מדידות של נכסי הולכה עצביות in vivo מדגימות כלי רב עוצמה כדי לאפיין מודלים של בעלי חיים שונים של מחלות neuromuscular. כאן, אנו מציגים פרוטוקול קל ואמין, שבאמצעותו ניתן לבצע ניתוח אלקטרו על עצבי הירך של עכברים מורדמים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקרי אלקטרו יאפשר סיווג רציונלים של מחלות שונות ותוקפת הם של עזרה, יחד עם טכניקות נוירו, בהבנה של הפתופיזיולוגיה הבסיסית 1. כאן אנו מתארים שיטה לביצוע מחקרי אלקטרו על עצבי הנשה עכבר in vivo.
החיות מורדמים עם isoflurane כדי להבטיח שיכוך כאבים לעכברים שנבדקו וללא הפרעת סביבת עבודה במהלך המדידות שתיקחנה בערך 30 דקות / בעלי חיים. טמפרטורת גוף קבועה של 37 ° C מתוחזק על ידי צלחת חימום והיא נמדדת באופן רציף על ידי בדיקה רקטלית תרמו 2. בנוסף, רל (אק"ג) נרשם באופן שיגרתי במהלך המדידות על מנת לפקח על המצב הפיזיולוגי של בעלי החיים נחקרים ברציפות.
קלטות אלקטרו מבוצעות על העצב השת, העצב הגדול ביותר של הדואר מערכת עצבים היקפי (PNS), המספקת את הגפיים האחוריות עכבר עם קטעי סיבים הן מוטוריים וחושיים. בפרוטוקול שלנו, עצבי הנשה יישארו באתר ולכן לא צריכים להיות חילוץ או חשוף, המאפשרים מדידות ללא כל גירויים עצביים שליליים יחד עם הקלטות בפועל. באמצעות אלקטרודות מחט מתאימות 3 לבצע את שני הפרוקסימלית וגירויים עצביים דיסטלי, הרשמה הפוטנציאלים מועברים עם אלקטרודות חישה בשרירי הגסטרוקנמיוס. לאחר עיבוד הנתונים, אמין וערכים עקביים ביותר עבור מהירות ההולכה העצבית (NCV) ופוטנציאל הפעולה מוטורית המורכב (CMap), הפרמטרים המרכזיים לכימות של תפקוד עצבים היקפי ברוטו, יכולים להיות מושגת.
מבוא
מדידות אלקטרו הן כלי הכרחי לחקירה את השלמות הפונקציונלית של עצבים היקפיים בשתי סביבות קליניות ומעבדתיים. בבני אדם, במספר רב של הפרעות ונוירופתיה התוקפת אבחנה מסתמך על מדידות אלקטרו. על ידי מדידת תכונות עצב כמהירות הולכה או אמפליטודות פוטנציאל של האות, ניתן לאפיין את המקור הגס של מחלות עצבים היקפיים.
מהירות ההולכה העצבית תלויה מאוד בהתפשטות אותות מהירה מופעלת על ידי myelination. לכן, תהליכי demyelinating בדרך כלל להראות ירידת מהירויות הולכה 4. פוטנציאל מתחם פעולת מנוע (CMap) - מקשר עם מספר אקסונים פונקציונליים - הוא אינדיקטור לנזק באקסון כאשר צמצמו באופן משמעותי 5.
כך, באמצעות שיטות אלקטרו אטיולוגיה של נזק עצבי היקפייכול להיות מופלה, כמו לנוירופתיה תורשתית 6,7, נוירופתיה סוכרתית 8,9, polyneuropathies הכרוני דלקתי demyelinating (CIDP) 10, או נוירופתיה טבולי 11.
בדרך כלל, ביישום האנושי הקלטות פולשנית על העצב האולנרי sural או עדיפות. בעכברים, זה פשוט לנתח מאפיינים עצביים של עצבים השת, העצב הגדול ביותר של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) המכילה את שני גדול - אקסונים קליבר הקטן של המערכת המוטורית וחושית ו.
