מאמר שיטה

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך ג elegans עובר

DOI:

10.3791/51188

⸱

12 במרץ 2014

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה בעוברי elegans Caenorhabditis. בעוד כמה פרוטוקולים מתארים כיצד חלוקת תאי תמונה בעובר המוקדם, פרוטוקול זה מתאר כיצד תמונת חלוקת תאים בתוך רקמה מתפתחת במהלך embryogenesis אמצע סוף.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי לתמונת חלוקת תאים בתוך פיתוח עוברי elegans Caenorhabditis. בפרט, פרוטוקול זה מתמקד איך תמונת חלוקת neuroblasts, אשר נמצאים מתחת לתאי האפידרמיס ועשוי להיות חשוב עבור המורפוגנזה אפידרמיס. היווצרות רקמה חיונית לפיתוח מטזואניים ומסתמכת על רמזים חיצוניים מרקמות שכנות. ג elegans הוא אורגניזם מודל מצוין ללמוד המורפוגנזה רקמות in vivo בשל השקיפות שלה וארגון פשוט, מה שהופך את הרקמות שלה קלים ללמוד באמצעות מיקרוסקופ. מתחם הגחון הוא התהליך שבו פני השטח הגחון של העובר הוא מכוסה על ידי שכבה אחת של תאי האפיתל. הוא חשב את האירוע הזה כדי להיות בהנחייתם של neuroblasts הבסיסית, המספק רמזי הדרכה כימית לתווך הגירה של תאי האפיתל שמעליה. עם זאת, neuroblasts הן שגשוג מאוד וגם עשויה לפעולכמצע מכאני לתאי האפידרמיס הגחון. מחקרים באמצעות פרוטוקול ניסוי זה יכול לחשוף את חשיבותה של תקשורת בין תאית במהלך היווצרות רקמות, ויכולים לשמש כדי לחשוף את תפקידם של גנים הקשורים בחלוקת תאים בתוך רקמות מתפתחות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אמנם יש פרוטוקולים המתארים כיצד לחלוקת תא תמונה בתחילת ג עובר elegans, פרוטוקול זה מתאר כיצד חלוקת תא תמונה בתוך רקמות במהלך אמצע העובר. אחד האתגרים הגדולים בתחום ההדמיה אורגניזמים במהלך הפיתוח היה רגישותם לphototoxicity. עם זאת, נגישות מוגברת למיקרוסקופי confocal הדיסק מסתובב או מיקרוסקופים שדה סחפו התירה יישומי הדמיה נפוצים יותר. שני מערכות משתמשות בלייזרים של מצב מוצקים ואור מפוזר, המגבילים את הרמות של UV שאורגניזמים נחשפים אליהן. עם זאת, דוכני Widefield עדיין יכולים לשמש הדמיה in vivo, במיוחד אם הם לבוש עם מצלמות עם רגישות גבוהה (למשל EMCCD), בקרת צמצם ושליטה אור (למשל נוריות או נורות כספית להתאמה). פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש באחת מערכת confocal מבוסס או מערכת widefield לחלוקת תא תמונה בתוך פיתוח ג elegans </ Em> עוברים. כדוגמא, נתאר כיצד תמונת חלוקת תא neuroblast. Neuroblasts עשויה להקל המורפוגנזה אפידרמיס על ידי מתן אותות כימיים או מכאניים לתאי האפידרמיס שמעליה, ומספקת דוגמא מצוינת לחשיבות של תקשורת בין תאית ביצירת רקמות.

elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם מודל אידיאלי למחקרים מבוססי מיקרוסקופיה בשל השקיפות שלה וארגון של רקמות פשוטות 1. יתר על כן, ג elegans ניתן לשיטות גנטיות וRNAi, ומאז יש לי רבים מהגנים שלו homologues האנושי, זה יכול לשמש כדי לזהות מנגנוני שימור להיווצרות רקמת 2-5. בג elegans, היווצרות של האפידרמיס מתרחש במהלך אמצע העובר, כאשר לעובר> 300 תאים. המורפוגנזה עוריות מורכבת מכמה שלבים עיקריים, שבמהלכו העובר מוקף בשכבה של תאי האפידרמיס שלהצר ולהרחיב להפוך embrיו מצורת ביצה לצורה המוארכת של תולעת 6. מתחם הגחון מתאר את אחד אירועי morphogenetic אלה, כאשר תאי האפידרמיס הגחון נודדים לכיוון קו האמצע הגחון כדי לכסות את פני השטח הגחון של העובר (איור 1). ראשית, שני זוגות של תאים החדשניים קדמי ממוקם נודדים לכיוון קו אמצע הגחון, שבו הם דבקים והפתיל עם שכניהם נגדי 6. זה ואחריו הגירה של תאי כיס האחוריים ממוקם, המהווים טריז כמו צורות יצירת כיס הגחון 6-7. המנגנון שסוגר את הכיס אינו מובן היטב. אפשרות אחת היא שמבנה התכווצות שרירן אקטין supracellular קושר את תאי הכיס יחד במחרוזת ארנק כמו אופנה, בדומה לריפוי פצעים 8. מעניין לציין, כי הגירתם של חלק מתאי הכיס מתווכת על ידי תת ספציפי של neuroblasts בסיס 9 (מבשרי נוירונים שנמצאים מתחת לepidermis; איור 1).

מחקרים קודמים הראו כי neuroblasts לווסת את הגירת הגחון אפידרמיס תא ומתחם הגחון. VAB-1 (קולט ephrin) ו( יגנד ephrin) VAB-2 באים לידי ביטוי מאוד בneuroblasts ולהקל על מיון הקדמי והאחורית neuroblasts אחד מהשני, ו מוטציות במתחם הגחון סיבת VAB-1 או VAB-2 פנוטיפים 10-13. עם זאת, ניסויי הצלת אמרגן הראו כי VAB-1 נדרש גם בתאים שמעל הגחון אפידרמיס וקולטנים לאותות הנחיה אחרים מופרשים על ידי neuroblasts באים לידי ביטוי בתאי האפידרמיס הגחון 9. למרות שמוטציות בכל של קולטנים אלה גורמים לפנוטיפים מתחם הגחון, שלא ברור אם פגמים להתעורר עקב בעיות במיקום neuroblast או עקב כישלון של תאי האפידרמיס הגחון להגיב להדרכת רמזי 14. לשנות את חלוקת wi neuroblastsגם בלי להשפיע על היכולת שלהם להפריש רמזי הדרכה יכול לשפוך אור על התפקיד של neuroblasts והיכולת שלהם לספק קלט מכאני במהלך המורפוגנזה אפידרמיס. לאחרונה, נמצא כי גן חלוקת תא, ani-1 (anillin) מתבטא מאוד בneuroblasts (איור 2 א) ודלדולה גורם למומי חלוקת neuroblast. מעניין לציין, כי העוברים האלה להציג פנוטיפים מתחם הגחון (Fotopoulos, Wernike וPiekny, תצפיות לא פורסמו).

Anillin נדרש לחלוקת תאים, ובמיוחד עבור cytokinesis, המתאר את התהליך שבו תא האם מחלק פיזי לשני תאים בת. Cytokinesis הוא מונע על ידי היווצרות של טבעת התכווצות actomyosin, אשר צריך להיות מבוקר היטב בחלל ובזמן כדי לוודא שהוא מצמידים כראוי עם הפרדה chromatid האחות. הרגולטור הראשי של cytokinesis מטזואניים הוא RhoA (RHO-1 ב C. elegans), GTPase קטן שהואctive בצורה מאוגד GTP. GEF Ect2/ECT-2 מפעיל RhoA, לאחר שRhoA-GTP אינטראקציה עם effectors מורד הזרם היוצרות את טבעת ההתכווצות ולתווך ingression 15. Anillin הוא חלבון תחום רב שנקשר לRhoA באמצעות C-הסופית שלה ויקטין ומיוזין באמצעות N-הסופית שלה. Anillin נדרש כדי לייצב את עמדתה של טבעת ההתכווצות בתאי יונקים או דרוזופילה S2 16. דלדול Anillin גורם טבעות התכווצות לעבור תנודות לרוחב, וסופו של דבר נכשל cytokinesis יוצר תאים multinucleate 17-19. מעניין לציין, כי למרות שג elegans ani-1 מתאם את התכווצות actomyosin בעובר המוקדם, זה לא חיוני לcytokinesis. עם זאת, כפי שתואר לעיל, נדרש ani-1 לcytokinesis neuroblast במהלך אמצע העובר (Fotopoulos, Wernike וPiekny, תצפיות לא פורסמו). כישלון cytokinesis ישנה את המספר והמיקום של neuroblasts ועלול להשפיע על locע אותות הנחיה כימיים, או שזה יכול לשנות את התכונות מכאניות של הרקמות. שני הדגמים להדגיש את תפקיד nonautonomous של neuroblasts למתחם הגחון, ואת החשיבות של תקשורת רקמות רקמות במהלך התפתחות עוברית.

