מאמר שיטה

הפרדה אוטומטית של ג elegans יישבו variably ידי פתוגן חיידקים

DOI:

10.3791/51090

⸱

21 במרץ 2014

 ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wormsorter מאפשר מסכי גנטיים בelegans Caenorhabditis ידי מיון תולעים לפי ביטוי של כתבי ניאון. כאן, אנו מתארים את השימוש חדש: מיון על פי קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא, ואנו מעסיקים אותו כדי לבחון את התפקיד הבין היטב הכרת הפתוגן בייזום תגובה חיסונית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wormsorter הוא מכשיר דומה למכשיר FACS המשמש במחקרים של elegans Caenorhabditis, בדרך כלל כדי למיין תולעים המבוססים על ביטוי של כתב ניאון. כאן, אנו מדגישים את השימוש אלטרנטיבי של מכשיר זה, למיון תולעים על פי מידתם של קולוניזציה על ידי פתוגן-GFP-לבטא. שימוש חדש זה מאפשר לנו להתייחס למערכת היחסים בין קולוניזציה של מעי התולעת והאינדוקציה של תגובה חיסונית. בעוד ג תגובות חיסוניים elegans לפתוגנים שונים תועדו, זה עדיין לא ידוע מה יוזם אותם. שתי האפשרויות העיקריות (שאינן סותרים) הן הכרה הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, וזיהוי של נזק שנגרם על ידי זיהום. כדי להבדיל בין שתי האפשרויות, חשיפה לפתוגן חייבת להיות מנותקת מהנזק שהיא גורמת. ההפרדה אפשר wormsorter של תולעים ש- יישבו בהרחבה על ידי גראם nהפתוגן egative Pseudomonas aeruginosa, עם הניזק, אשר עלול להיגרם על ידי עומס הפתוגן, מתולעים שנחשפו באופן דומה, אבל לא, או שולי, קולוניאלי. אוכלוסיות מובחנות אלה שימשו כדי להעריך את הקשר בין עומס הפתוגן והאינדוקציה של תגובה חיסונית תעתיק. מהתוצאות עולה כי שני הם ניתקו, התומכים באפשרות של הכרת הפתוגן.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיון תולעת אוטומטי הוא הרבה יותר כמו FACS, הפועל על ידי מדידת אות ניאון בתולעת (הניתנת בדרך כלל על ידי ביטוי של חלבונים מהונדסים כתב) כשהוא עובר יישר בצינור, המאפשר ניתוב מחדש או לצינור איסוף / טוב או למכל פסולת על פי לgating פרמטרים שנקבעו על ידי החוקר 1. Wormsorter יכול להקל על מחקר בדרכים רבות; דוגמא להעסקתו ככלי אנליטי היא מחקר שבא בעקבות דפוסי spatiotemporal פעילות אמרגן לכמעט 1,000 גנים 2.
עם זאת, השימוש העיקרי של wormsorter הוא במסכים גנטיים, בעקבות רמות יעד גן הביטוי או לוקליזציה של חלבון פלואורסצנטי לאורך הציר של התולעת 3-5.

כאן, אנו מתארים יישום חדש לwormsorter, בבעקבות הקולוניזציה של התולעת על ידי פתוגן מתויג fluorescently. עם זה ככלי שאנחנו מתמקדים במערכת היחסים בין pathogen קולוניזציה / עומס ואת התגובה החיסונית, כדי לקבל תובנות חדשות על המנגנונים אחראים לייזום של מערכת החיסונית בתולעת.

