מאמר שיטה

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

17K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51116

⸱

21 באפריל 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

במאמר זה

סיכום

ידע הנוכחי על הבסיס התאי של מחלות לב בעיקר מסתמך על מחקרים במודלים של בעלי חיים. כאן אנו מתארים ולאמת שיטה חדשה להשיג cardiomyocytes קיימא אחת מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית האנושי. myocytes חדרית האנושי יכול לשמש למחקרי אלקטרו ובדיקות סמים.

תקציר

שריר לב מלב חולה חשופים לתהליכי שיפוץ המורכבים של שינויים במבנה תא, צימוד התכווצות עירור וזרמי יונים בממברנה. שינויים אלה עשויים להיות אחראים לעליית arrhythmogenic שינויי ההתכווצות שמוביל לחוסר תפקוד סיסטולי ודיאסטולי בחולי לב בסיכון ו. עם זאת, רוב המידע על השינויים של תפקוד myocyte במחלות לב הגיע ממודלים של בעלי חיים.

כאן אנו מתארים ולאמת פרוטוקול לבודד myocytes קיימא מדגימות ניתוחיות קטנות של שריר הלב חדרית מחולים שעברו ניתוחי לב. הפרוטוקול מתואר בפירוט. מדידות סידן אלקטרו ותאיות הם דיווחו להוכיח את ההיתכנות של מספר מדידות תא בודדים בשריר הלב של חדר של אדם שנלקח בשיטה זו.

הפרוטוקול דיווח שהואמחדש יכול להיות שימושי לחקירות עתידיות של הבסיס התאי ומולקולרי של שינויים תפקודיים של הלב האנושי בנוכחות מחלות לב שונות. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות מטרות טיפוליות חדשניות ברמה תאית וכדי לבדוק את האפקטיביות של תרכובות חדשות בשריר לב אנושי, עם ערך translational ישיר.

מבוא

Dissection של מאפייני אלקטרו של שריר הלב התקדם במידה ניכרת לאחר הפיתוח של טכניקות לבידוד myocyte לב אחד. פיתוחים אחרונים בהבנה של לב עירור התכווצות צימוד (EC-צימוד) גם כבר מתאפשרים על ידי היכולת של בידוד שריר לב יחיד קיימא ששומרים על כל המאפיינים הפיסיולוגיים של הרקמות שלמות. שיטות מהדק תיקון מועסקות באופן שיגרתי כדי ללמוד את התפקיד ואפנון תרופתי של זרמי יון sarcolemmal לב. הקלטות של דינמיקת סידן תוך תאי עם 2 + צבעים רגישים Ca מבוצעות גם באופן קבוע על myocytes לב אחת ממגוון רחב של דגמים בריאים וחולים, המספקות נתונים חיוניים על הפיסיולוגיה של EC-צימוד כמו גם על השינויים פתולוגיים של תאיים Ca 2 + הומאוסטזיס מוביל לליקוי מכאני וניטל arrhythmogenic מוגבר במחלות לב. Information ממחקרים אלה הוא קריטי להבנת השפעות אלקטרו מכניות של תרופות במסגרת הקלינית. עם זאת, יש הבדלים מסוימים במיני זרמי הטרנסממברני ובחלבוני EC-הצימוד כי חשבון עבור תכונות מסוימות של פוטנציאל פעולת לב ומכניקת לב. וכך, בעוד מחקרים של myocytes מבודד מיונקים שאינם בני אדם שהובהרו מאפייני biophysical ותפקידים פיסיולוגיים של ערוצים ספציפיים הטרנסממברני יון וחלבונים EC-צימוד, הם לא בהכרח לספק מודלים רלוונטיים של myocytes לב האנושי. בידוד של myocytes קיימא משריר הלב אנושי הוא חיוני ולכן כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות לב ולאמת גישות טיפוליות חדשניות.

