Method Article

בידוד וכימות של טוקסין עצבי ממטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest

DOI:

10.3791/51170

⸱

March 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1BioSentinel Inc., Madison, WI

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני זיהוי עצבי וטולינום BoTest מטריקס (ונט) במהירות לטהר ולכמת ונט מתוך מגוון רחב של מטריצות מדגם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיתור והכימות של ונט ממטריצות הן מוצקות ונוזליות ולהפגין assay עם בוטוקס, עגבניות, וחלב.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איתור וכימות של עצבי טוקסין (בונט) מטריצות מורכבות מדויקים הנדרש עבור תרופות, סביבתיות, ובדיקת מדגם מזון. בדיקה המהירה בונט של מוצרי מזון נחוצה במהלך זיהוי פלילי פרוץ, אבחון מטופל, ובדיקות בטיחות מזון תוך נדרשת בדיקות עוצמה מדויקות לייצור מוצרים מבוססי תרופה בונט ובטיחות מטופל. מבדק העכבר בשימוש נרחב לבדיקת ונט הוא רגיש מאוד אך חסר הדיוק ותפוקה הנדרש לבדיקה בונט מהירה ושגרתית. יתר על כן, השימוש של המבדק של בעלי חיים הביא לשיחות על ידי הרשויות הרגולטוריות מוצר תרופה ותומכי זכויות בעלי החיים בארצות הברית ובעולם כדי להחליף את מבדק העכבר לבדיקה בונט. כמה מבחני חוץ גופיית החלפה פותחו שפועלים היטב עם ונט מטוהרת במאגרים פשוט, אבל רובם לא הוכחו כרלוונטי לבדיקה במטריצות מורכבות ביותר. כאן, פרוטוקול לזיהוי שלונט במטריצות מורכבות באמצעות מטריקס מבחני BoTest מוצגת. Assay מורכב משלושה חלקים: החלק הראשון כולל הכנת הדגימות לבדיקה, החלק השני הוא צעד immunoprecipitation באמצעות חרוזים פאראמגנטיים מצופה נוגדן אנטי ונט לטהר ונט מהמטריצה, ואת החלק השלישי מכמת מפרקי החלבונים של ונט המבודדת פעילות באמצעות כתב fluorogenic. הפרוטוקול כתוב לבדיקת תפוקה גבוהה בצלחות 96 היטב באמצעות מטריצות הן נוזליים ומוצקות ודורש כ 2 שעות של הכנה ידנית עם פעמים assay כוללת של 4-26 שעות, תלוי בסוג המדגם, עומס רעלן, ורגישות רצויה. הנתונים מוצגים עבור ונט בדיקות / עם פוספט שנאגרו מלוח, מוצר תרופה, supernatant התרבות, חלב 2%, ועגבניות טריות וכוללים דיון בפרמטרים קריטיים להצלחת assay.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

neurotoxins טוקסין (BoNTs) הם החומרים הקטלניים ידועים, עם מינונים קטלניים אנושיים תוך ורידי מוערכים ב 1-3 ננוגרם / ק"ג 1,2. שבעה קפסיד דומים מבחינה מבנית של ונט, שכותרתו דרך G, קיימים, כל אחת בהיקף של תחום שרשרת כבד אחראי על תא מחייב, ספיגה, וטרנסלוקציה לתוך cytosol ושרשרת אור שמקודד endopeptidase אבץ 3-5. הרעילות המעודנת של ונט נובעת מ, בין שאר, את כניסתה הספציפית מחייבת ולתוך הנוירונים מוטוריים בצומת neuromuscular 6. פעם בתוך תא העצב, endopeptidase שרשרת אור במיוחד דבק אחד או יותר של N-ethylmaleimide רגיש קולטן מסיס החלבון מצורף גורם (המוקשת) החלבונים דרושים לאיחוי שלפוחית, עיכוב שחרו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים Assay