כמעט בכל היצורים שנחקרו עד כה, ייזום של תגובה חיסונית מולדת לחיידקי גורמי מחלה תלוי בהכרה של דפוסים הקשורים לפתוגן המולקולריים (PAMPs), ו / או דפוסים מולקולריים סכנה / הקשורים לנזק (damps) 6,7. המבנים הראשונים שמורים של חיידקים הכוללים רכיבים של קיר חיידקי התא, השוטון שלו, או bilayer השומנים שלה 6; השני, כוללים שני מולקולות שפורסמו (למשל ה-ATP 8), חלבונים שונים או סמנים אחרים של תהליכים תאיים שינו 9,10. שני סוגי האותות מוכרים על ידי חלבונים המיועדים כקולטניים זיהוי תבניות (PRRs), שעליו ספציפי מחייב של מולקולת דפוס להפעיל את שרשרת האירועים שהובילו לתגובה המגנה. ג elegans כבר מאוד שימושי כמו tractaמודל ble לנתח היבטים שונים של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן, אבל דבר אחד שאינו מובן היטב הוא איך תגובות חיסוניים הם יזמו בתולעת. אף אחד מהקולטנים המשוערת שorthologous לקולטנים זיהוי תבניות (PRRs) באורגניזמים אחרים הוכחו לאגד PAMPs, ורבים מorthologs של PRRs שהם מרכזיים לתגובות חיסוניים באורגניזמים אחרים להראות תרומה מוגבלת באופן מפתיע לתגובות הפתוגן התולעת והתנגדות. לדוגמא, קולט דרוזופילה האגרה, שהוא חיוני להתנגדות פתוגנים גראם חיוביים, מיוצג בג elegans ידי homolog בלעדי, tol-1, אשר תורם להגנה מפני הפתוגן השלילי גרם סלמונלה 11 Typhimurium, אבל לא מגורמי מחלה אחרות שנבדקו גראם שליליות, או חיובית 11,12. תצפיות אלו, בשילוב עם נתונים המצביע על כך תגובה חיסונית יכול להיגרם על ידי שיבוש שעות תרגום חלבונים תאייםכהוביל כמה להציע כי ג elegans מזהה בעיקר damps 9,13,14. עם זאת, דיווחים המתארים את היכולת של פתוגנים מתים כדי לעורר תגובות חיסוניים מראים כי PAMP מחייב ניתן יש תפקיד חשוב בזיהוי הפתוגן בג elegans 15,16. עבודה קודמת מתמקדת בתגובות חיסונית בג הזהה מבחינה גנטית מסונכרן גיל elegans אוכלוסיות, הפגינו השתנות בודדת גדולה בקולוניזציה במעי על ידי פתוגן החיידקים גראם שלילי Pseudomonas aeruginosa.

עם זאת, מחקרי פרופיל תעתיק טופלו אוכלוסיות variably-יישבו אלה כישות אחת 17,18. ניצול של השונות הזאת, פיתחנו פרוטוקול תוך התמקדות wormsorter אוטומטי להפריד אוכלוסיות יישבו באופן דיפרנציאלי של elegans Caenorhabditis נחשף לפ-GFP-לבטא aeruginosa. בדיקת ביטוי גנים באוכלוסיות שונה, יישבו faciהערכת litated של הקשר בין עומס הפתוגן (והנזק קשור) ואת התגובה חיסונית ותובנות חדשות הניתנות על הכרת הפתוגן בג elegans 19. להלן נתאר את הפרוטוקול, אשר יכול להיות מיושם כדי למיין תולעים נגועים בפתוגן כל שכותרתו fluorescently.

למשתמשים פוטנציאליים יש לציין כי מספר התולעים נדרשו להיות מיינו תלוי באופי של הניתוחים שלאחר מכן ופרוטוקולים שבשימוש. לדוגמא, במקרה של ניתוח ביטוי גני microarray,> 1,000 תולעים יידרשו להשיג מספיק RNA, אם פרוטוקולים סטנדרטיים משמשים, אבל ~ 100 תולעים יספיקו אם הגברה היא מועסקות, המאפשרים איסוף מהיר של חומר ובכך למזער את הלחץ על התולעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קבלת תרבות מסונכרן של בעלי חיים למבוגרים צעירים

  1. לגדול תולעים בכמה צלחות NGM seeded עם OP50-1 E. חיידקי קולי (10x מרוכז מתרבות רוויה) עד תולעים רבים הגיעו לשלב הרה.
  2. טיפול בבעלים חיים הרה להולדת עם פתרון ביצת הכנה כדי לקבל תרבות מסונכרנת (ביצים).
  3. ביצי צלחת על כמה צלחות NGM 60 מ"מ זרע עם 10x OP50-1 מרוכז בצפיפות של כ 150-200 ביצים / צלחת.
  4. דגירה צלחות על 25 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים (עד תולעים הגיעו L4 - במה למבוגרים צעירה).