רקמת פרוזדורי אדם זמינה כנספחי פרוזדורים לעתים קרובות הושלכו במהלך הליכים כירורגיים. מחקרים כמותיים ראשוניים של פוטנציאל למבוגרים פעולה אנושי לבבית ומ"ק היוניrrents מועסק תאי פרוזדורי אנזימים מבודדים 1-4. הקלטות של פוטנציאל פעולה או זרמים מתאי חדרית בודדים מבוגרים אנושיים דווחו לאחר מכן 3,5-10. רוב המחקרים הללו השתמשו בתאים המתקבלים מלב explanted ומנוצלים גם זלוף collagenase של קטע לב כלילית או חשיפה של כמויות גדולות היחסי של רקמה שנכרתה לCollagenase להשיג תאים מבודדים. מחקרים אלה אפשרו אפיון מפורט של מספר זרמי יון הטרנסממברני משריר לב חדרית אדם מלב בריא ומחולים עם אי ספיקת לב סופנית. הקלטות של סוג L-Ca 2 + נוכחית (אני CA-L) 5-7, נוכחית חולף אשלגן החוצה (אני ל) 8, פנימה הנוכחי אשלגן מיישר (אני κ1) 8, המרכיבים השונים של זרם אשלגן rectifier מתעכב (אני κ ) 9 כבר דיווחו. התקדמות וזיקוק שלהליך הבידוד 10, אפשר אפיון ברור של הבסיס היוני של פוטנציאל arrhythmogenic גדל באי ספיקת לב סופנית, הכולל הארכת פוטנציאל פעולת 11, עיכב אחרי depolarizations 12 ועלה 13 הנוכחיים מצחיקים שהוביל לשלילת קוטביות דיאסטולי ופעימות מוקדמות.

myocytes לב למבוגרים בדרך כלל מבודד מבעלי חיים קטנים על ידי זלוף המדרדר של הלב השלם עם תערובות אנזים שונות, טכניקה שמייצרת תשואות גבוהות של 2 תאים + סובלניים Ca 14. בידוד של myocytes לב מרסיסים של רקמה הוא מטבעם פחות מוצלח כנראה בגלל הגישה המוגבלת של אנזימים לmyocytes הבודד בהשוואה לזה שהושג ע"י טפטוף של עורקים הכליליים. בגלל הזמינות מוגבלת מאוד של לב תורם שאינו בשימוש, הדרך המעשית היחידה להשיג תאי חדרית אדם נורמלים על בסיס קבוע היא על ידי digestio האנזימטיתn של שברי הרקמה קטנים מאוד לעתים קרובות נכרת במהלך ניתוחים אלקטיביים. מודל המחלה האנושי היחיד שהתאפיין ביסודיות ברמת תא הוא אי ספיקת לב הטרמינל, בשל הנגישות ללב מושתל. עם זאת, אי ספיקת לב מסוף מתרחשת במיעוט של חולים, ולעתים קרובות כרוך במסלול משותף של שיפוץ חמור של תאי שריר הלב, שהיא עצמאית יחסית של הגורם הבסיסי 15. היכולת להעריך את תפקוד שריר לב אחת מחולים בשלב שאינו כושל קודם של מחלה היא קריטית כדי להבין את הפתופיזיולוגיה מסוימת של תנאים בירושה או רכשו שונים. קרדיומיופתיה hypertrophic (HCM) היא דוגמא מאלפת. HCM הוא נפוץ (1/500 יחידים) מצב לב בירושה מאופיין היפרטרופיה לבבית, גדל שינויי סיכון והתכווצות arrhythmogenic בשל חסימה בדרכי יצוא ותפקוד הדיאסטולי 16. שריר לב מלב HCM undergo תהליכי שיפוץ מורכבים של שינויים במבנה תא (היפרטרופיה, אנדרלמוסית myofibrillar) ו-EC-צימוד 17. עם זאת, רוב המידע של חוסר תפקוד myocyte בHCM הגיע ממודלים של בעלי חיים מהונדסים. שכן רק מיעוט של חולי HCM מתפתח לכיוון אי ספיקת לב סופנית ודורש השתלת לב, לב HCM זמין לעתים רחוקות מאוד לבידוד תא עם שיטות סטנדרטיות. עם זאת, לפחות 30% מחולי HCM לפתח סימפטומים חסימתית עקב זרימת דם בדרכי יצוא שינוי היפרטרופיה במחיצה מסיבית במהלך התכווצות (HCM) 18. האופציה הטיפולית זמינה היעילה ביותר להקלה על החסימה בHCM היא myectomy מחיצה כירורגית: בהליך כירורגים זה, חלק בגודל משתנה של עליונה מחיצה הוסר על ידי גישה של אב העורקים טראנס. חלק זה של מחיצת אף יתר על לכן הוא זמין לבידוד תא מהרקמה הטרי.

