מאמר שיטה

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

18.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51105

⸱

17 בדצמבר 2013

 ,  , 
1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר בדיקת ציטוטוקסיות רגישה מבוססת תאים. על ידי ספירת הירידה בתדירות של תאי CD4+ T מטרה חיים בנוכחות מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T אפקטיביים, בדיקה זו מאפשרת הערכה ישירה של הפעילות הציטוליטית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.

תקציר

פעילות ציטוליטית של תאי CD8+ T מוערכת לעתים רחוקות. אנו מתארים כאן בדיקה חדשה מבוססת תאים למדידת היכולת של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן להרוג תאי CD4+ T טעונים בפפטיד הקוגנטי שלהם. תאי יעד CD4+ T מחולקים לשתי אוכלוסיות, המסומנות בשני ריכוזים שונים של CFSE. אוכלוסייה אחת פועמת עם הפפטיד המעניין (CFSE-low) ואילו השנייה נשארת לא פועמת (CFSE-high). תאי CD4+ T פועמים ולא פועמים מעורבבים ביחס שווה ומודגרים עם מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T מטוהרים. ההרג הספציפי של תאי CD4+ T יעד אוטולוגיים מנותח על ידי ציטומטריית זרימה לאחר קוקולטורציה עם תאי CD8+ T המכילים את תאי CD8+ T הספציפיים לאנטיגן שזוהו על ידי צביעת פפטיד/MHCI טטרמר. הליזה הספציפית של תאי CD4+ T מטרה הנמדדת ביחסי אפקטור שונים לעומת מטרה, מאפשרת חישוב של יחידות ליטיות, LU30/106 תאים. בדיקה פשוטה וישירה זו מאפשרת מדידה מדויקת של היכולת הפנימית של תאי CD8+ T להרוג תאי CD4+ T מטרה.

מבוא

פעילות ציטוליטית היא הפונקציה העיקרית של תאי CD8+ T אך עדיין נמדדת לעתים רחוקות מכיוון שבדיקות המשמשות למטרה זו מסורבלות וקשה לתקן. למדידה מדויקת של פונקציה זו יש חשיבות עליונה בעת אפיון פונקציות אפקטור של תאי CD8+ T, מכיוון שעדיין לא תוארו מנבאים אמינים של ציטוטוקסיות יעילה בתיווך תאים1,2. כאן, אנו מציעים בדיקה פונקציונלית חדשה למדידת הפעילות הציטוטוקסית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתאי CD4+ T מטרה. פותחו מספר גישות כדי לספק חלופות לתקן הזהב, בדיקת שחרור כרום. אנו מציגים כאן בדיקה מבוססת תאים החושפת את כל תהליך ההרג כאשר היא מודדת את מותם של תאי מטרה חיים. שיטה זו נגזרה מפרוטוקולים של בדיקות ציטוטוקסיות מבוססות זרימה ציטומטרית in vivo בעכברים4,5 ובמבחנה בבני אדם6. בפרוטוקול זה, תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הכלולים באוכלוסיית תאי CD8+ T הכוללת משמשים כתאי אפקטור ותאי CD4+ T אוטולוגיים משמשים כתאי מטרה. תאי אפקטור CD8+ T מעניינים נספרים באמצעות טטרמרים MHCI/פפטיד7. מוות של תאי מטרה מחושב על ידי היחס בין תאי CD4+ T טעונים/לא טעונים בפפטיד. הראינו בעבר ששיטה זו הייתה ניתנת לשחזור, רגישה, ספציפית ולא הייתה תלויה במספר תאי האפקטור בתוך אוכלוסיית תאי CD8+ T הכוללת8. על ידי ספירת מספר תאי האפקטור ותאי המטרה בבדיקת הקוקולטורה, ניתן לחשב ולבטא את היכולת הפנימית של תאי CD8+ T להרוג תאי מטרה ביחידות ליטיות9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תאי T CD8+ אפקטור

