מדידות מיקרוסקופ וידאו תוך-חיוני של זרימת הדם ברשתית בעכברים

סיכום

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה תוך-חיונית בבעלי חיים כדי להמחיש ולמדוד את קוטר כלי הדם ברשתית, מהירויות זרם הדם וזרימת הדם הכוללת ברשתית.

תקציר

שינויים בזרימת הדם ברשתית יכולים לתרום או להיות תוצאה של מחלות עיניים ותפקוד לקוי של הראייה. לכן, כימות של זלוף שונה יכול לסייע במחקר על המנגנונים של פתולוגיות רשתית. ניתן להשתמש במיקרוסקופ וידאו תוך-חיוני של עוקבים פלואורסצנטיים למדידת קוטר כלי הדם ומהירויות זרם הדם של כלי הדם ברשתית, במיוחד העורקים המסתעפים מעורק הרשתית המרכזי ושל הוורידים המובילים לווריד הרשתית המרכזי. ניתן לחשב את קצב זרימת הדם מהקטרים והמהירויות, עם סיכום זרימת העורקים, וזרימה ורידית בנפרד, המספקים ערכים של זרימת הדם הכוללת ברשתית. מאמר זה והסרטון הנלווה מתארים את השיטות ליישום טכניקה זו על עכברים, הכוללות 1) הכנת העין למיקרוסקופיה תוך-חיונית של החיה המורדמת, 2) עירוי תוך ורידי של מיקרוספירות פלואורסצנטיות למדידת מהירות זרם הדם, 3) עירוי תוך ורידי של דקסטרן פלואורסצנטי במשקל מולקולרי גבוה, כדי לסייע בהדמיה מיקרוסקופית של כלי הדם ברשתית, 4) שימוש במצלמת מיקרוסקופ דיגיטלית להשגת סרטונים של הרשתית המוחדרת, ו-5) שימוש בתוכנת עיבוד תמונה לניתוח הווידאו. ניתן להשתמש באותן טכניקות למדידת קצב זרימת הדם ברשתית בחולדות.

מבוא

הרשתית היא אחת הרקמות הפעילות ביותר מבחינה מטבולית בגוף, ולכן דורשת אספקת דם נדיבה. שני מחזורים נפרדים עונים על דרישה זו: זרימת הדם הכורואידית לחלק החיצוני של הרשתית, ומחזור הרשתית לחלק הפנימי של הרשתית. חקירות של זלוף רשתית הן הכרחיות להבנת המנגנונים הפתולוגיים וההשלכות של רטינופתיה סוכרתית, רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן, חסימת עורק הרשתית או הוורידים ושבץ מוחי. נעשה שימוש במספר שיטות כדי לכמת את זרימת הדם ברשתית, כאשר לכל טכניקה יש את היתרונות, החסרונות, המגבלות וההנחות שלה. בין הטכניקות הללו ניתן למנות עירוי של מיקרוספירות בקוטר 7-8 מיקרומטר השוכנות בעורקים קדם-נימיים^1,2, אוטורדיוגרפיה כמותית^3,4, מיקרואנגיופתיה אופטית-טומוגרפיה קוהרנטית אופטית^5,6, הדמיית תהודה מגנטית^7,8 ומיקרוסקופ וידאו^{תוך-חיוני 9-16}. היתרונות של האחרונים כוללים הדמיה חיה ישירה של כלי הרשתית והזרימה, תלות בכמה הנחות קטנות בלבד, ובמחיר סביר למעבדות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מצלמת וידאו מחוברת. במחקרים קודמים של מיקרוסקופ וידאו^{תוך-חיוני 9-16}, דקסטרן פלואורסצנטי שימש כסמן פלזמה, ותאי דם אדומים עם תווית פלואורסצנטית (מבעל חיים תורם) שימשו כסמני מהירות. בפרוטוקול הנוכחי, מיקרוספירות בקוטר 1.9 מיקרומטר המסומנות פלואורסצנטיות, במקום כדוריות דם אדומות, משמשות למדידת מהירות, כאשר שינוי זה שולל את הצורך בתורם תאי דם.

פרוטוקול

הנהלים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של LSUHSC-S ובוצעו על פי הקריטריונים שהותוו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות.

1. הכנת תמיסות זלוף

1. סוניקאט תמיסת מלאי של 1% (לפי משקל) של מיקרוספירות בקוטר 1.9 מיקרומטר.
2. משוך ~25-30 x 10⁶ מיקרוספירות פלואורסצנטיות ירוקות (כלומר, ~10 מיקרוליטר מתמיסת המלאי) למזרק של 300 מיקרוליטר. לדלל את המיקרוספירות על ידי משיכת 240 מיקרוליטר נוספים של מי מלח לתוך המזרק.
3. הכינו תמיסה של 50 מיקרוליטר של דקסטרן פלואורסצנטי במשקל מולקולרי 2 x 10⁶ מומס במי מלח סטריליים, כאשר המינון המוזרק הוא בטווח של 3-10 מ"ג/ק"ג. שמור את הדקסטרן מכוסה בנייר אלומיניום עד לזמן העירוי שלו.

