאי בדיקה

1. ארבעה ימים לפני ההערכה הראשונה, למקם את כל העכברים לתאים בודדים במשך שעה 2 עם 100% חמצן זורם.
2. חזור על שלב 4.1 יומי לארבעה ימים שקדמו להערכה, כדי למנוע תופעות של הבלבול של לחץ בשל סביבה חדשה.

5. לבצע התערבות תרופתי שאתה רוצה לבדוק להשפעות על ההרדמה רגישות

1. התערבות זו עשויה להיות הזרקת stereotaxic לחלק מסוים של המוח ^24, הזרקה תוך ורידית או intraperitoneal ^25, או מסירה של תרופה לאזור ספציפי במוח באמצעות צינורית ²⁶.
2. מכיוון שהליכים אלה עצמם עשויים לשנות את רגישות חומר הרדמה בהשוואה לבעלי חיים תמימים, קבוצת ביקורת ראויה צריכה לעבור את אותו תהליך עם זריקות רכב.
3. ודא שיש לו את ההתערבות תרופתי משך הפעולה ארוך כראוי אם אתם מתכננים לעשות בשלבים הגדלת ו / או הקטנת קביעת רגישות הרדמה כפי שמוצג בשלב 6 שלהלן, אחרת, דלג לשלב 7.

6. להעריך הרדמה רגישות באמצעות קביעה בשלבים EC ₅₀ לאינדוקציה וצמיחה

1. מניחים כל בעלי חיים לתאי אדם עם 100% חמצן זורם.
2. קבע את ריכוז isoflurane ל* 0.4% ל15 דקות. במהלך 2 דקות האחרונות של תקופה זו, להעריך את רפלקס ליישר של כל בעלי חיים על ידי בעדינות מגלגל את החדר עד שהעכבר ממוקם על הגב שלה. רפלקס ליישר נחשב שלם אם ורק אם העכבר הוא מסוגל לשחזר את כלמכפותיו על הרצפה של החדר בתוך 2 דקות.
   1. * שים לב שisoflurane 0.4% הוא מינון subhypnotic בעכברי C57BL/6J. אם כל עכברים לאבד את רפלקס ליישרם בשלב הראשון, במינון הראשוני היה גדול מדי ויש להפחית בימים שלאחר מכן.
3. הקלט את המדינה ליישר רפלקס לכל עכבר ולסרוק כל עכבר לנתוני טמפרטורה. שיא תבנית מוצג בטבלה 1.
4. להגדיל את ריכוז isoflurane ידי ~ 0.05% במשך 15 דקות וחזור על שלב 7.2. תמשיך לעשות את זה עד שכל בעלי החיים שאיבדו רפלקס ליישרם.
5. אופציונאלי: לחזור על אותה הפרוצדורה להפחתת מינוני isoflurane צעד חכם עד שכל בעלי החיים יש חזרה רפלקס ליישרם (ראה שלב 6.3).
6. כדי לסיים את הניסוי, כבה את isoflurane ולשטוף את המערכת כולה עם 100% חמצן במשך 15 דקות. זה יעזור כדי למנוע היפוקסיה כעכברים להתאושש לפני שחזרו לכלובים בביתם ויגן על experimenter מכל חשיפת הרדמה.
7. אופציונאלי: אם מספר בעלי החיים או מספר ריכוזי הרדמה מוגבל בשל אילוצי משאבים או זמן, המדרון עשויה היל יש הערכות-במיוחד פרמטר עקומה בכושר הערכת מעריכים, באופן כוזב נמוכה שגיאה. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה צורך לחזור על מדידת רגישות ההרדמה מתואר בשלבים 6.1-6.6 בעד שני ימי ניסיון נוספים להשיג פרמטר של מדרון הגבעה האמיתי והערכת השגיאה המקבילה שלה באופן מלא.

7. להעריך את השינויים לטווח קצר בהרדמת רגישות עם זמן להופעה

1. מניחים כל בעלי חיים לתאי אדם עם 100% חמצן זורם.
2. קבע את ריכוז isoflurane ל.1.2%, אשר תואם את האינדוקציה ED ₉₉ לעכברי C57BL/6J פראי מסוג ^20. לשמור על 30-60 דקות בהתאם למשך הצפוי של פעולה של ההתערבות חריפה.
3. לאשר LORR בכל בעלי החיים על ידי בעדינות מגלגל את כל חדר עד שעכברים מונחים על גבם.
4. כבה את isoflurane וזרימת חמצן 100%. מדוד את הזמן עד שכל חיה חוזר לרפלקס ליישרה. זה מוגדר על ידי מיקום של כל ארבע כפות הרגליים על הרצפה של החדר ואושר על ידי נוכחותם של שלוש בדיקות ברציפות עם רפלקס ליישר ללא פגע.

תוצאות

איור 1 מדגים את התועלת של assay LORR צעד החכם לקביעת השפעות ארוך טווח של התערבות תרופתית. חומצת Ibotenic (רשות השידור) היא אגוניסט של glutamatergic קולטן N-methyl-D-asparate (NMDA) המשמש לעתים קרובות כexcitotoxin לגרום לנגעים עצביים קבועים. כאן אנו הזרקנו 10 NL של 1% בילטרלי רשות השידור לאזור ventrolateral preoptic (VLPO) של עכברי C57BL/6J שבוע לפני הבדיקה. רוב הנוירונים בגרעין זה מפגין שיעורים נמוכים של ירי בערויות ובמיוחד להגביר את פעילותם בזמן השינה שאינה מהירה...

דיון

למרות הערכה של LORR בעכבר אחת היא משימה פשוטה לכאורה, זה בכל זאת חיוני כדי לשמור על תנאים פיסיולוגיים זהים בין נושאים על מנת לאסוף נתונים מהימנים מקבוצה של בעלי חיים. , מנגנון LORR קיבולת גבוהה המוסדר היטב שהוצג כאן מציע דרך לתקנן ניסויים ולמקסם את היעילות. על ידי ביצוע פעולות בעקרונות הבסיסיים של ויסות חום וזרימת חלוקה שווה, מערכת זו ניתן ליצור מחדש בקלות ומותאמת אישית כדי שתתאים לצרכימים 'הנסיינים בודדים. גודל חדר עשוי להיות מדורגת למינים אחרים, כגון חולדות, וחדרים נוספים ני...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם חברת המגיב		מספר קטלוגי	הערות
חמצן	איירגז	OX300
איזופלורן	באטלר שיין		ניתן להחליף כל חומר הרדמה נדיף מעניין
החומר		מספר קטלוג	מספר הערות
מד זרימת מסה- 10 SLPM	אומגה הנדסה	FMA-A2309
מד זרימת מסה- 500 SCCM	Omega Engineering	FMA-A2305
מנתח חומרי הרדמה/מחוון גז	AM Bickford	FI-21 Riken
משאבת מים לחימום	פישר סיינטיפיק	13-874-175
משדרי טמפרטורה	BMDS	IPTT-300
קורא טמפרטורת RF	BMDS	DAS-6007