פרוטוקול ניסוי זה מתאר כיצד חלוקת תא תמונה במהלך ג elegans אמצע עובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. רוב ניסויי חקר המנגנונים של חלוקת תא בוצעו בתאים בודדים בתוך מנות תרבות (למשל. הלה או תאי S2) או בעוברים מוקדמים עם מספר מוגבל של תאים (לדוגמא C. elegans עובר אחד תאים, Xenopus, או echinoderm עוברים). עם זאת, חשוב גם ללמוד חלוקת תאים בתוך רקמות, שכן יש רמזים חיצוניים שיכול להשפיע על העיתוי ומיקום של מטוס החטיבה. יתר על כן, תאים עשויים לספק רמזים כימיים או מכאניים כדי להשפיע על ההתפתחות של רקמה השכנהים, וזה חשוב להבין כיצד תקשורת בין תאית מסייעת רקמות כדי ליצור במהלך פיתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת צלחות לשמירה על זני תולעת וביצוע RNAi

  1. צלחות צמיחה נמטודות מדיה
    1. צלחות
      1. הכן את צלחות צמיחה נמטודות מדיה (NGM) כדי לשמור על זני תולעת ולבצע צלבים גנטיים. שלב 3 גרם NaCl, 17 גרם אגר ו2.5 BactoPeptone גרם עם 1 ליטר של מים מזוקקים בבקבוק 2 ליטר ולהוסיף סרגל ערבוב מתכת.
      2. החיטוי הבקבוק כדי לפזר את אגר ולעקר את התקשורת. לאחר מכן הנח את הבקבוק על צלחת ומערבבים ולאפשר התקשורת כדי לקרר תוך כדי ערבוב.
      3. ברגע שהתקשורת התקררה, והוא עדיין מעט חם למגע (45-50 ° C), להוסיף 1 מיליליטר 1 M CaCl 2, 1 מיליליטר 1 M MgSO 4, פתרון 1 מיליליטר של 5 כולסטרול מ"ג / מיליליטר ו25 מיליליטר 1 M חיץ פוספט אשלגן (PPB; מתכון בטבלה של חומרים כימיים / חומרים; מסנן לעקר פתרונות מניות) ויוצקים מייד את התקשורת לתוך צלחות פטרי קטנות (60 מ"מ x 15 מ"מ; למלא את הצלחות ~ 3/4 לחלק העליון או 13 מיליליטר / צלחת USIng מתקן אוטומטי). הערה: לתחזוקה ארוכת טווח של כמה טטרציקלין זנים ניתן להוסיף לצלחות (12.5 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי לאפשר איון transposon Tn10 של גן RNAse III חיידקים.
      4. בואו לחזק את התקשורת בין לילה בטמפרטורת חדר. הערה: יש לשמור צלחות במנדף ביולוגי או באזור של המעבדה כי הוא נוטה פחות לזיהום. כמו כן, להסיר כל עיבוי שבנה על העפעפיים (למשל נקיים עם נייר טישו) להגביל פטרייתי זיהום. אם טטרציקלין יתווסף גם לצלחות, ואז לכסות אותם עם נייר אלומיניום כאנטיביוטיקה זו היא רגישה לאור.
      5. למחרת, זרע צלחות NGM היבשה עם השעיה של א ' coli (זן OP50, ראה סעיף 1.1.2), כי כבר vortexed בעדינות. כדי להפוך את הצלחות להזדווגות, להוסיף ~ 50 μl של OP50 למרכז כל צלחת (כדי ליצור עיגול קטן). כדי להפוך את הצלחות לשמירה על זני תולעת, זרע כל צלחת NGM עם ~ 100-200 μl של OP50 (ללהבטיח שהוא מכסה שטח גדול יותר של הצלחת).
      6. בואו צלחות זרע O היבש / N בטמפרטורת חדר.
      7. למחרת, לפנות צלחות NGM המיובשים במהופך ולערום אותם במיכלי אחסון מפלסטיק ב 4 ° C. הערה: לוחות שמישים עד ~ 3-4 שבועות. צלחות המכילות טטרציקלין צריכים להיות כל הזמן בחושך.
    2. מזון
      1. השתמש E. coli OP50 [מהמרכז לגנטיקת Caenorhabditis (CGC; http://www.cbs.umn.edu/cgc)] כמקור מזון לג . Elegans הערה: OP50 ניתן לאחסן כמו מניות גליצרול ב-80 ° C (1:1 ב50% גליצרול V / V).
      2. כדי להפוך OP50 לצלחות NGM, להפוך את צלחת פס באמצעות aliquot קטן של מניית גליצרול (<10 μl; להשתמש קצה פיפטה סטרילית). מורחים את החיידקים על צלחת LB אגר (מתכון בטבלה של חומרים כימיים / חומרים) ולהשאיר אותו ב37 מעלות צלזיוס במשך שעה ~ 16. הערה: אם יש בעיות עם זיהום, ניתן להשתמש OP50 עמיד סטרפטומיצין,nd סטרפטומיצין ניתן להוסיף לצלחות LB אגר (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
