שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לבידוד אקסוזומים משתן אנושי באמצעות טכניקת משקעים שונה.

Abstract

זיהוי סמנים ביולוגיים המאפשרים גילוי מוקדם של מחלות כליות בשתן ובפלזמה הוא תחום עניין פעיל מזה מספר שנים. שלפוחיות אקסוזום בשתן, בגודל 40-100 ננומטר, משתחררות לשתן בתנאים רגילים על ידי תאים מכל מקטעי הנפרון ועשויות להכיל חלבון, mRNA ומיקרו-RNA המייצגים את סוג התא שלהם. בתנאים של תפקוד לקוי או פציעה של הכליות, אקסוזומים עשויים להכיל פרופורציות משתנות של רכיבים אלה, שעשויים לשמש כסמנים ביולוגיים למחלות. ישנן כיום מספר שיטות זמינות לבידוד אקסוזומים בשתן, וערכנו בעבר השוואה ניסויית של כל אחת מהגישות הללו, כולל שלוש המבוססות על אולטרה-צנטריפוגה, אחת באמצעות רכז אולטרה-סינון ננו-ממברנה, אחת באמצעות מגיב משקעים מסחרי ואחת באמצעות שינוי של טכניקת המשקעים באמצעות ריאגנט ExoQuick שפיתחנו במעבדה שלנו. מצאנו ששיטת המשקעים המותאמת הניבה את התפוקה הגבוהה ביותר של חלקיקי אקסוזום, miRNA ו-mRNA, מה שהופך גישה זו למתאימה לבידוד אקסוזומים לפרופיל RNA לאחר מכן. אנו מסיקים כי שיטת משקעי האקסוזום המותאמת מציעה אלטרנטיבה מהירה, ניתנת להרחבה ויעילה לבידוד אקסוזומים מהשתן. בדוח זה, אנו מתארים את טכניקת המשקעים השונה שלנו באמצעות מגיב ExoQuick לבידוד אקסוזומים משתן אנושי.

Introduction

exosomes שתן הוא שלפוחית ​​פנימית קטנה של גופי multivesicular (MVB) נגזרים מכל סוגי התאים בתנאים נורמלים ופתולוגיים בחלל שתן כולל podocytes גלומרולרי, תאי אבובית כליה ותאים המצפים את מערכות ניקוז שתן המופיעות להיות מועשרים לmiRNAs ¹ 100 ננומטר ^-2. חוקרים רבים זיהו חלבונים שונים בexosomes מבודד משתן של אנשים בריאים, כמו גם אלה עם כליות ו / או מחלות שיטתיות ^3-5. יכול להיות מבודד Exosomes בשיטות שונות כגון ultracentrifugation ההפרש דו-שלבים עם או בלי סוכרוז ^6-7, שילוב מסנן nanomembrane עם ultracentrifugation ^8-9, או ^10-11 ממטרים. יש לנו לאחרונה פיתחתי שיטה פשוטה, מהירה, מדרגי ויעילות לבודד exosomes שתן ולזהות מירנה וסמנים ביולוגי חלבון ^11. למרות שניתן לאתרם סמנים ביולוגיים במגוון רחב של נוזלים ביולוגיים שונים, urine הוא הבחירה הנוחה ביותר עבור חולים עם מחלות הכליות ודרכי שתן, כי ניתן להשיג אותו בכמויות גדולות באופן יחסי שאינו פולשנית.

למרות שיש כמה שיטות לבודד exosomes שתן ^6-11, ההליך הנפוץ ביותר תלוי בultracentrifugation ההפרש עם 30% כרית סוכרוז. למרות ששיטה זו היא יעילה ואיכות exosomes וכתוצאה מכך מבודדת עם הליך זה היא גבוהה, הטכניקה עצמה דורשת כוח אדם מיומן, והוא, שדורש כמה צעדי ultracentrifugation זמן רב. שיטות אחרות, כגון סינון ומשקעים, פותחו עבור הבידוד של exosomes, כולל אחד שמשתמש מגיב ממטרים קניינית (כלומר, ExoQuick-TC: מערכת Biosciences; Mountain View, CA). למרות משקעים באמצעות מגיב זה הוא מהיר וקל יחסית, טוהר exosomes מבודד הוא נמוך בהשוואה לספיד ultracentrifugationod. לאחרונה לעומת שש שיטות לבידודה של exosomes שתן, כולל שינוי של שיטת המשקעים באמצעות ExoQuick-TC שפיתחנו במעבדה שלנו ^11. מצאנו ששיטת משקעים שונה זו הניבה כמויות גבוהות יותר של חלבון, מירנה, וmRNAs וההליך עצמו היה מהיר יותר וקל יותר ליישום מאשר ultracentrifugation. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הניסוי של שיטת המשקעים שונה שלנו באופן הדרגתי, ונכלול דיון על היתרונות והחסרונות של שיטה זו בהשוואה לשיטות אחרות של בידוד exosome. שיטת המשקעים שונה כרוכה ממטרים ראשוניים של חלקיקי exosome, ואחריו הסרת חלבון התם-Horsfall, אשר מתואם עם חלבוני exosomal, וידוע כדי להפחית את תשואת exosome משתן של. מצאנו ששינויים אלה הגדילו את התשואה וטוהר של הכנת exosomal משתן.

