בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

סיכום

פרוטוקול זה מתאר בדיקת ציטוטוקסיות רגישה מבוססת תאים. על ידי ספירת הירידה בתדירות של תאי CD4+ T מטרה חיים בנוכחות מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T אפקטיביים, בדיקה זו מאפשרת הערכה ישירה של הפעילות הציטוליטית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.

תקציר

פעילות ציטוליטית של תאי CD8+ T מוערכת לעתים רחוקות. אנו מתארים כאן בדיקה חדשה מבוססת תאים למדידת היכולת של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן להרוג תאי CD4+ T טעונים בפפטיד הקוגנטי שלהם. תאי יעד CD4+ T מחולקים לשתי אוכלוסיות, המסומנות בשני ריכוזים שונים של CFSE. אוכלוסייה אחת פועמת עם הפפטיד המעניין (CFSE-low) ואילו השנייה נשארת לא פועמת (CFSE-high). תאי CD4+ T פועמים ולא פועמים מעורבבים ביחס שווה ומודגרים עם מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T מטוהרים. ההרג הספציפי של תאי CD4+ T יעד אוטולוגיים מנותח על ידי ציטומטריית זרימה לאחר קוקולטורציה עם תאי CD8+ T המכילים את תאי CD8+ T הספציפיים לאנטיגן שזוהו על ידי צביעת פפטיד/MHCI טטרמר. הליזה הספציפית של תאי CD4+ T מטרה הנמדדת ביחסי אפקטור שונים לעומת מטרה, מאפשרת חישוב של יחידות ליטיות, LU₃₀/10⁶ תאים. בדיקה פשוטה וישירה זו מאפשרת מדידה מדויקת של היכולת הפנימית של תאי CD8+ T להרוג תאי CD4+ T מטרה.

מבוא

פעילות ציטוליטית היא הפונקציה העיקרית של תאי CD8+ T אך עדיין נמדדת לעתים רחוקות מכיוון שבדיקות המשמשות למטרה זו מסורבלות וקשה לתקן. למדידה מדויקת של פונקציה זו יש חשיבות עליונה בעת אפיון פונקציות אפקטור של תאי CD8+ T, מכיוון שעדיין לא תוארו מנבאים אמינים של ציטוטוקסיות יעילה בתיווך תאים^1,2. כאן, אנו מציעים בדיקה פונקציונלית חדשה למדידת הפעילות הציטוטוקסית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתאי CD4+ T מטרה. פותחו מספר גישות כדי לספק חלופות לתקן הזהב, בדיקת שחרור כרום. אנו מציגים כאן בדיקה מבוססת תאים החושפת את כל תהליך ההרג כאשר היא מודדת את מותם של תאי מטרה חיים. שיטה זו נגזרה מפרוטוקולים של בדיקות ציטוטוקסיות מבוססות זרימה ציטומטרית in vivo בעכברים

פרוטוקול

1. הכנת תאי T CD8+ אפקטור

1. הפשירו PBMCs אוטולוגיים משומרים בהקפאה (2-3 בקבוקונים של 50 x 10⁶ תאים) על ידי העברת הקריוביאל מחנקן נוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
2. שטפו את התאים על ידי מילוי השפופרת ל-50 מ"ל עם RPMI מלא (4 מ"מ L-גלוטמין, ו-100 U/ml פניצילין וסטרפטומיצין, בתוספת 10% FBS). ספור PBMCs והשהה מחדש תאים בריכוז של 5 x 10⁶/ml ב-RPMI מלא.
3. הוסף פפטיד ספציפי (5 מיקרוגרם/מ"ל) ו-IL-2 (10 ננוגרם/מ"ל) ל-PBMCs.
4. הגדר תרבית בצלחת באר עמוקה 96; זרע 1 מ"ל של תרחיף תאים לכל באר.
5. לאחר 3 ימי תרבית, החלף מחצית ממדיום תרבית התאים ב- RPMI שלם טרי.
6. לאחר 6 ימי תרבית, אספו את כל ה-PBMCs עם פיפטה רב....