      3. למחרת, פיק מושבה אחת ולחסן של תקשורת LB נוזלית (מתכון בטבלה של חומרים כימיים / חומרים) 100 מיליליטר בבקבוק 500 מיליליטר.
      4. בואו התרבות לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
      5. למחרת, השתמש בהשעית החיידקים לזריעת צלחות NGM. הערה: ניתן aliquoted OP50 ב50 צינורות חרוטי מ"ל ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס ל~ 4-6 שבועות.
  2. RNAi
    האכלה היא אחת הדרכים העיקריות לבצע התערבות בתיווך RNA (RNAi; למציאת מוצר גן ספציפי) בג elegans. ג יכולים להיות מוזנים הרמפרודיטים elegans E. זן חיידק HT115 הפך עם וקטור האכלה המבטא dsRNA על אינדוקציה. dsRNA זה (או שברים שלו) מועבר לבלוטת המין, בדרך כלל כתוצאה מכך מציאה משמעותית של יעד הגן הספציפי.
    1. צלחות RNAi
      1. הכן את צלחות NGM כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 1.1.1), אלא גם להוסיף 1 מיליליטר של 1 M IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside; כדי לגרום לביטוי של dsRNA) ו500 μl של 50 מ"ג / מיליליטר אמפיצילין (Amp; הווקטורים להביע dsRNA הם Amp עמיד) לתקשורת החמה (45-50 ° C).
      2. לאחר הצלחות התייבשו, זרעם עם ~ 50-100 μl של E. coli HT115 (ראה סעיף 1.2.2). הערה: ניתן לאחסן צלחות unseeded על 4 מעלות צלזיוס במשך ~ 4-5 שבועות.
      3. בואו צלחות זרע הייבוש למשך הלילה בטמפרטורת חדר.
      4. למחרת, לפנות את צלחות RNAi המיובשים במהופך ולאחסן אותם במכל אחסון מפלסטיק ב15-20 ° C. הערה: צלחות זורעים לשמור על יעילות RNAi לעד ~ 2-3 שבועות.
    2. RNAi מזון
      1. השתמש E. coli HT115 (מCGC, ראה סעיף 1.1.2) הפך עם L4440 האכלת הווקטור, או L4440 המכיל cDNA לגן של עניין. הערה: האכלת ספריות המתמקדות ברוב מסגרות קריאה פתוחות בגנוםכבר עשה והם זמינים (שיבוטים בL4440 הפכו לHT115; למשל מכיל בר מY49E10.19 לani -1 20-21;. http://www.gurdon.cam.ac.uk/ ~ ahringerlab / דפים / Rnai.html). הערה: אפשר לשמור HT115 כמו מניות גליצרול ב-80 ° C (1:1 ב50% גליצרול V / V).
      2. כדי ליצור מבנה חדש מיקוד גן של עניין, ראה את מפת L4440 הווקטור וcDNA שיבוט בין היזמים T7 איגוף, שהם מתנהלת על ידי IPTG.
      3. להפוך HT115 עם מבנה L4440 באמצעות פרוטוקול סטנדרטי לשינוי (למשל להפוך את החיידקים כימיים המוסמכים ולבצע שינוי הלם חום).
      4. כפי שתואר לOP50 (ראה סעיף 1.1.2), חיידקי פס ממניות גליצרול על צלחת אגר LB, אבל את הצלחת צריכים להכיל גם 50 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין. הערה: אם אתם משתמשים במבנה L4440 קיים מראש, דלגו סעיפים 1.2.2.2-1.2.2.3.
      5. פיק מושבה אחת ולחסן 5 מיליליטרשל תקשורת LB המכילה 5 μl של אמפיצילין מ50 מ"ג / מיליליטר מניות (LB Amp), ולמקם אותו על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
      6. לאחר ~ 16 שעות, לחסן 5 מיליליטר של תקשורת LB Amp הטרי עם 50 μl של התרבות O / N ולצמוח התרבות ל7-8 שעות עם רעד ב37 ° C.
      7. צנטריפוגה החיידקים 1 דקות ב4,000-8,000 XG, לבטל את supernatant ו resuspend את הכדור ב 500 μl של תקשורת LB Amp הטרי.
      8. השתמש פתרון חיידקים זה זרע צלחות RNAi כפי שתואר לעיל (ראה סעיף 1.2.1). הערה: יש להשתמש HT115 באופן מיידי ולא צריך להיות מאוחסן.