שיטה לבידוד של ventricula אדםr myocytes מדגימות בודדות, קטנות transvenous endomyocardial ביופסיה כבר פותח בעבר ופורסם 19. אנחנו יישמנו שיטה לבודד myocytes במחיצה אחת מדגימות שריר הלב חדרית מחולים שעברו ניתוח לב, לרבות חולים עם HCM עוברים myectomy וחולים שעברו הליכים להחלפת שסתום במחיצה. בנוסף לתיאור מפורט של פרוטוקול הבידוד, אלקטרו הנציג וCa 2 + הקרינה מדידות מוצגות, הוכחת הכדאיות של myocytes חדרית האדם המבודד ואת הכדאיות של מהדק התיקון וCa 2 + מחקרים תאיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקולי הניסוי ברקמות אנושיות אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת Careggi-החולים (2006 / 0,024,713; מאי מחודש 2009). כל מטופל נתן הסכמה מדעת בכתב.

1. פתרונות וציוד הכנה

פתרונות מתוארים בטבלה 1. תרשים זרימה פשוטה של הליך בידוד התא נמצאת באיור 1.

פתרון CP DB KB שחפת נ.ב. EB1 EB2
מגיב (מ"מ) KH 2 PO 4 50
4 MgSO 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
אדנוזין 5
גלוקוז 140 10 20 10 10 10
מניטול 100
טאורין 10 20 5 20 20
NaCl 113 136 113 113
KCl 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl 2 1.2 5
KH 2 PO 4 0.6 30 0.6 0.6
Na 2 HPO 4 0.6 0.6 0.6
NaHCO 3 12 12 12
KHCO 3 10 10 10
Na-פירובט 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5
חומצת succinic 5
EGTA 0.5
K-2-ATP 2
חומצת pyruvic 5
קריאטין 5
KMES 115
אנזימים (U / ml) Collagenase סוג V 250 250
פרוטאז סוג XXIV 4
pH 7.4 KOH 7.3 NaOH 7.1 KOH 7.35 NaOH 7.2 KOH 7.3 NaOH 7.3 NaOH

. טבלה 1 פתרונות המשמשים לאיסוף דגימה, בידוד תא ואפיון פונקציונלי של myocytes = פתרון cardioplegic CP.; DB = חיץ ניתוק; KB = פתרון קראפט-Bruhe; TB = חיץ Tyrode; נ.ב. = פתרון פיפטה; EB1 = חיץ אנזים 1; EB2 = אנזים חיץ 2.

  1. הכן cardioplegic פתרון (CP). פתרון CP יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע עד 1.
  2. הכן את Ca 2 חיץ ניתוק ללא + (DB). יש להשתמש בפתרון זה בתוך היום.
  3. הכן פתרון קראפט-Bruhe (KB). פתרון KB יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך הקטנות של הלילה עד 1k.
  4. הכן את Ca 2 חיץ ללא + Tyrode (TB). יש להשתמש בפתרון זה בתוך היום.
  5. לסנן את כל הפתרונות באמצעות מסנני מזרק לפני השימוש.
  6. הכן את מכשיר העיכול (איור 2), מיכל גירוד עשוי שתי מברשות מול של אלסטומר סיליקון, שאחד מהם מסובבים על ידי מנוע חשמלי. מכשיר העיכול מורכב מותאם אישית. פרטים על מכשיר העיכול הם באיור 8; תמונות של המכשיר הן באיורים 2 C ו 2D. שטוף את חדר הרקמות עם 70% אתנול ומים.