  1. הפשירו PBMCs אוטולוגיים משומרים בהקפאה (2-3 בקבוקונים של 50 x 106 תאים) על ידי העברת הקריוביאל מחנקן נוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. שטפו את התאים על ידי מילוי השפופרת ל-50 מ"ל עם RPMI מלא (4 מ"מ L-גלוטמין, ו-100 U/ml פניצילין וסטרפטומיצין, בתוספת 10% FBS). ספור PBMCs והשהה מחדש תאים בריכוז של 5 x 106/ml ב-RPMI מלא.
  3. הוסף פפטיד ספציפי (5 מיקרוגרם/מ"ל) ו-IL-2 (10 ננוגרם/מ"ל) ל-PBMCs.
  4. הגדר תרבית בצלחת באר עמוקה 96; זרע 1 מ"ל של תרחיף תאים לכל באר.
  5. לאחר 3 ימי תרבית, החלף מחצית ממדיום תרבית התאים ב- RPMI שלם טרי.
  6. לאחר 6 ימי תרבית, אספו את כל ה-PBMCs עם פיפטה רב-ערוצית והעבירו תאים במאגר סטרילי.
  7. ספרו, שטפו והשעו מחדש PBMCs ב-5 x 107/ml במאגר ההפרדה המומלץ בצינורות תחתונים עגולים של 14 מ"ל. הוסף קוקטייל העשרת תאי CD8+ T אנושיים בתאים של 50 מיקרוליטר/מ"ל. מערבבים ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מוסיפים חלקיקים מגנטיים ב-150 מיקרוליטר / מ"ל ודוגרים למשך 5 דקות.
  8. הביאו את תרחיף התאים עד 7 מ"ל על ידי הוספת מאגר ההפרדה. המשך לבידוד אימונומגנטי של תא CD8+ T שלא נגע בו על ידי הכנסת הצינור למגנט. לאחר 5 דקות, כשהצינור עדיין במגנט, שפכו את התאים המעניינים לתוך צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. קח מנה קטנה וצבוע את התאים בנוגדנים נגד CD3 ו-CD8 ב-1X PBS-2% FBS למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ניתן למדוד את הטוהר של תאי CD8+ T באמצעות ציטומטריית זרימה עם טוהר צפוי של 95% ומעלה.
  9. השעו מחדש תאי CD8+ T ב-450 מיקרוליטר עם RPMI מלא.
  10. הוסף 225 מיקרוליטר של RPMI שלם ל-5 צינורות מכסה בורג.
  11. הכן דילולים סדרתיים (מ-1:2 עד 1:32) על ידי העברת 225 מיקרוליטר של CD8+ לצינור הבא (ראה איור 1 פאנל עליון).

2. הכנת תאי CD4+ T מטרה

  1. הפשירו PBMCs אוטולוגיים משומרים בהקפאה (בקבוקון אחד של 50 x 106 תאים) על ידי העברת הקריוביאל מחנקן נוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל RPMI.
  3. שטפו תאים והשעו PBMCs ב-5 x 107/ml עם מאגר הפרדה בצינורות תחתונים עגולים של 14 מ"ל. הוסף קוקטייל העשרת תאי CD4+ T אנושי בתאים של 50 מיקרוליטר/מ"ל. מערבבים ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הוסף חלקיקים מגנטיים ב-100 מיקרוליטר/מ"ל ודגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הביאו את תרחיף התאים עד 7 מ"ל על ידי הוספת מאגר הפרדה. המשך לבידוד של תאי CD4+ T על ידי הכנסת הצינור למגנט. לאחר 5 דקות, כשהצינור עדיין בתוך המגנט, שפכו את התאים הרצויים לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל. קח מנה קטנה וצבוע את התאים בנוגדנים נגד CD3 ו-CD4 ב-1x PBS-2% FBS למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ניתן למדוד את הטוהר של תאי CD4+ T באמצעות ציטומטריית זרימה עם טוהר צפוי של 95% ומעלה.
  5. ספרו תאי CD4+ T, פצלו אותם לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל ושטפו ב-PBS חם 1x.
  6. הכן תמיסת עבודה בגובה CFSE של 0.4 מיקרומטר ב-PBS חם.
  7. הכן פתרון עבודה נמוך CFSE של 0.04 מיקרומטר על ידי דילול חלק מתמיסת העבודה הגבוהה CFSE פי 10 ב-PBS חם.
  8. השעו מחדש תאים ב-20 x 106/ml של PBS (אם מספר תאי CD4+ T קטן מ-10 x 10,6/ml השעו מחדש תאים ב-0.5 מ"ל של PBS) וצבעו מחצית מתאי CD4+ T על ידי הוספת נפח שווה אחד של תמיסת עבודה גבוהה CFSE של 0.4 מיקרומטר (ריכוז סופי 0.2 מיקרומטר). לדוגמא, עבור 1 מ"ל תאים, הוסף 1 מ"ל מתמיסת העבודה CFSE. צבעו את המחצית הנותרת של ה-CD4+ על ידי הוספת נפח שווה אחד של 0.04 μM תמיסת עבודה נמוכה CFSE (ריכוז סופי 0.02 מיקרומטר). תאי כתמים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2.
  9. לאחר הדגירה, תאי גלולה ב-1,500 סל"ד למשך 5 דקות והשעיה מחדש ב-1 מ"ל של RPMI מלא חם כדי להרוות את תגובת התיוג.
  10. דופק תאי CD4+ T נמוכים ב-CFSE על ידי הוספת הפפטיד המעניין בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל ב-RPMI השלם ודגירה למשך 45 דקות באטמוספירה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
  11. שטפו תאי CD4+ T גבוהים ו-CFSE נמוכים ב-RPMI מלא. חזור על הפעולה בסך הכל שתי כביסות. השעו מחדש בריכוז של 2 x 105 תאים/מ"ל כל אחד ב-RPMI מלא.
  12. ערבבו את שתי אוכלוסיות היעד ביחס של 1:1 (CFSE-High:CFSE-Low) (ראו איור 1 בפאנל התחתון).