2. טיפוח זני תולעת

לשמור על ג זני elegans הזמינו מCGC על צלחות NGM על פי פרוטוקול סטנדרטי 1. זנים המשמשים לפרוטוקול זו כוללים: ג elegans var בריסטול, wild-type (מזהה מתח בCGC N2); UNC-119 (tm4063); wgIs102 [חזיר-1 :: TY1 :: EGFP :: 3xFLAG + UNC-119 (+)] (זיהוי מתח בCGC OP102); UNC-119 (ed3); ltIs44pAA173 [עוגה-1P-mCherry :: PH (PLC1delta1) + UNC-11 9 (+)] (זיהוי מתח בCGC OD70); AJM-1 (ok160); jcEx44 [GFP AJM-1 :: + רול -6 (su1006)] (זיהוי מתח בCGC SU159); UNC-119 (ed3) ; XnIs96 [pJN455 (HMR-1 :: ה-GFP HMR-1P :: :: UNC-54 3'UTR + UNC-119 (+)] (זיהוי מתח בCGC FT250).

  1. פיק ~ 3 הרמפרודיטים מבוגרים צעירים המציגים את הפנוטיפ הנכון לצלחת NGM טרי. הערה: N2 (var. בריסטול; wild-type) יכול להישמר בין 15-25 ° C, אבל הם יגיעו לצפיפות מהר יותר בטמפרטורות גבוהות יותר. מניות חדשות צריכה להתבצע כאשר צפיפות התולעת היא גבוהה.
  2. שמור את כל זני הניאון (למשל ה-GFP ו / או תולעי mCherry-להביע) ב-C ° 20-25 לביטוי אופטימלי של חלבוני ניאון. מניות חדשות צריכה להתבצע כאשר צפיפות התולעת היא גבוהה ואוכל הוא נמוך.
  3. לאסוף תולעים, להשתמשלקחת עשויה מזכוכית פיפטה משכה עם חוט פלטינה התמזגו בסוף משך (~ 3-5 סנטימטר באורך). שטח את החוט עם קצה חלק. השתמש בבחירה ל'סקופ 'עד הרמפרודיטים ולהעביר אותם לצלחות חדשות. להבת החוט בין השימוש כדי למנוע זיהום צולב של זנים.