ההליך כפי שמודגם כאן הוא שיטה מהירה, קלה ואמינה למדוד את כל הערכים סטנדרטיים הרלוונטיים לאלקטרופיזיולוגיה בעצבים היקפיים בעכבר ללא פגע. על ידי לקיחת הקלטות מהאורגניזם שהשתמר, תנאים פיסיולוגיים של סביבת העצב מובטחים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקר הנוכחי בוצע על פי חוק ההגנה על בעלי חיים של הרפובליקה הפדרלית של גרמניה (גרמניה המערבית דר Tierschutzgesetz Deutschland) ואושרה על ידי משרד מדינת תורינגיה לבטיחות מזון והגנת הצרכן (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. הגדרת המדידות
- להרדים את העכברים על ידי isoflurane / O 2 שאיפה - לחניכה של הרדמה 3%, לisoflurane 2% אחזקה ב100% חמצן (איור 1). לאשר הרדמה מספיק על ידי בדיקת רפלקסים פשוטים כמו רפלקסים תנועה ובדיקה של רגישות לכאב בדרגה נמוכה. שימוש במשחה בעיניים למניעת יובש במהלך ההרדמה מומלצת אך לא הכרחי משום שההליך בדרך כלל לוקח רק 30 דקות / בעלי חיים בסך הכל. במקרה של ניסויי הישרדות, לנהל זמן ארוך יותר משככי כאבים הפועלים לניהול כאב לאחר ניתוח.
- לגלח את הפרווה המכסה את הגפיים האחורי עם מכונת גילוח חשמלי ולבצע אפילציה עם שיער קרם להסרת זמין מסחרי בעוד בעלי חיים כבר תחת שיכוך כאבים. על מנת לשמור על מעמדו הפתוגן ללא כל ההליך, ללבוש כפפות אספטיים ותמיד להשתמש בכלים לנקות בזהירות עם 70% אתנול.
- בקרת יציבות טמפרטורת גוף על ידי צלחת משוב מבוקרת חימום ובדיקה רקטלית תרמו (איור 2). במידת צורך, השתמש בוילון סטרילי כדי לכסות את צלחת החימום בין בעלי החיים על מנת לשמור על סביבת סטרילית ניסיונית. יתר על כן, מומלץ להשתמש בצלחת חימום, הנשלטת באופן אלקטרוני באמצעות חיישן משולב להגביל את טמפרטורת החימום ל≤ 40 ° C על מנת למנוע נזק לרקמות.
איור 1. Expהתקנת erimental מראה עכבר הרדים עם גפיים אחוריות מגולחים. - קח electrocardiography הקלטות (אק"ג) כדי לפקח על קצב לב כפרמטר חיוני. התקן שלוש אלקטרודות להקלטות א.ק.ג. כדלקמן: אלקטרודה אחת מתחת לעור של כל forelimb ואלקטרודה אחת מתחת לעור באזור הצוואר.
- אלקטרודות טבעת מקום שימוש בג'ל קשר להתנגדות מוליכות / העברה אופטימלית. אלקטרודת החישה (מסומנת בשחור) ממוקמת במיקום שבו שריר הגסטרוקנמיוס יש קוטר המרבי שלו. אלקטרודה ההשוואתית (מסומנת באדום) ממוקמת בדיוק מתחת האלקטרודה החישה.
הערה: אנא ראה 'שולחן חומר' לפרטים ציוד. - סמן את העמדות הנכונות של מדידה עם מרחקים שנקבעו מראש אך עקביים בין הפרוקסימלית וגירוי עצב השת דיסטלי והאלקטרודה העופרת. הצעה ניסיונית: במרחק של 4 מ"מ מהאלקטרודה החישה, גירוי דיסטלי תתקיים.במרחק של 16 מ"מ להאלקטרודה החישה, הגירוי הפרוקסימלי יבוצע (איור 2).