2. הרדמה של בעלי חיים וקנולציה של כלי דם

1. להרדים את בעל החיים להחדרה כירורגית של צינוריות כלי דם ולמיקום נייח תחת מטרה מיקרוסקופית. קיימות אפשרויות רבות של פרוטוקולי הרדמה, עם יתרונות וחסרונות שונים, והשפעות פוטנציאליות על פרמטרים מערכתיים. בין האפשרויות הרבות והשונות ניתן למנות שילוב של קטמין (100-150 מ"ג/ק"ג), קסילזין (10 מ"ג/ק"ג) ואצפרומזין (2 מ"ג/ק"ג), או שילוב של קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ופנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג). ההליכים המתוארים הם אקוטיים ומסתיימים בהמתת חסד הנגרמת על ידי מנת יתר של פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג) ואחריה כריתת בית החזה; הכללת משכך כאבים אינה הכרחית להליך הטרמינלי.
2. שמרו על כרית חימום מתחת לבעל החיים למשך שארית הניסוי.
3. שמור על לחות העיניים עם מי מלח עם פוספט במהלך ההחדרות הכירורגיות הבאות של צינוריות כלי הדם.
4. הכן צינורית כלי דם לעירויים הבאים של עוקבים פלואורסצנטיים. צינור פוליאתילן באורך 20 ס"מ (לדוגמה, קוטר פנימי של 0.28 מ"מ; קוטר חיצוני של 0.61 מ"מ) מונח על קצה מחט מזרק, כאשר הקצה החד של המחט נשבר מראש על ידי כיפוף קדימה ואחורה עם המוסטט.
5. מלאו מזרק וצינורית במי מלח הפריניים (25 יחידות למ"ל).
6. לגלח צד אחד של הבטן התחתונה ולבצע חתך כדי לחשוף את וריד הירך.
7. כדי לשרוף את וריד הירך, קשרו את הכלי בתפר 5.0, בצעו חתך חלקי של הכלי (כמחצית מקוטר הכלי), והכניסו את הצינור לתוך הכלי, ואבטחו את הצינור כשהתפר קשור סביב החלק הקנולטי.

3. הכנה למיקרוסקופיה תוך-חיונית

1. הרחב את אישון העין עם טיפה של תמיסת עיניים טרופיקמיד 1% ואחריה טיפה של תמיסת עיניים היפרומלוז 2.5%.
2. כסו את העין בכיסוי זכוכית 5 מ"מ.
3. הנח את החיה על לוח פרספקס, שיוצב מתחת למטרת המיקרוסקופ של מיקרוסקופ זקוף. הנח אסטרטגית גזה כירורגית מתחת לראש כדי לאפשר ציר ישיר דרך המטרה לרשתית המרכזית ולדיסק האופטי.
4. התמקד דרך המיקרוסקופ בדיסק האופטי, מצא את הדיסק עם אובייקט בעל הספק נמוך פי 4 והשתמש במסנן פלואורסצאין.

4. עירוי של מיקרוספירות פלואורסצנטיות למדידת מהירויות

1. באמצעות מטרה 4X, התמקד ברשתית עם הדיסק האופטי במרכז שדה הראייה.
2. להחדיר את תמיסת המיקרוספירה הפלואורסצנטית בקצב של 250 מיקרוליטר/דקה/ק"ג.
3. הקלט וידאו את הרשתית הניתנת לצפייה סביב הדיסק האופטי, באמצעות זמן חשיפה למצלמה של ~8 msec.
4. הפסק את עירוי המיקרוספירה כאשר הוקלט משך מספיק של וידאו (1-2 דקות); סביר להניח שתמיסת מיקרוספירה כלשהי תישאר ללא שימוש.

5. עירוי של סמן פלזמה פלואורסצנטי למדידת קוטר

1. באמצעות מטרה 4X, התמקד ברשתית עם הדיסק האופטי במרכז שדה הראייה.
2. החדירו את התמיסה המוכנה של דקסטרן פלואורסצנטי לווריד הירך כבולוס מעל ~5 שניות, תוך כדי הקלטת וידאו. סרטון זה יעזור לקבוע את זהות העורקים לעומת הוורידים, כאשר העורקים יוחדרו תחילה. בצע שלב זה כאשר זמן החשיפה של המצלמה מוגדר ל-~8 msec, אם כי זמן החשיפה המדויק אינו קריטי.
3. עבור למטרה של פי 10 וזמן חשיפה של 20-40 מילי-שניות לרזולוציה משופרת של וידאו כל אחד מ-4-7 העורקים ו-4-7 ורידים ברשתית השטחית. התמקד (והקלט וידאו) בערך רבע אחד של הרשתית הניתנת לצפייה בכל פעם, כאשר מרכז הדיסק האופטי נמצא בפינה אחת של שדה הראייה. יש לנסות למזער את הזמן שבו אור המיקרוסקופ מאיר את הרקמה כדי להפחית את האפשרות לפוטוטוקסיות הנגרמת על ידי אור/צבע¹⁷.