3. RNAi

  1. ביצוע RNAi
    1. ראשית, מקום ~ 8 הרמפרודיטים L4 על צלחת NGM unseeded ל~ 30-60 דקות כדי להסיר את חיידקי OP50 מהתולעים.
    2. לאחר מכן למקם את הרמפרודיטים 8 על גבי צלחת NGM Amp IPTG זרע עם HT115 שנושאת את הפלסמיד L4440 להביע dsRNA לגן של עניין (למשל ani-1;. לראות 1.2) ל~ שעה 24. הערה: בהתאם לגן של עניין, או פנוטיפים הרצויים (שעשוי להיות תלוי בכוחו של מציאה), ניתן להשאיר תולעים על צלחות RNAi לתקופות קצרות או ארוכות יותר של זמן (לאחר 24 שעות, הניחו את הרמפרודיטים על RNAi הטרי צלחות).
    3. לנגשליטת ative, תולעי מקום על צלחת RNAi זרע עם HT115 נושא את וקטור L4440 הריק. הערה: עוברים אלה צריכים שום פנוטיפים.
    4. לביקורת חיובית, למקם את התולעים על צלחת RNAi להביע dsRNA כי מטרות גן עם פנוטיפים מאופיינים היטב. הערה: לקבלת Rho-1 (Y51H4A.3), עוברים הם 100% קטלניים לאחר 24 שעות והרמפרודיטים הם סטרילי לאחר 48 שעה.
  2. יעילות RNAi
    הרמות של מציאה ידי RNAi צריכים להיבדק, במיוחד מאז כמה רקמות עשויות להיות עמידות יותר מאחרים. במהלך בתחילת אמצע העובר, רוב הרקמות הן RNAi רגישות, אבל בעובר מאוחר או הזחל, הנוירונים הם RNAi עמידים. זנים שונים יכולים לשמש כדי לשפר את רגישות RNAi (למשל rrf-3), או כדי ליצור רקמות ספציפיות RNAi (למשל sid-1 בשילוב עם transgene הביע על ידי האמרגן UNC-119 העצביים).
    1. סופג מערבי
      Immunoblotting באמצעות ג elegans חלבונים יכולים להיותמבוצע על פי פרוטוקול סטנדרטי 22.
      1. לאחר ביצוע RNAi, לאסוף ~ 10 הרה להולדת (מלאים בעוברים) הרמפרודיטים בצינור microcentrifuge, להוסיף 20-30 חיץ μl 1x-SDS מדגם וlyse על ידי רתחה במשך 2 דקות ~. באופן דומה, לאסוף תולעי N2 בצינור נפרד למדגם השליטה. שים לב: מספר הרמפרודיטים עשוי להשתנות תלוי ברגישות של הנוגדנים הראשוניים.
      2. צור דילולים של מדגם השליטה (למשל 3-100%) במאגר מדגם. טען את השליטה ודגימות RNAi ומנוהל על ידי SDS-PAGE לפי פרוטוקול סטנדרטי (ג'ל% ישתנה בהתאם לגודל של החלבון של עניין).
      3. העבר את הג'ל לממברנה ולבצע immunoblotting לפי פרוטוקול סטנדרטי. הערה: דילולים ראשוניים ומשניים שונים השתמש בנוגדן כמומלץ לכל נוגדן.
      4. לפתח (למשל, אם באמצעות chemiluminescence) או לסרוק (למשל, אם באמצעות הקרינה) immunoblot ולהשוות הצפיפות דואר של להקות בנתיבי N2 לעומת מסלול RNAi, ולקבוע את רמת מציאה (למשל הצפיפות של מסלול RNAi תואמת את נתיב שליטת 12%, זה מצביע על כך שהחלבון הוא מופחת על ידי 88%). הערה: כדי לראות את היעילות של מציאה ANI-1, ראה מדוקס ואח' 23.
    2. Immunostaining
      Immunostaining בג ניתן לבצע elegans על פי פרוטוקול סטנדרטי 22.
      1. לאחר ביצוע RNAi, לאסוף הרמפרודיטים הרה להולדת עוברים וקציר באמצעות אחת משתי שיטות. לאחת מהשיטות, הרמפרודיטים המקום בחיץ M9 (מתכון בטבלה של חומרים כימיים / חומרים) ב1.5 מיליליטר siliconized microcentrifuge צינורות וגלולים באמצעות צנטריפוגה (1,000-4,000 XG). הערה: באופן דומה לאסוף N2 הרמפרודיטים הרה.
      2. הסר את פתרון M9.
      3. לגרש את העוברים על ידי הוספת 1 מיליליטר של תמיסת הלבנת (1 M NaOH, אקונומיקה 5%) ​​לצינור microcentrifuge במשך 3 דקות. באופן דומה, N2 אקונומיקה הואrmaphrodites לעשות שקופיות שליטה.
      4. מערבולת בעדינות, ולאחר מכן גלולה באופן מיידי את העוברים באמצעות צנטריפוגה (4,000-8,000 XG) ולהסיר את פתרון הלבנת. הערה: הזמן הכולל שהתולעים מודגרת עם אקונומיקה לא יעלה על 5 דקות.