  1. dithiothreitol 200x הפשרה (DTT), מאגר עקידת 10x מטריקס (10x להלן חיץ עקידה), חיץ 10x נטרול (דגימות לא מאוזנות מזון או pH בלבד), וחיץ 10x תגובת BoTest (להלן 10x תגובה חיץ) בטמפרטורת חדר (RT) ל15 דקות או עד מופשר לחלוטין. ראה לוח 1 לרשימה של מאגרים וחומרים כימיים המשמשים בפרוטוקול זה. ראה טבלה 2 לרשימת החומרים והציוד הדרוש לפרוטוקול זה.
  2. מערבולת במאגרים מופשרים במשך 5 שניות כדי לערבב. 10x נטרול חיץ, 200xDTT, וחיץ 10x תגובה אמור להופיע ב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרשים המסכם את השלבים בפרוטוקול המתואר מוצג באיור 2. Assay מחייב בין 4-26 שעות כדי להשלים בהתאם לסוג דגימה ורגישות assay רצוי, אבל ~ 2 שעות רק של ידיים על זמן. Assay מתבצע בצלחות 96 היטב ו, תלוי בסוג של מתבצעת בדיקה, מאפשרת בדיקה בשלושה עותקים של עד 20 דגימות לרבות תקנים לכל צלחת.

תרשים 3 מראה תוצאות assay נציג באמצעות ונט / holotoxin זינק לתוך PBS ונבדק עם הפרוטוקול המתואר הבא 2.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר הליכים לכימות ונט / holotoxin, או supernatant מורכבים, Clostridium תרבות מטריצות מורכבות. הפרוטוקול הוא זהה, עם זאת, כאשר בודקים קפסיד אחרים ונט (למשל ונט / B, E, ו-F) עם מבחני מטריקס 56,60, למרות רגישות assay תשתנה פני קפסיד ומבחנים. פרוטוקול זה אינו לוקח בחשבון כל סוג של מדגם אפשרי וכמה שינויים שיידרשו בהתאם להרכב מדגם המסוים ויישום רצוי. מטריצות יכולות לכלול דגימות מזון (למשל בדיקת אתגר מזון) או מאגרי חומר לא פעילי תרופות (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FM דאנינג, TM פיאצה, פ Zeytin, ומקלחת טאקר הם עובדים או בעלי BioSentinel בע"מ BioSentinel כיום מייצר ויש ממוסחרים חלק מהחומרים הכימיים שהוצגו בדוח זה.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לח' Olivares וד 'רוגה לדיונים ועצות רבי ערך. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הפרס NSF SBIR (IIP-1,127,245 לBioSentinel Inc) וחוזה של משרד ההגנה (W81XWH-07-2-0,045 לBioSentinel Inc).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BoTest Matrix A ערכת זיהוי נוירוטוקסין בוטולינוםBioSentinelA1015עבור BoNT/B ו-F זמינות גם כן.
קורא מיקרו-פלטות פלואורסצנטי פלאש VarioskanThermo Fisher Scientific5250040ניתן להשתמש ברוב היחידות המבוססות על מונוכרומטור או פילטר עם עירור של 434 ננומטר ויכולת פליטה של 470 ננומטר ו-526 ננומטר.
צלחת הפרדת חרוזים מגנטית 96 בארV& P ScientificVP771Hניתן להשתמש בלוחות מגנטיים אחרים, אך יש לתכנן את הצלחת כך שתפריד את החרוזים לצד הבאר.
מכונת כביסה תואמת חרוזים מגנטייםBioTekELx405 VSRMאופציונלי, נדרש רק לשטיפת צלחות אוטומטית.  ניתן להשתמש גם במכונות כביסה אחרות התואמות חרוזים מגנטיות, אך יש לבדוק אותן לפני השימוש.
מיקרוצנטריפוגהאופציונלי, נדרש רק לדגימות הזקוקות לצנטריפוגה.
מערבל צלחות MixMateEppendorf22674200
Orbital Shakerמשמש בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה של 25 מעלות; C אם בקרת טמפרטורה זמינה
טבליות מעכבות פרוטאז ללא EDTARoche4693132001נדרשת רק לבדיקות מזון או סביבה. מעכבי פרוטאז חייבים להיות נטולי EDTA.
BoNT/Aמטאביולוגיותאופציונליות, נדרשת רק למטרות סטנדרטיזציה וכימות
צלחות שחורות, עם תחתית שטוחה 96 בארותNUNC237105לטפל בסרט
איטום צלחות 96 בארותThermo Fisher Scientific15036
ערכות זיהוי אין לטפל בצלחות אין

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Botulinum NeurotoxinBoTest Matrix AssaysImmunoprecipitationMagnetic BeadsFluorogenic ReporterSample PreparationProteolytic ActivityComplex MatricesHigh Throughput96 Well Plates

Related Articles