Protocol

הערה:. השלבים כרוכים בבידוד של exosomes השתן תוך שימוש בשיטת המשקעים שונה באים לידי ביטוי באיור 1 הצעדים הראשוניים כרוכים בהסרת תאים מתים גדולים ופסולת תא על ידי צנטריפוגה. גלולה הסופית המתקבלת מsupernatant שנאסף מכל שלב שלאחר מכן תואמת את exosome, אשר מומס בפתרון בידוד להפקה נוספת של החלבון, RNA, ו- DNA.

1. איסוף שתן

1. לפני איסוף שתן, להכין מעכבי פרוטאז קוקטייל על פי הוראות היצרן ולהוסיף 3.125 מיליליטר של הקוקטייל הזה לקיבול סטרילי ריק. הצינור המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל אז יכול להיות מופץ למתנדבים לאיסוף שתן.
   הערה: הסיבה להוספת מעכבי פרוטאז היא למזער פירוק חלבונים בדגימת השתן. למרות שאנו במיוחד משמשים מעכבי פרוטאז קוקטייל מSigma, ניתן להחליף מעכבי פרוטאז זמינים מסחרי אחרים.
2. לאסוף כ 10 מיליליטר של השתן הראשון-חלל. לעבד את השתן מייד לאחר האיסוף ללא אחסון או קירור. לבודד את exosomes השתן בשני עותקים בשיטת המשקעים שונה; אחד מהכפילויות הוא לDNA, RNA המוחלט ומיצוי חלבון, ואילו השני הוא לכימות של חלקיקי exosome שתן.
   הערה: דגימת שתן 24 שעות ניתן לאסוף עבור בידוד exosome ידי אחסון ב 4 מעלות צלזיוס.

2. ההסרה של פסולת תא וחלבון התם-Horsfall (THP)

1. העבר את דגימות שתן של 15 מיליליטר צינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה 10 מיליליטר של שתן ב17,000 XG במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס לחסל תאים ופסולת תא (איור 1).
2. בעזרת פיפטה, להעביר את supernatant לצינור טרי לעיבוד נוסף. Resuspend גלולה ב 500 μl של פתרון בידוד (250 מ"מ סוכרוז, trieth מ"מ 10anolamine, pH 7.6) ואחריו דגירה 10 דקות עם DL-dithiothreitol (DTT: מ"ג / מיליליטר ריכוז 200 סופי) על 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: DTT מתווסף לבזות THP, שלוכד את exosomes, שהוביל לירידה בתשואות. תשמור על עצמך לעזוב את הכדור ללא הפרעה במהלך העברת supernatant, ולאשר כי supernatant ברור של גלולה.
3. דגימות גלולה וורטקס כל 2 דקות עד גלולה הוא נמס לגמרי. ואז להוסיף 500 μl של פתרון בידוד לגלולה המומס.
4. מייד לאחר התוספת של פתרון בידוד לגלולה, צנטריפוגות ב 17,000 XG במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. Pipet supernatant ולשלב עם supernatant שנאסף קודם לכן.
5. Resuspend את הכדור ב 50 μl של פתרון בידוד לניתוח SDS-PAGE.
   הערה: PBS או TBS יכול לשמש במקום פתרון בידוד לresuspend גלולה.

3. בידוד של Exosome גלולה

1. עד 11 מיליליטר של supern נאסףatant, להוסיף 3.3 מיליליטר של מגיב ExoQuick-TC ודגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 12.
   הערה: היחס של נפח supernatant למגיב ExoQuick-TC יכולה להיות מותאם כדי להגדיל או להקטין את תשואת exosomal. הבחנו כי כרכים פחותים של מגיב הוסיף לייצר תשואות קטנות יותר של exosomes.
2. לאחר דגירה, צנטריפוגות תמהיל המדגם / ExoQuick-TC ב10,000 XG למשך 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס.
3. מעביר את supernatant לצינור טרי לניתוח SDS-PAGE.
4. גלולה exosome ניתן לאחסן ב -80 ° C ל- DNA, RNA ומיצוי חלבון וכימות של חלקיקי exosome באמצעות CD9 ¹¹ ELISA.
   הערה: גלולה exosome ניתן לאחסן ב -80 ° C למשך שנה 1 עם הקפאה להפשרה מוגבלת.