      5. לשטוף את העוברים 3x עם טריס שנאגרו מלוח (TBS; 50 מ"מ טריס pH 7.5, 150 mM NaCl) ועוברי העברה באמצעות פיפטה פסטר זכוכית על פולי-L-ליזין מצופה שקופיות מיקרוסקופ. הערה: כדי מעיל שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם פולי-L-ליזין, לנגב את השקופית ראשונה, ולאחר מכן להוסיף טיפה (~ 20-30 μl) של פולי-L-ליזין ולהפיץ אותה באופן שווה על פני השטח ולתת להתייבש. לקבלת תוצאות אופטימליות, מעיל השקופיות שתי פעמים נוספות. שיטה חלופית כדי לאסוף עוברים (סעיפים 3.2.2.1-3.2.2.5) היא להציב ירידה של M9 על פולי-L-ליזין מצופה שקופיות מיקרוסקופ ולהרים ~ 10 הרמפרודיטים הרה להולדת לירידה.
      6. הוספת coverslip על גבי כל שקופית מיקרוסקופ (לאזור שמכיל את רוב העוברים) ומקוםהשקופיות בחנקן נוזלי. הערה: להרמפרודיטים ממוקמים ישירות לתוך הטיפה, להפעיל לחץ על coverslip לפרוץ את הרמפרודיטים ולגרש את העוברים.
      7. הקפאה לפצח את העוברים על ידי מצליף את coverslips מייד לאחר הקפאתן בחנקן נוזלי.
      8. מניחים את השקופיות במתנול הקרח קר עבור 20 דקות כדי לתקן את העוברים. הערה: לכמה אנטיגנים, מקבע crosslinking כגון paraformaldehyde עשוי להיות עדיף. ראה פרוטוקול מ22 Duerr.
      9. רעננות וpermeabilize את העוברים על ידי שטיפת השקופיות 4x עם טריס שנאגרו מלוח מכיל 20-Tween (TBST; 50 מ"מ טריס pH 7.5, 150 mM NaCl, Tween-20 0.1%) 10 דקות כל אחד.
      10. ייבש כל שקופית מסביב לאזור שמכיל את רוב העוברים וצייר עיגול סביב את העוברים באמצעות עט נוזל חסימה (למשל PAP עט).
      11. הוספה של TBST ~ 100 μl עם 5% בסרום חמור נורמלי (NDS; בלוק) לכל שקופית (אזור מוקף בעיגול) ודגירה20 דקות ב RT. הערה: מניחים את השקופיות ב'חדר רטוב "(למשל צלחת עם מכסה המכיל מגבות נייר רטובות).
      12. להסיר את החסימה, להוסיף ~ 50-100 μl של נוגדנים ראשוניים (בדילול מלא ב TBST) לכל שקופית (אזור מוקף בעיגול) ו דגירה עבור שעה 2 ב RT. הערה: בהתאם לנוגדן, זמן הדילול ודגירה עשוי להשתנות. כדי לזהות GFP, אנו משתמשים בנוגדן ראשוני אנטי-GFP אנטי עכבר בדילול 1/200. כדי לזהות ANI-1, אנו משתמשים באנטי ANI-1 נוגדן ראשוני נגד ארנב בדילול 1/1600 (הניתן באדיבות על ידי איימי Shaub מדוקס, UNC Chapel Hill). לפעמי דגירה ארוכות יותר, למקם שקופיות ב 4 ° C.
      13. הסר את הנוגדנים ראשוניים (במידת האפשר, לשמור לשימוש עתידי) ולשטוף שקופיות 3x עם כפות במשך 5 דקות כל אחד.
      14. הסר את השטיפה האחרונה ולהוסיף ~ 50-100 μl של נוגדנים משני (בדילול מלא ב TBST) לכל שקופית (אזור מוקף בעיגול) ו דגירה עבור שעה 2 ב RT. הערה: בהתאם לנוגדן, דילול עשוי להשתנות. כדי לזהות GFP, אנו משתמשיםאלקסה פלואוריד 488 נוגדנים משני NTI עכבר בדילול 1/250. כדי לזהות ANI-1, אנו משתמשים בפלואוריד אלקסה 568 שני נוגדנים נגד ארנב בדילול 1/250.
      15. שקופיות הסירו נוגדנים משני ולשטוף 3x עם כפות במשך 5 דקות כל אחד. הערה: כדי להכתים DNA, להוסיף ~ 50-100 μl של DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole; 1 מ"ג / מיליליטר) בשעה 1/500 דילול ב TBST למשך 5 דקות.
      16. הסר DAPI ולשטוף שקופיות 2x עם כפות במשך 5 דקות כל אחד. הערה: אם מכתים DAPI לא מבוצע, דלג על שלב שטיפה נוסף זו.
      17. לבצע שטיפה מהירה אחד עם 0.1M טריס (pH 9), להסיר ולהוסיף ~ 15 μl של תקשורת ההרכבה prewarmed 37 ° C (4% n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (gallate propyl), 50 מ"מ טריס, pH 9 ב 50% גליצרול) לכל שקופית (אזור מוקף בעיגול).
      18. הוספת coverslip לכל שקופית (על גבי תקשורת ההרכבה באזור המוקף בעיגול), פתיל את הנוזל העודף ולאטום את השקופיות עם לק. הערה: שקופיות ניתן לאחסן ב -20 ° C.
      19. שימו לב לעוברים עלהשקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield או לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal. חשוב מכך, להתאים את ההגדרות כדי לאסוף תמונות של עוצמת פיקסל אופטימלית באמצעות שליטת עוברים (N2 או אי RNAi). לאחר מכן, לאסוף תמונות מעוברי RNAi באמצעות אותן ההגדרות. דוגמאות לתמונות שנאספו ללעומת שליטה ani-1 עוברי RNAi מוצגים באיור 2.