2. איסוף ועיבוד של דוגמאות שריר הלב

  1. יוצקים 40 מיליליטר של cardiplegic פתרון (CP) בצינור 50 מ"ל ולאחסן אותו בקרח לתחבורה דגימה מחדר הניתוח למעבדה בידוד תא.
  2. לאסוף את דגימת שריר הלב חדרית מחדר הניתוח באופן מיידי לאחר כריתה, לשטוף אותו עם קרח קרפתרון CP ולאחסן אותו בצינור. השתמש בדגימות endocardial נכרתה מן מחצה העליונה בין חדרית במהלך ניתוח לב פתוח, שקלול> 100 מ"ג.
  3. במהירות להעביר את הדגימה לאזור המעבדה; להתחיל עיבוד דגימה בתוך 10 דקות מכריתת דגימה.
  4. תוך שמירה על הדגימה במאגר CP הקר כקרח, להסיר בזהירות את שכבת fibrotic endocardial באמצעות מספריים עדינים תחת סטראו; לאחר מכן, חותך את רקמת שריר הלב לחתיכות קטנות (2-3 מ"מ אורך). בהתאם לגודל דגימת רקמה, לקצץ בסכום כולל של שריר הלב חדרית בין 100 מ"ג ו 1 גרם לכל בידוד.
  5. עם השלמת מתייפייפת רקמה, להעביר את נתחי שריר הלב לתוך מכשיר העיכול, עם פתרון CP קרח הקר ונקי. הימנע ממילוי כל הנפח שבין שתי מברשות סיליקון (3-4 מיליליטר) עם נתחי שריר הלב, באמצעות לא יותר מ 1 גרם של רקמה בסך הכל.

3. כביסה ועיכול של שריר הלב גושים

  1. בירכתי הספינהאה נתחים מועברים לתוך תא הגירוד של מכשיר העיכול, לשנות את חיץ CP בתא עם 2 חיץ Ca הקר + ללא ניתוק (DB).
  2. מניחים את מכשיר העיכול באמבט תרמוסטטי, על מנת שהחדר יהיה במגע עם המים מחוממים באמבטיה (איור 1). הגדר את האמבטיה ל37.5 ° C ולהפעיל אותו, על מנת להעלות את הטמפרטורה של חדר הרקמות לאט. הפעל את המנוע של מכשיר העיכול, קביעת מהירות הסיבוב עד 1 מהפכה / שני.
  3. בצע 3 מחזורי כביסה עם DB, שינוי הפתרון בתא עם DB הנקי בכל 8 דקות. DB הוא התחמם (37 מעלות צלזיוס) וחמצן רווי לפני מקבל במגע עם נתחי שריר הלב.
  4. הכן את חיץ אנזים 1 (EB1) על ידי הוספת 250 U / מיליליטר של Collagenase סוג V ו4 U / ml פרוטאז סוג XXIV לפתרון DB. הכן את אנזים חיץ 2 (EB2) על ידי הוספת 250 U / ml Collagenase סוג V לפתרון DB. להתחמם (37 מעלות צלזיוס) וoxygenatEB1 הדואר וEB2.
  5. בצע שני מחזורי 12 דקות של עיכול במכשיר העיכול מסתובב עם 100% EB1 מחומצן (על 37 מעלות צלזיוס). בכל מחזור, השתמש ~ 3 מיליליטר של EB1. הסר את הפתרון על ידי שאיפה פיפטה וזורקים אותו אחרי כל מחזור.
  6. הכן 6 15 מיליליטר צינורות לאיסוף תא ו~ 80 מיליליטר של תמיסת KB (4 ° C) קרה למשחררי המאגרים.
  7. בצע מחזור עיכול 15 דקות ראשונה עם 100% EB2 חומץ 3 מיליליטר ב 37 ° C. לאחר מחזור העיכול, לאסוף את התמיסה המכילה myocytes ניתק הראשון בצינור 15 מ"ל ולדלל את ההשעיה התא עם פתרון KB הקר 12 מיליליטר. אחסן את שטוח צינור בטמפרטורת חדר.
  8. לדלל את פתרון EB2 שנותר עם כמות שווה של DB על מנת לקצץ בחצי את הריכוז של V collagenase למחזורים הבאים העיכול.
  9. בצע מחזורי 5 עיכול דקות 12 אחרים עם 3 EB2 מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס; לאחר כל אחד מהם לאסוף של myocyte המכיל חיץ בצינור חרוטי 15 מיליליטר ולדלל אותו עם 12 פתרון KB מיליליטר. אחסן את 6 צינורות תא המכיל בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.