4. ביומרקר באיתור ובניתוח של Exosome גלולה

1. עבור ניתוחים במורד הזרם, לחלץ DNA, RNA וחלבון מגלולת exosome באמצעות DNA / RNA / ערכת בידוד החלבון וקי בידוד RNAt על פי הוראות היצרן. לקבוע ריכוזים באמצעות ספקטרופוטומטר Nanodrop על ידי מדידת הספיגה ב 260 ו280nm עם 2 μl של מדגם.
2. לבצע בזמן אמת RT-PCR (qPCR) באמצעות מבחני microRNA TaqMan (במקרה שלנו, השתמש miR-192- וmiR-1207-5p ספציפי מבחני אנושיים) או פריימרים מירנה ספציפיים.
3. לניתוח SDS-PAGE, להשתמש 4-12% ג'ל Bis-טריס ודגימות חלבון נפרדים על ידי אלקטרופורזה חד-ממדית. דמיין ג'ל באמצעות ערכת צביעת כסף בהתאם להוראות היצרן.
4. לבצע ניתוח כתם מערבי באמצעות ממברנות PVDF בהתאם להוראות הניתנות על ידי היצרן. השתמש נוגדן polyclonal ארנב גן-2 X צמוד אפופטוזיס אינטראקציה חלבון או אליקס ונוגדנים חד שבטי עכבר כדי גן רגישות גידול 101 חלבון או TSG101 באיתור הכתם המערבי. לכמת את הצפיפות של הלהקות על ידי גישה פתוחה תוכנת NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) אותכנית דומה.
5. לכמת את מספר חלקיקי exosome שתן שהושגו באמצעות ערכת ELISA CD9 לפי הוראות יצרן.

Results

exosomes שתן לשאת סמנים ביולוגיים חלבון, מירנה וmRNA המופרשים מתאי האפיתל כליות. הבידוד וזיהוי של exosomes אלה עשויים לספק כלי אבחון יעילים לגילוי מוקדם של מחלות כליה, כגון נפרופתיה סוכרתית. ישנן מספר שיטות לבידודה של exosomes מדגימות שתן שנאספו מבני אדם. השווינו בעבר שש שיטות של בידוד exosome השתן וכתוצאה מכך חקרנו חלבון, רמות ה- mRNA, ומירנה ^11. המטרה שלנו כאן הייתה לתאר בפירוט את שיטת המשקעים שונה שפיתחנו לבידוד יעיל של exosomes שתן.

Discussion

רוב השיטות הכרוכות במשקעים של exosomes משתן אינן מתייחסות להסרת של רשת פולימרים הוקמה על ידי חלבון התם-Horsfall (THP). חלבון זה נמצא בכמויות גדולות בשתן, שבו מלכודות putatively זה exosomes במהלך צנטריפוגה מהירות נמוכה ראשונית. בשיטה שונה שלנו אנחנו מופחתים THP באמצעות DTT לפני הממטרים exosome. כפי שניתן לראות באיור 2, סכום גבוה יותר של THP נצפה בשתן והגלול לא מעובד, ללא THP בsupernatant הסופי והגלול exosome, המצביע על הסרת החלבון. כימות של חלבון בגלולה מצויינים תש...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
קורנינג 15 מ"ל צינור צנטריפוגה	קורנינג (סיגמא אולדריץ')	CLS430791
קוקטייל מעכב פרוטאז	סיגמא אולדריץ'	P8340
צנטריפוגה	סורוול
DL-דיתיותרייטול	סיגמא אולדריץ'	D9779	בשימוש בריכוז סופי של 200 מ"ג/מ"ל
מערכת Novex NuPAGE SDS-PAGE (4-12% ביס-טריס ג'ל 1.0 מ"מ, 10 באר	Invitrogen	NP0321BOX	לניתוח SDS-PAGE
ECL Advance Western Blotting Detection	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	לזיהוי כתמים מערביים של סמנים ביולוגיים
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	לבידוד
אקסוזום CD9 ELISA Complete	Kit System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	לכימות אקסוזום
AllPrep DNA / RNA / חלבון מיני ערכה	Qiagen	80004	עבור DNA, RNA, בידוד חלבון
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis ספקטרופוטומטר	תרמו מדעי		לכימות חלבון
ProteoSilver ערכת כתמים	רסיס Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	לצביעה SDS-PAGE ג'לים
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Life Technologies		להפעלת ג'ל SDS-PAGE
בדיקות מיקרו-RNA של TaqMan	חיים		לבדיקות RT-PCR
תוכנת qBasePlus v1.5	Biogazelle NV		לניתוח נתוני בדיקת RT-PCR
נוגדן רב-שבטי ארנב לאליקס	מיליפור		לזיהוי כתמים מערביים של סמנים ביולוגיים
נוגדן חד שבטי של עכבר ל-TSG101	Abcam		לזיהוי כתמים מערביים של סמנים ביולוגיים