איור 2. תמונת נציג מראה את המצב הניסיוני קצר לפני תחילת המדידות. הלבן החץ מציין את המיקום של החישה (השחורה) והתייחסות (אדום) אלקטרודה בשריר הגסטרוקנמיוס של הגפיים האחורי השמאלי. הגירוי על ידי אלקטרודות מחט יבוצע בעמדות שהוגדרו ביחס לאלקטרודת החישה השחורה. נקודת גירוי דיסטלי (סימן שחור עם "DS" בגפיים אחוריות משמאל) יש מרחק של 4 מ"מ מהאלקטרודה החישה; את מקומו של גירוי פרוקסימלי (סימן שחור עם "ps") הוא 16 מ"מ משם. הקו האדום על הגפיים אחוריות ימין מראה כ Imate כמובן האנטומי של העצב השת. יתר על כן, העמדות גסות של שרירי גפיים אחוריות רלוונטיים מוצגות כציוני דרך. הכוכבית מציינת תרמית הבדיקה רקטלית.
2. מדידה
- עיקרון: בצע סדרה של גירויים עצבים עם פולסים מרובעים גל אחד שנוצרו שוב ושוב של 0.1 משך אלפיות שני על ידי אלקטרודות monopolar חד פעמיות 28 G מחט (שיעור החזרה 200 אלפיות שני, ראה איור 3 א). לניתוח נתונים off-line, מומלץ לרכוש אותות גירוי בו זמנית יחד עם עקומת תגובת פונקצית התוקפת (איור 3 ב) עקב גירוי עצבי. ממוצע סדרה של תגובות מקסימליים ("תגובת נציג התוקפת פונקציה") לניתוח נתונים שלאחר מכן. על מנת לייצר נתונים מהימנים, להקליט ולפחות 3 עקומות מאוחר ממוצעת עצמאיות, אופטימליות תגובה לאתר גירוי ובעלי חיים.
"Src =" p_upload/51181/51181fig3highres.jpg / files/ftp_upload/51181/51181fig3.jpg "/>
איור 3. נוהל לרכישת נתונים וניתוח (מצגת סכמטית). פולסים נוצרו שוב ושוב מוחלים על העצב השת באמצעות אלקטרודות מחט (שורה העליונה באיור 3 א). במקביל, כמה עקומות תגובת התוקפת מקבילות נרשמות (בשורה תחתונה באיור 3 א). כאשר בממוצע ומוגדל, עקומות תגובת התוקפת בשל פולסים גירוי (שורה העליונה באיור 3 ב) להראות את התכונות הבאות האופייניות (בשורה תחתונה באיור 3 ב): Latency של תגובת האות כמו גם משך והמשרעת של האות מצוינות ויכולים ניתן להשיג לצורך חישובים וסטטיסטיקות שלאחר מכן. הולכה אות לא סדירה ו / או הקלטות לא טובים בדרך כלל התוצאה של עיוותים אות שונות עם יותר מאשר רק אחת חיובי ואחת שלילית סטיה או עיוות אות(צורת bimodal) עם משרעת מופחתת (איור 3 ג). - לבצע גירוי הפרוקסימלי עם אלקטרודה מחט בעמדה נחושה ("ps" באיור 2).
- על מנת להשיג תנאי הקלטה הטובים ביותר עם אמפליטודות מקסימום, לדמיין את עקומות תגובה בפועל בו זמנית לתהליך הגירוי. בעשותם כך, הנסיין הוא מסוגל להעריך את הצורה של עקומות התגובה, כמו גם את הגודל של משרעת באופן מיידי.
- במידת צורך, מעט ובזהירות לתפעל את העמדה ו / או את הזווית של המחט ביחס לגירוי העצב הסכיאטי. אופטימיזציה עדינה זה של תנאי גירוי מאפשרת להגיע לאמפליטודות מתמיד עם הערך הגדול ביותר האפשרי ועקומת תגובה של צורת biphasic טיפוסית (איור 4).
- לבצע גירוי דיסטלי עם אלקטרודה מחט בעמדה נחושה ("DS" באיור 2).
