Method Article

שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים

DOI:

10.3791/51161

⸱

January 29th, 2014

 ,  , 
1Department of Immunopathology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory Academic Medical Center, University of Amsterdam, 2Department of Hematology, Academic Medical Center, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שני מבחני למדידת הפעלת משלימים הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד תאי דם אדומים. היתרון הגדול על פני מבחני הנוכחיים הוא מטבעם כמוני וקל לפרש.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להוביל להשלמת הפעלה וכתוצאה מכך אישור מואץ באמצעות קולטנים משלימים בכבד (המוליזה extravascular) או מוביל לתמוגה intravascular של RBCs. Alloantibodies (למשל ABO) או נוגדנים עצמיים לאנטיגנים RBC (כפי שניתן לראות באנמיה המוליטית אוטואימונית, AIHA) המוביל כדי להשלים את ההפעלה הם מזיקים ויכול להיות - במיוחד כאשר מובילים לתמוגה intravascular - 1 קטלני. נכון לעכשיו, להשלים את ההפעלה בשל (אוטומטי)-נוגדנים על פני כדוריות דם אדום נבחנת במבחנה על ידי שימוש בבדיקת קומבס משקפת בתצהיר משלים בRBC או על ידי assay המוליטית nonquantitative משקף RBC תמוגה 1-4. עם זאת, כדי להעריך את היעילות של מעכבי משלים, הוא חובה שיש טכניקות כמותיות. כאן אנו מתארים שתי טכניקות כאלה. ראשית, assay כדי לזהות C3 ו-C4 בתצהיר על תאי דם אדומים הנגרמים על ידי נוגדנים בסרום חולה מראשsented. לשם כך, ניתוח FACS משמש עם נוגדנים נגד C3 או אנטי-C4 שכותרתו fluorescently. בשלב הבא, assay המוליטית כמותית מתואר. המוליזה ב assay זה, להשלים בתיווך הנגרמת על ידי סרום מטופל נמדדת שימוש ביצוע של זיהוי spectrophotometric של המוגלובין שפורסם. שני מבחני האלה הם מאוד לשחזור וכמותיים, בהנחיית מחקרים של הפעלת משלים-Induced נוגדן.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להיגרם על ידי עירוי של תאי דם אדומים מבטאים אנטיגן שאינו נמצא בתאי דם אדומים נמען. הלו, נוגדנים אלו יכולים לגרום לתגובות קשות חריפות המוליטית עירוי עקב להשלים הפעלה על העירוי 5 הבא. באנמיה המוליטית אוטואימונית (AIHA), חולים נוגדנים עצמיים כנגד תאי הדם האדום שלהם. זה מוביל לאישור מואץ של התאים באמצעות האינטראקציה של IgG חייבת RBCs עם Fcγ-קולטנים על phagocytes בטחול ו / או במקרה של נוגדנים עצמיים מסוגלים להפעיל משלימים באמצעות קולטנים משלימים בכבד 6,7. הפעלת השלמה המוחלטת של תפקוד וכתוצאה מכך המוליזה intravascular היא נדירה אך לעתים קרובות קטלנית. מואץ, משלים הרס RBC ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של תאי דם אדומים שטופלו ברומלין

  1. תאי דם אדומים לשטוף 0 הקלידו-3x עם 1x PBS (צנטריפוגה ב664 XG במשך 2-5 דקות).
  2. דגירה 1 נפח של תאי דם אדומים צפופים עם שני כרכים של פתרון ברומלין 0.5% עבור 10 דקות ב37 ° C.
  3. לשטוף את התאים 3x עם 1x PBS.
  4. ניתן לאחסן את התאים כפתרון 3% ב 4 ° C ב1x PBS למשך שבוע אחד לפחות.

2. C3 ו-C4 הפקד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 א מראה עלילת פיזור נציג לRBCs. gating המתאים לRBCs היחיד שניתן לראות בדה FSC-W - FSC-עלילה (P1). בדרך כלל סביב 95% מתאי הדם האדומים ליפול בתוך השער הזה P1 (תאים בודדים), אבל כאשר אחוז גבוה של סרום חולה משמש, זה יכול לרדת ל 70-80%, במיוחד כאשר אנטי RBC IgM נמצא בסרום החולה.

נציג תוצאות להשפעת סרום מטופל AIHA על תצהיר C4 מוצגות באיור 2 ועל תצהיר C3 באיור 2C........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני לעיל הם שחזור וחזקים. הם קלים לביצוע וניתן לבצע אותם עם דגימות רבות באותו הזמן (בצלחת 96 היטב). לפיכך, גישה זו תהיה גם מתאימה למערכת אוטומטית לחלוטין, כגון: מערכת רובוט ELISA. בניגוד לטכניקות המשמשות כיום, מבחני האלה הם כמוני וזה יעזור לדוגמא: במחקר של ההשפעה של מעכבי משלים. יתר על כן, הפרשנות היא אובייקטיבית, אשר מהווה שיפור של מבחני המשמשים כיום.

לשניהם יש מבחני שלב אחד קריטי. חשוב בניתו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ וDW לקבל מענק בלתי מוגבל של ViroPharma.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSפרסניוס קאבי 
BSAסיגמאB-4287 
ברביטלפגרון0261כימיקל זה כפוף לתקנות תרופות.
נתרן ברביטלFagron0263כימיקל זה כפוף לתקנת התרופות.
ג'לטיןמרק1.0470.0500 
נתרן כלוריMerck1.06404.1000 
מגנזיום כלורידMerck1.05833.0250 
סידן כלורידMerck1.0238.0500 
Dylight 488 אמין צבע תגובתיפירס46402 
Dylight 650 אמין צבע תגובתיפירס62265 
ואלפא; C5 (Eculizumab)Alexion Pharmaceuticals 
FACS (Canto)BDניתן להשתמש בכל FACS עם הלייזרים המתאימים.
ספקטרופוטומטר (למשל ספקטרום מולטיסקאן) Thermo Labsystems1500-193ניתן להשתמש בכל ספקטרופוטומטר עם טווח אורכי הגל הנכון
FACSDiva תוכנה v 6.1.2BD643629ניתן להשתמש בכל תוכנת ניתוח FACS תואמת
Bromelain סנקוויןK1121 
BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Complement ActivationAntibody DepositionFlow CytometryHemolytic AssayRed Blood CellsC3 C4 DetectionQuantitative AnalysisSpectrophotometric DetectionPatient SerumAnti C5 Antibody

Related Articles