6. ניתוח וידאו

1. בעזרת סולם מיקרומטר, כייל את מערכת הווידאו להמרה של מיקרומטר/פיקסל.
2. בעזרת תוכנת עיבוד תמונה, הפעל את הסרטון המוקלט.
3. מהסרטון של עירוי הבולוס של דקסטרן פלואורסצנטי, זהה עורקים לעומת ורידים.
4. עבור כל אחד מ-4-7 העורקים ו-4-7 הוורידים שנרשמו עם המטרה 10X, מדוד את הקוטרים המלאים בדקסטרן פלואורסצנטי, בממוצע 5 מדידות קוטר לכל כלי לאורך הניתן לצפייה.
5. עבור כל אחד מאותם עורקים וורידים, מדוד את אורך הפס של המיקרוספירות הפלואורסצנטיות, באמצעות 10 פסי מיקרוספרה עוקבים בכל כלי כדי למנוע הטיית בחירה. חלקו את אורכי הפס בזמן החשיפה כדי לחשב את מהירות המיקרוספרה, לדוגמה, 160 מיקרומטר/8 מילי-שנייה = 20 מיקרומטר/מילי-שנייה = 2 ס"מ/שנייה. ממוצע של 10 מהירויות לכל כלי שיט.
6. חשב את קצב הזרימה הנפחי עבור כל כלי בעזרת המשוואה הבאה: זרימה = מהירות ממוצעת × π × קוטר²/4.
7. סכם את קצב הזרימה העורקית, ובנפרד את קצב הזרימה הוורידית, כדי לקבל זרימת דם מלאה ברשתית.

תוצאות

איור 1 מציג פריימים בודדים של וידאו מניסוי, כאשר פאנלים A-D ו-F-I מראים פסי מיקרו-ספירות פלואורסצנטיות שנקלטו עם עדשה של 4X וזמן חשיפה של 8 msec (ובנינג של 2 x 2 פיקסלים להפחתת גודל קובץ הווידאו). איור 1E מציג את האוריינטציה של כלי הדם ברשתית בפאנלים האחרים של האיור. לא כל פריים של וידאו יכיל פס פלואורסצנטי במיקוד; עם זאת, חלק מהפריימים עשויים להכיל מספר פסים לשימוש בניתוח (לדוגמה, פאנלים C, D, G, H ו-I). בניסוי זה, רוב הפסים הפלואורסצנטיים (שנקלטו במהלך זמן חשיפה...

דיון

טכניקה זו של מיקרוסקופ וידאו תוך-חיוני יכולה להיות מיושמת לא רק על עכברים, אלא גם על חולדות. פרוטוקול זה מסתמך על מספר הנחות בלבד, אך מוגבל לשימוש בהרדמה ועם הרחבת אישונים כפי שתיארנו אותו. ההנחות והמגבלות האחרות הן כדלקמן:

1. הנחת טעות הגדלה אופטית מינימלית הנובעת מאופי השבירה של העין. כפי שתוארה על ידי אחרים^18-20, שיטת מילוי החלל בין הקרנית לכיסוי בשכבת נוזל תמיסת עיניים נוגדת את כוח השבירה של הקרנית. כל הגדלה לא מוסברת תשפיע על מדידות האורך והקוטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוספירות פלואורסצנטיות	Bangs Laboratories	FS04F/10584 (ירוק)
בדיקות מולקולריות	פלואורסצנטיות במשקל מולקולרי גבוה	D-7137 (ירוק); D-7139 (אדום)
מערכת מיקרוסקופ	Nikon	Eclipse E600FN + קבצים מצורפים
4X אובייקטיבי	Nikon	Plan Fluor 4X	צמצם מספרי 0.13; מרחק עבודה 17.2 מ"מ
10X אובייקטיבי	Nikon	Plan 10X	צמצם מספרי 0.25; מרחק עבודה 10.5 מ"מ
תמיסת עיניים טרופיקמיד	Bausch Lomb	1% Tropicamide
פתרון עיניים היפרומלוז	HUB תרופות	2.5% Goniovisc
תוכנת עיבוד תמונה	אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו Vale Lab	Micro-Manager
מצלמת וידאו דיגיטלית למיקרוסקופיה	פוטומטריה	CoolSnap ES	1392 x 1040 פיקסלים רזולוציה; גודל פיקסל 6.45 x 6.45 μ מ