2. הכנת צלחות aeruginosa Pseudomonas ומדביק את התולעים

  1. ביום של ביצת ההכנה (שלב 1.1) לחסן תרבות PA14 :: ה-GFP לתוך 2 מיליליטר של ריפאמפיצין מדיה המכילה B של המלך בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם התסיסה O / נ
  2. פלייט הרחוב ללא PA14 :: ה-GFPture על כמה שיותר צלחות איטית הריגה (SKP) לפי צורך עבור assay. על כל צלחת פיפטה 150 מ"מ SKP פטרי 75-100 μl של תרבות רוויה ולהתפשט באופן שווה באמצעות מפזר זכוכית סטרילית. דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20-24 שעות.
  3. הסר את הצלחות מן החממה ולאפשר להם להתקרר לRT (~ 20 דקות). באמצעות חיץ M9, לשטוף תולעים משלב 1.4 על PA14 :: לוחות GFP בנפח מינימאלי של נוזלים. בעת שימוש ב150 צלחות מ"מ, יכולים להיות ממוקמים כמה מאה תולעים בצלחת אחת.
  4. דגירה צלחות על 25 מעלות צלזיוס למשך 18-21 שעות. לפ תולעים צעירים מבוגרים חשופים aeruginosa, זה חלון הזמן בו מוצגות החלוקה האופטימלית של קולוניות לעומת חיות noncolonized.

3. הגדרת Wormsorter

לפני ביצוע סוג המדגם, להבטיח כי המכשיר פועל כהלכה. פרטים ניתן לקבל בhttp://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, והדואר צעדים חיוניים המפורטות להלן.

  1. הגדר את לחץ שסתום נדן לכ -5 psi (4.5-5.5 טווח).
  2. כדי לוודא שקצב זרימת נוזל הנדן מתאים, למקם את צינור חרוטי 15 מיליליטר מתחת למתקן, להפעיל את שסתום הנדן, ולכבות את שסתום סדרן. החזק את הצינור מתחת למתקן ל60 שניות. הנפח בצינור צריך להיות 9-10 מיליליטר. אם זה מחוץ לטווח זה, התאם את לחץ שסתום נדן בהתאם.
  3. כדי להבטיח שקצב זרימת נוזל נדן (כפי שנקבע בשלב 3.2) יאפשר מיון מדויק, לבחון את שיעור מין באמצעות 40 חלקיקי מיקרומטר שליטה:
  4. כבה את שסתום הנדן. הוסף על 25 מיליליטר של תמיסת חלקיקי שליטה למאגר.
  5. הפעל את שסתום הנדן, ואת שסתום המדגם.
  6. בתוכנת המחשב, נווט אל "מצב חלקיק השליטה" ולחץ על רכישה.
  7. ודא את זרימת חלקיקי השיעור הוא ~ 5-8 חלקיקים / sec, עם TOF (שעת טיסה) שלהן דומים לרוחבשל החלקיקים, 40 מיקרומטר. כגון TOF מציין כי רק אובייקט 40 מיקרומטר אחת עובר דרך בכל פעם. אם ערכים נמצאים מחוץ לטווח זה, התאם את הגדרות (להלן כיוונים לעיל) בהתאם.