3. קוקולטורה

  1. מכל דילול של תאי CD8+ T, זרע 100 מיקרוליטר בשכפול לצלחת 96 בארות תחתונה עגולה.
  2. הוסף את תאי המטרה המעורבים CD4+ T (100 מיקרוליטר) לכל דילול של תאי אפקטור לנפח סופי של 200 מיקרוליטר.
  3. כדי למדוד את האפופטוזיס הבסיסי, זרע 3 בארות עם תאי מטרה בלבד.
  4. דגירה של קוקולטורה למשך 6 שעות באטמוספירה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

4. צביעה ורכישה של ציטומטריית זרימה

  1. העבירו תאים לצלחת 96 בארות עם תחתית V וצבעו עם טטרמרים pMHC מצומדים PE למשך 15 דקות באטמוספירה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. שטפו ב-1x PBS-2% FBS ותאי כתמים עם תא מת הניתן לתיקון Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.
  3. שטפו תאים פעם אחת עם 1x PBS-2% FBS והשעו מחדש ב-100 מיקרוליטר עם 2% פורמלדהיד ב-1x PBS.
  4. לרכוש תאים על ציטומטר זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הסכמה ב-איור 1 מסכמת את הבדיקה. תאי CD8+ T מטוהרים (תאי אפקטור) הושעו מחדש ב-450 µl של RPMI מלא, וביצעו דילולים סדרתיים על ידי הוספת 225 µl של תאי CD8+ T לשפופרת הבאה המכילה 225 µl של מדיום (פאנל עליון). תאי CD4+ T מטוהרים (תאי מטרה) נספרו, פולחו לשתי שפופרות ונצבעו בשני ריכוזים שונים של CFSE (גבוה ונמוך) כפי שמתואר בפרוטוקול. תאי CFSE-low CD4+ T עברו פולסציה עם הפפטיד הרלוונטי, ותאי CFSE-high CD4+ T נותרו ללא טעינה כביקורת. תאי CFSE-high ו-CSFE-low CD4+ T הושעו מחדש בריכוז של 2 x 105/ml ועורב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הבדיקה המתוארת כאן מאפשרת לכמת את הפונקציה העיקרית של תאי CD8+ T: הפעילות הציטוליטית. למדידה המדויקת של פונקציה זו יש חשיבות עליונה בעת אפיון פונקציות האפקטור של תאי CD8+ T, שכן מחקרים קודמים דיווחו על חוסר התאמה בין פונקציה זו לבין הפרשת הציטוקינים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן10,11. בשל זמן הדגירה הקצר של קוקולטורה (6 שעות) והשימוש בתאי מטרה אוטולוגיים, יש שיעור נמוך של הרג לא ספציפי של תאי מטרה. לכן בדיקה זו היא ספציפית ואמינה ביותר. ניתן גם לשנות את הבדיקה הזו בקלות כדי לנתח תת-קבוצות תאים שונות. ניתן להח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי משרד התיירות, המסחר והפיתוח הכלכלי של פלורידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת העשרת תאי EasySep אנושיים CD4+ Tתאי גזע תאי גזע19052
EasySep Human CD8+ T ערכת העשרת תאיגזע19053
ערכת התפשטות תאים CellTrace CFSE - לזרימה ציטומטריהInvitrogenC34554
אדום רחוק חי / מת תא מת לתיקוןInvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 עכבר אנטי אנושי CD3BD
מבריק סגול 650 אנטי אנושי CD4 נוגדןBiolegend317435
PerCP אנטי אנושי CD8 נוגדןBiolegend344707
RPMI 1640 בינוני 1xVWR10-040-CV
פניצילין-סטרפטומיצין 100x תמיסתInvitrogen15070063
סרום בקר עוברי - זהב, PAA מושבת בחוםA15-252
צלחות 96 בארות; מטופלים; תחתית U; עם מכסהBD Falcon353077
25 מ"ל פוליסטירן סטרילי, מאגרים עטופים בנפרדUSA Scientific2321-2230
96 בארות U-bottom, סטריליות 2 מ"ל צלחות באר עמוקותThermo Scientific275743
Human IL-2 (v126), דרגת מחקרMiltenyi Biotec130-093-096
RoboSep Buffer, מאגר הפרדהתאיגזע20104
15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילןBD פלקון352097
14 מ"ל צינור תחתון עגול, פוליפרופילןBD פלקון352059
תא גזע מגנט מגנט גדולקל 18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96-well; צלחת תחתונה V עם מכסהפישר12-565-481
תמיסת פורמלדהיד, מגיב ACS, 37 wt % ב-H2OSigma-Aldrich252549-500ML
1.5 מ"ל מיקרו-צינור מכסה בורג, חרוטיSarstedt72.692.005
557943

מקורות

  1. Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).
  2. Betts, M. R., Harari, A. Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV. Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).
  3. Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284, 553-555 (1980).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J. Immunol. 171, 27-31 (2003).
  5. Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 171, 17-21 (2003).
  6. Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).
  7. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  8. Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells. J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).
  9. Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).
  10. Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
  11. Trautmann, L., et al. Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection. Blood. 120, 3466-3477 (2012).
  12. Hildemann, S. K., et al. High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells. PLoS One. 8, (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T CD8MHCCFSE

מאמרים קשורים