תוצאות

הסכמה ב-איור 1 מסכמת את הבדיקה. תאי CD8+ T מטוהרים (תאי אפקטור) הושעו מחדש ב-450 µl של RPMI מלא, וביצעו דילולים סדרתיים על ידי הוספת 225 µl של תאי CD8+ T לשפופרת הבאה המכילה 225 µl של מדיום (פאנל עליון). תאי CD4+ T מטוהרים (תאי מטרה) נספרו, פולחו לשתי שפופרות ונצבעו בשני ריכוזים שונים של CFSE (גבוה ונמוך) כפי שמתואר בפרוטוקול. תאי CFSE-low CD4+ T עברו פולסציה עם הפפטיד הרלוונטי, ותאי CFSE-high CD4+ T נותרו ללא טעינה כביקורת. תאי CFSE-high ו-CSFE-low CD4+ T הושעו מחדש בריכוז של 2 x 10⁵/ml ועורב.......

דיון

הבדיקה המתוארת כאן מאפשרת לכמת את הפונקציה העיקרית של תאי CD8+ T: הפעילות הציטוליטית. למדידה המדויקת של פונקציה זו יש חשיבות עליונה בעת אפיון פונקציות האפקטור של תאי CD8+ T, שכן מחקרים קודמים דיווחו על חוסר התאמה בין פונקציה זו לבין הפרשת הציטוקינים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן^10,11. בשל זמן הדגירה הקצר של קוקולטורה (6 שעות) והשימוש בתאי מטרה אוטולוגיים, יש שיעור נמוך של הרג לא ספציפי של תאי מטרה. לכן בדיקה זו היא ספציפית ואמינה ביותר. ניתן גם לשנות את הבדיקה הזו בקלות כדי לנתח תת-קבוצות תאים שונות. ניתן להח.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת העשרת תאי EasySep אנושיים CD4+ T	תאי גזע תאי גזע	19052
EasySep Human CD8+ T ערכת העשרת תאי	גזע	19053
ערכת התפשטות תאים CellTrace CFSE - לזרימה ציטומטריה	Invitrogen	C34554
אדום רחוק חי / מת תא מת לתיקון	Invitrogen	L10120
Alexa Fluor 700 עכבר אנטי אנושי CD3	BD
מבריק סגול 650 אנטי אנושי CD4 נוגדן	Biolegend	317435
PerCP אנטי אנושי CD8 נוגדן	Biolegend	344707
RPMI 1640 בינוני 1x	VWR	10-040-CV
פניצילין-סטרפטומיצין 100x תמיסת	Invitrogen	15070063
סרום בקר עוברי - זהב, PAA מושבת בחום		A15-252
צלחות 96 בארות; מטופלים; תחתית U; עם מכסה	BD Falcon	353077
25 מ"ל פוליסטירן סטרילי, מאגרים עטופים בנפרד	USA Scientific	2321-2230
96 בארות U-bottom, סטריליות 2 מ"ל צלחות באר עמוקות	Thermo Scientific	275743
Human IL-2 (v126), דרגת מחקר	Miltenyi Biotec	130-093-096
RoboSep Buffer, מאגר הפרדה	תאי	גזע20104
15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן	BD פלקון	352097
14 מ"ל צינור תחתון עגול, פוליפרופילן	BD פלקון	352059
תא גזע מגנט מגנט גדול		קל 18001
PBS 1x	VWR	21-040-CV
96-well; צלחת תחתונה V עם מכסה	פישר	12-565-481
תמיסת פורמלדהיד, מגיב ACS, 37 wt % ב-H2O	Sigma-Aldrich	252549-500ML
1.5 מ"ל מיקרו-צינור מכסה בורג, חרוטי	Sarstedt	72.692.005

557943