- לאחר completion של מדידה, להעביר את העכבר נבדק לכלוב נפרד עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על עינת חזה. אל תשאיר את בעלי חיים ללא השגחה ובחברתם של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. לנהל בזמן ארוך יותר משככי כאבים הפועלים לניהול כאב לאחר ניתוח. ניהול מערכתי של תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs) ואופיואידים מומלצים ל1-3 ימים.
- לחלופין, להקריב את העכבר עדיין מורדם בצורה מהירה ואנושית ללא כל כאב נוסף לבעלי החיים, למשל על ידי נקע בצוואר.
איור 4. איור כדי לקבוע את הקלטות CMap עם אמפליטודות מקסימום. סדרה להשלים את הרישום מוצגת. ( ) עם תגובת CMap מינימאלית. (ב) תוצאות תנועת מחט גירוי קל בהקלטות CMap עם אמפליטודות מקסימום. (ג) שינויים נוספים במיקום מחט לייצר הקלטות CMap עם אמפליטודות שונות כולל אמפליטודות כמעט מרבי. החלפה (ד) גירוי מחט עם הקלטות CMap סידוריים של אמפליטודות כמעט מרביים. הערה: מפחית אופייני באמפליטודות CMap יכול להתרחש במהלך גירוי חוזר על עצמו באתר אופטימלי גירוי 12, 13. כוכביות מציינות הקלטות CMap עם אמפליטודות מקסימום מתוארות למיצוע.
3. ניתוח
- לחלץ פרמטרים הולכה עצביות המבוססים על סט נציג התוקפת תגובת פונקצית נתונים באמצעות חבילת תוכנה מתאימה (למשל AtisaPro).
הערה: נא לטפל בנחישות נתונים הקשורים לזמן עם טיפול מיוחד בגלל נחישות נקודת פיתול של סיר פעולת מנוע מתחםתחילת ential (CMap) והפסקה יכולות להיות קשות. הליך עם שחזור אימת ניתן באיור 3 ב, שבו סיפורי מעשיות על סטיות אות לאחר הופעה ולפני הסיום נמצאים בשימוש. - לחשב 'חביון אות' וערכי 'CMap'.
- חביון 'מייצג את השהיית הזמן בין הגירוי והופעת CMap, בעוד שמשך הזמן בין תחילת מחנה של סטיה שלילית ראשונית ראשוני חזרה לנקודת ההתחלה נקראת' משך CMap '. השתמש בהבדל בין שיהוי דיסטלי ופרוקסימלי לחישוב מהירות הולכה יחד עם המרחק בין אתרי גירוי דיסטלי ופרוקסימלי.
מהירות הולכה = חביון / מרחק בין אתרי גירוי - המשרעת CMap '(פוטנציאל פעולה מוטורי מתחם) מייצגת את הגודל בין נקודת תפנית חיובית ושלילית המקסימלי של אות CMap (ניתנה בmV).
"נקודת התפנית החיובית 'CMap = ערך - פו התפנית השלילי" הערךint '
- חביון 'מייצג את השהיית הזמן בין הגירוי והופעת CMap, בעוד שמשך הזמן בין תחילת מחנה של סטיה שלילית ראשונית ראשוני חזרה לנקודת ההתחלה נקראת' משך CMap '. השתמש בהבדל בין שיהוי דיסטלי ופרוקסימלי לחישוב מהירות הולכה יחד עם המרחק בין אתרי גירוי דיסטלי ופרוקסימלי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ערכנו סדרה של in vivo מדידות אלקטרו על עצבי הנשה של 12 עכברים בסך הכל במחקר זה: 6 בעלי חיים של כל מין. המדידות בוצעו עם הפרוטוקול שהוצג ונמסרו התוצאות הבאות:
שני עכברי זכרים ונקבה להציג מהירות ממוצעת הנשה הולכה העצבית של כ 20 מ '/ שנייה (איור 5). זה עולה בקנה אחד עם מדידות אחרות בספרות. יתר על כן, זה מראה שאין הבדלים רלוונטיים במהירות הולכה עצבית בין זכרים ונקבות על פי הנתונים ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר מספק שיטה קלה ואמינה כדי לקבוע מאפייני הולכה עצב השת בעכברים מורדמים ללא הצורך לחשוף את העצב של עניין. עם זאת, הליך ניסיוני זה גורם לפגיעה ברקמות על ידי נקב מחט. לכן אפשרות סבירה להקריב בעלי החיים לאחר שסיים את ההקלטות. עם זאת, בהשוואה לפרוצדורות פולשניות יותר אחרות, שדורשות החשיפה של העצב לפני הקלטות, נזק לרקמות היא comparably קטן 3,14. לכן, מדידות חוזרות ונשנות הן אפשריות ותלויות בעיצוב של המחקר, בהתאמה. עם זאת, בנקודות מסוימות צריכים להיחשב כדי להבטי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי 604 SFB, DFG MO 1421/2-1 וKrebshilfe 107,089 (לHM). AS הוא נמען בפרס חוקר צעיר של מגידול הילדים קרן (ניו יורק, ארה"ב).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אלקטרודות מחט קונצנטריות (גירוי) | Natus Medical Incorporated, סן קרלוס, קליפורניה, ארה"ב | 9013S0901 | |