4. Resuspension הנייד וCa 2 + Readaptation

  1. הוספת מ"ג / אלבומין 1 מיליליטר שור בסרום (BSA) ל20 מיליליטר חיץ 2 Tyrode + ללא Ca (TB). סנן את הפתרון.
  2. צנטריפוגה שישה צינורות חרוטי myocyte המכיל בדקות 5 100 XG לכפות myocytes להתיישב. הסר את supernatant ו resuspend התאים בצינור אחד עם כמות משתנה (1-3 מיליליטר, תלוי בתשואה) של BSA המכילה TB ב RT.
  3. בהדרגה להגדיל את Ca 2 + ריכוז בחיץ התא המכיל על ידי הוספת aliquots הקטנים של 100 CaCl מילימול / ליטר 2 פתרון. בשלבים הראשונים והשני Ca 2 + ריכוז עולה עד 50 μmol / L ו100 μmol / L, בהתאמה. שלבי 2 + התוספת הבאה Ca מבוצעים כל 5 דקות והריכוז הוא העלה 100 μmol / L בכל t צעדהריכוז הסופי של OA 0.9 מילימול / ל '
  4. להעריך את התשואה של הליך הבידוד. העבר 0.5 מיליליטר של תמיסה המכיל myocyte על חדר תחתית הזכוכית של מיקרוסקופ. להעריך 15 שדות מיקרוסקופ בהגדלה 10x אובייקטיבי ולחשב את אחוז myocytes בריא (תאים למשל מוט מעוצב עם פסים ברורים ואין תכלילים משמעותיים, איור 2). התשואה הצפויה היא בסביבות 20%.

5. הערכה תפקודית של שריר לב מבודד.

הפרוטוקול הבא הוא דוגמא להערכה תפקודית cardiomyocyte אדם כוללים הקלטות בו זמנית של פוטנציאל פעולה ו2 + נתיבי תאיים Ca.

  1. הכן פתרון פיפטה (PS) עבור ניסויי מהדק תיקון בתצורת תיקון מחורר. הפתרון יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
  2. הוסף 1.8 מילימול / ליטר CaCl 2 Ca 2 + ללא חיץ Tyrode (TB). Use פתרון זה עבור superfusion של שריר לב במהלך ניסויי מהדק תיקון / הקרינה.
  3. העברת 1 מיליליטר של השעיה תא צינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 10 μmol / L Fluoforte ו10 תרכיז Powerload μl. דגירה במשך 30 דקות ב RT. לאחר מכן, קבע את הצינור במצב אנכי ולעזוב את התא להתפשר על 5 דקות; resuspend התאים המכילים Ca 2 TB +.
  4. העבר 0.25 מיליליטר של השעיה תא קטן (0.5 מיליליטר), מיקרוסקופ הטמפרטורה מבוקרת רכוב חדר הקלטה, superfused על ידי כוח הכבידה עם מערכת microperfusor מחוממת בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר / דקה (טמפרטורה: 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס).
  5. באמצעות חולץ micropipette, להכין טפטפות מהדק תיקון בקוטר טיפ של 3 עד 5 מיקרומטר והתנגדות של 3-4.5 M כאשר התמלאו PS.
  6. הוספת amphotericin B לקבוצה של PS (250 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהשתמש בו כדי למלא את האלקטרודות.
  7. בחר תא בצורת מוט עם פסים ברורים, נטול תכלילים, עבורrm החותם וגיגה לחכות 5 דקות עד 10, עד שהתנגדות גישה יורדת מתחת 20 MΩ.
  8. לעורר פוטנציאל פעולה במצב הנוכחי מהדק באמצעות פולסים קצרים (<3 אלפיות שני) בתדרים שונים של גירוי (Hz 0.2, 0.5 הרץ ורץ 1, 1 דקות בכל תדר). במהלך שלב ההקלטה, להדליק תאורה בשדה בהירה ב492 ± 3 ננומטר ולזהות הקרינה Fluoforte ב505-520 ננומטר. לרכוש הקרינה וקרום אותות פוטנציאליים באמצעות Digidata 1440A וpClamp 10.0 תוכנה. חזור על רצף ההקלטה מספר פעמים במידת הצורך; עם זאת, לשמור על זמן ההקלטה הכולל מתחת 15 דקות לכל תא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השיטה שתוארה לעיל הועסקה לאפיין את הליקויים תפקודיים של שריר לב מבודד ממחיצת interventricular של חולים עם קרדיומיופתיה hypertrophic (HCM) שעברו ניתוח myectomy, בהשוואה לחולים שאינם כושלים שאינו hypertrophic כירורגית 21. התוצאות הכלולות בסעיף זה נובעות מהעבודה ש21 ומוצגות כאן כדוגמא לאופן שטכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לאפיין את השינויים בתפקוד תא בשריר הלב בתנאי מחלת לב.