4. מיון יישב לעומת התולעים Noncolonized

  1. באמצעות M9, לשטוף תולעים לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל. לאפשר תולעים בוגרות לשקוע לחלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה ולהסיר את supernatant. מלא את הצינור עם M9 הטרי. חזור על תהליך זה 3-4x. זה מסיר חלק גדול מזחלים, כמו גם חיידקים עודפים ולוקח בערך 10 דקות.
  2. להוסיף תולעים למאגר wormsorter עם בר ומערבב קטן בעדינות ללישת.
  3. התאם רווח אות ראשוני על ידי הגדרה הירוקה PMT 600 והאדומים וצהוב PMT 200.
  4. בגין רכישת נתונים כדי להתאים את ההגדרות.
  5. לשאוף לשיעור סוג של 25-30 אירועים (תולעים) לשנייה. אם שיעור המספר גבוה מדי, לדלל את התולעים במאגר עם M9 בהתאם. אם השיעור הואo נמוכה, להוסיף עוד תולעים בנפח קטן של M9.
  6. אם הניסוי דורש הפרדה מחמירה מאוד של קולוניות לעומת תולעי noncolonized, להגדיר את "בדיקת צירוף מקרים" ל" טהורה ". הדבר מבטיח כי במקרה שני עצמים מתרחשים קרובים מדי זה לזה או באותו הירידה, המכונה דוחה את הירידה ולא לאסוף אותו.
  7. כדי למיין את האוכלוסייה של עניין, לצייר שערים סביב הצירים המציינים גודל (להשיג תולעים בוגרות) ועוצמת הקרינה (כלומר גבוהה לקולוניזציה, נמוכה לnoncolonized). הערכים עבור gating הקרינה צריכים להיקבע באופן אמפירי.
  8. מניחים צלחת רב גם או צלחת פטרי מתחת למתקן לאיסוף תולעים לאחר מכן פתח את השסתום מהסוג להתחיל מיון תולעים.
  9. אסוף אוכלוסייה קטנה של בעלי חיים כדי לוודא תחת המיקרוסקופ שהאוכלוסייה מסודרים היא האוכלוסייה של עניין. אם לא, להתאים את הפרמטרים gating בהתאם, ולהמשיך באיסוף דגימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג כאשר מתאימים בגיל, זהה מבחינה גנטית elegans נחשפים לפ aeruginosa, הפצה רחבה הוא ציין ברמות (איור 1 א) קולוניזציה. בעזרתו של הפרוטוקול המתואר כאן הפרדה יעילה של noncolonized מתולעים יישבו יכולה להיות מושגת (איור 1). שלא כמו תולעי noncolonized, תולעים יישבו להראות סימנים של נזק, כגון זחילה והפרשת צואה מופחתת 19. האחרון עשוי להיות סיבה לכך שתולעים יישבו על ידי פ יש לי aeruginosa קושי ניקוי זיה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה שאנו מתארים מנצלת ניאון תיוג של גופים מחוץ לתולעת, לעקוב אחרי יחסי גומלין בין התולעת וסביבתו. במקרה שאנו מציגים, הפרדה הייתה מבוססת על תיוג של הפתוגן והועסקה לתולעים נפרדים עם עומס הפתוגן כבד מאלה שאין לי (או אור) עומס. ניתוח ביטוי גנים לאחר לא מצא הבדל בתגובה חיסונית בין שתי הקבוצות שמראות כי הם היו תלויים בעומס הפתוגן. האות שיוזמת את התגובה הראתה במקום אחר להיות קשורים פיזי עם החיידקים, במקום להיות מופרש, מה שמרמז שאות זו עשויה להיות PAMP. יחד, תוצאות אלו תומכות בהשערה כי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים הרפואית אליסון הקרן על תמיכתם. אנו מאחלים גם להודות לחברי המעבדה אבי Dernburg לקבלת סיוע בשימוש בwormsorter.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
M9 Bufferמוכן בביתמתכון ב
wormbook.org RifampicinSigmaR3501
תמיסת הכנת ביציםשהוכנה בבית50 מ"ל מים; 40 מ"ל אקונומיקה; 10 מ"ל של 10 N נתרן הידרוקסיד
צלחות NGMשהוכנו בביתמתכון ב wormbook.org
צלחות SKPשהוכנו בביתמתכון זהה ל- NGM רק 0.35% פפטון במקום 0.25%
חלקיקי בדיקת בקרהיוניון ביומטריקה310-5071-001

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
  2. Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans. Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).
  3. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans. J. Vis. Exp. (60), (2012).
  4. Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans. Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).
  5. Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).
  7. Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).
  8. Mariathasan, S., et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
  9. Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149, 452-466 (2012).
  10. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  11. Tenor, J. L., Aballay, A. A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity. EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).
  12. Pujol, N., et al. A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).
  13. McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans. Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).
  14. Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling. Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).
  15. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, (2010).
  16. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. , (2011).
  17. Shapira, M., et al. A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).
  18. Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. , 183 (2006).
  19. Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans. PLoS One. , 7 (2012).
  20. Jakobsen, H., et al. The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response. PLoS One. 8, (2013).
  21. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiol. 12, 49 (2012).
  22. Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).
  23. Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Pseudomonas aeruginosaNGMGFP

מאמרים קשורים