| אלקטרודות טבעת דיגיטליות (הקלטה) | Natus Medical Incorporated, סן קרלוס, קליפורניה, ארה"ב | 9013S0302 | |
| ToM - מגדל מדידה (ממיר A/D) | GJB Datentechnik GmbH, Langewiesen, גרמניה | ||
| AtisaPro, תוכנה לרכישת וניתוח נתונים | GJB Datentechnik GmbH , Langewiesen, גרמניה | ||
| HSE-Stimulator T | Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, גרמניה |
מקורות
- Kimura, J. 3rd ed. Electrodiagnosis in Diseases of Nerve and Muscle. , Oxford University Press. (2001).
- Rutkove, S. B. Effects of temperature on neuromuscular electrophysiology. Muscle Nerve. 24, 867-882 (2001).
- Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data. Muscle Nerve. 41, 850-856 (2010).
- Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations. Muscle Nerve. 19, 946-952 (1996).
- Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles. Muscle Nerve. 18, 402-408 (1995).
- Pareyson, D., Scaioli, V., Laura, M. Clinical and electrophysiological aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromol. Med. 8, 3-22 (2006).
- Schulz, A., et al. Merlin isoform 2 in neurofibromatosis type 2-associated polyneuropathy. Nat. Neurosci. 16, 426-433 (2013).
- Lamontagne, A., Buchthal, F. Electrophysiological studies in diabetic neuropathy. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 33, 442-452 (1970).
- Andersen, H., Nielsen, J. F., Nielsen, V. K. Inability of insulin to maintain normal nerve function during high-frequency stimulation in diabetic rat tail nerves. Muscle Nerve. 17, 80-84 (1994).
- Magda, P., et al. Comparison of electrodiagnostic abnormalities and criteria in a cohort of patients with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch. Neurol. 60, 1755-1759 (2003).
- Lindberg, R. L., et al. Motor neuropathy in porphobilinogen deaminase-deficient mice imitates the peripheral neuropathy of human acute porphyria. J. Clin. Invest. 103, 1127-1134 (1999).
- Massey, J. M. Electromyography in disorders of neuromuscular transmission. Sem. Neurol. 10, 6-11 (1990).
- Stalberg, E., Falck, B. The role of electromyography in neurology. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 103, 579-598 (1997).
- Osuchowski, M. F., Teener, J., Remick, D. Noninvasive model of sciatic nerve conduction in healthy and septic mice: reliability and normative data. Muscle Nerve. 40, 610-616 (2009).
- Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice. Neurosci. Lett. 483, 127-131 (2010).
- Dilley, A., Lynn, B., Pang, S. J. Pressure and stretch mechanosensitivity of peripheral nerve fibres following local inflammation of the nerve trunk. Pain. 117, 462-472 (2005).
- Vleggeert-Lankamp, C. L., et al. Electrophysiology and morphometry of the alpha- and beta-fiber populations in the normal and regenerating rat sciatic nerve. Exp. Neurol. 187, 337-349 (2004).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