מדגם כירורגית נציג ממט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שתארנו ומאומתים שיטה לבודד myocytes קיימא מדגימות כירורגית של שריר הלב חדרית האנושי. החל מפרוטוקולים שתוארו קודם לכן, ששימש בהצלחה לתאים מבודדים מדגימות ניתוחיות פרוזדורים, הטכניקה כדי לאפשר הפרדת myocytes קיימא אחת משריר הלב של חדר חולה פותחה ומכויל. דיווחים מוקדמים הראו כי בידוד של שריר לב אחת מהחתיכות של רקמת פרוזדורים וחדרים סלקטיבי לקויה repolarizing זרמי אשלגן, וכתוצאה מכך שינו את מאפייני אלקטרו ותגובות לגירויים פיסיולוגיים 8,24, ואילו משלוח של האנזים המכיל חיץ בא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי (סטרפטוקוקוס פרויקט 241,577 "לב גדול", תכנית 7 במסגרת אירופאית, CP), Menarini הבינלאומי תפעול לוקסמבורג (PM), Telethon GGP07133 (CP) וגלעד למדעים (בבוקר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
מגנזיום סולפט הפטהידרט(MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPESSigma-AldrichH3375
AdenosineSigma-AldrichA9251
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
MannitolSigma-AldrichM4125
TaurineSigma-AldrichT0625
אשלגן הידרוקסיד (KOH)Sigma-AldrichP5958
נתרן כלורי (NaCl)Sigma-AldrichS7653
אשלגן כלורי (KCl)Sigma-AldrichP9333
נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS6297
אשלגן ביקרבונט (KHCO3)Sigma-Aldrich237205
נתרן פירובטסיגמא-אולדריץ'P2256
2,3-Butanedione monoximeSigma-AldrichB0753
נתרן הידרוקסיד(NaOH)Sigma-AldrichS8045
L-חומצה מונו-גלוטמית מלח מונוהידראטSigma-Aldrich49601
חומצה פירוביתסיגמא-אולדריץ'107360
3-חומצה הידרוקסי-בוטיריתסיגמא-אולדריץ'166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)Sigma-AldrichA8937
CreatineSigma-AldrichC0780
Succinic AcidSigma-AldrichS3674
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA)סיגמא-אולדריץ'E0396
Albumin מסרום בקרSigma-AldrichA0281
מגנזיום כלוריד (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
קולגנאז מ-Clostridium histolyticum, Type VSigma-AldrichC9263
Proteinase, חיידקים, תמיסתSigma-AldrichP8038
, ~1 M ב-H2OSigma-Aldrich21115
תמיסת סידן כלוריד 0.1 MSigma-Aldrich53704
אשלגן מתאן-סולפונאטסיגמא-אולדריץ'83000
FluoForte ReagentEnzo Life SciencesENZ-52015
תרכיז Powerload, 100XLife TechnologiesP10020
מערכת זלוף צעד מהירוורנר אינסטרומנטסVC-77SP
אמפוטריצין B מסיססיגמא-אולדריץ'A9528
Multiclamp 700B מגבר מהדק תיקוןמולקולריים
Digidata 1440Aמולקולריים
pClamp10.0 מולקולריים
מכשיר עיכולמותאם אישיתהמכשיר מיוצר בהתאמה אישית במעבדה שלנו באמצעות צינורות פלסטיק, סילגארד יצוק ומנוע; הוא מתואר בפירוט באיור 1C-1D ובאיור 7. המלון יכול לספק פרטים נוספים על פי בקשה.
אלסטומר סיליקון למברשות מכשיר העיכולDow CorningSYLGARD® 184
מנוע מסתובב במהירות משתנה למכשיר העיכולCrouzet Crouzet178-4765
תבנית ליציקת מברשותנ.א.נ.א.התבנית מיוצרת בהתאמה אישית ממוטות PTFE סטנדרטיים בקוטר 2.5 ס"מ.
סידן כלוריד מסוג XXIV התקנים התקנים מכשירים

מקורות

  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
  3. Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
  4. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
  5. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
  6. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  7. Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
  8. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
  9. Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
  10. Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
  11. Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
  12. Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
  13. Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
  14. Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
  16. Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
  17. Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
  18. Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
  19. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  20. Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
  21. Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
  22. Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
  23. Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
  24. Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
  25. Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
  26. Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
  27. Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
  28. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
  29. Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patch Clamp

מאמרים קשורים