4. הכנת השקופיות עבור הדמית חיה וקציר עוברים

  1. הכנה של רפידות agarose הדמיה חיה
    1. מקום שקופית נקי, טרום חימם מיקרוסקופ בין שתי שקופיות אחרות, כל אחד עם 1-2 רצועות של סרט עליהם.
    2. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, להוסיף טיפה אחת של 2% w / agarose v (מומס במים מזוקקים מחוממים) לשקופית.
    3. במהירות למקום שקופיות מיקרוסקופ שנייה, נקיות על גבי השקופית הראשונה באופן בניצב לשטח את ירידת agarose. הערה: הקלטת על השכנות החליקהes מספק עובי למשטח.
    4. בואו יבש כרית agarose לדקות 1-2 לפני הסרת השקופית העליונה. להחליק את השקופית העליונה בזהירות כדי למנוע שבירת כרית agarose מתחת. הערה: לפעמים הכרית מועברת לשקופית העליונה והיא עדיין אפשריים, כל עוד הוא נשאר בשלמותה.
    5. מעביר את העוברים על כרית agarose תוך מספר דקות לאחר הכנתו כמפורט להלן (ראה שלב 4.2). הערה: הכרית צריכה להיות מראה אטום, ברגע שזה ברור, הוא יבש מדי לשימוש.
  2. עוברי קצירה
    1. השתמש בפרוטוקול הבא לאיסוף עובר להדמית חיה, הנגזרת מSulston et al. 24
    2. פיק כ 4-6 מבוגרים הרה להולדת (לא רעבים) מצלחות NGM או RNAi ולמקם אותם ב20-30 μl של חיץ M9 בגם בשקופית דיכאון.
    3. השתמש באזמל מעוקר לחתוך את התולעים בכל צד של spermatheca (או לחלופין ליד הפות) ללשחרר את העוברים לתוך התמיסה.
    4. השתמש בצינור גומי עם חתיכה מחוברת לנימי זכוכית / פיפטה בפה משך לי שעמם קטן ולשאוב את העוברים על ידי הפה pipetting. לחלופין, לאסוף עובר עם צינור זכוכית נימים המחובר לנורת גומי פיפטה פסטר.
    5. מעביר את העוברים נשאבים לגם שני גם המכיל חיץ M9, כדי לעזור להפריד אותם מפסולת התולעת.
    6. לאחר מכן, שאיבת העוברים על כרית agarose מוכנה טרי (ראו שלב 4.1).
    7. עוברי גוש ביחד באמצעות עפעף (דבוק לאיסוף שן) כדי להגדיל את מספר העוברים שיכולים להיות מצולם באחד x, y מטוס. שים לב: כדי להימנע ממחסור בחמצן, לא גוש יותר מ -10 עוברים ביחד.
    8. בשלב הבא, לכסות את השקופית עם coverslip ולאטום אותו באופן חלקי עם VALAP נוזל המחומם מראש (וזלין, לנולין ופרפין; נמס ושילוב 01:01:01) על מנת למנוע התייבשות של העוברים במהלך הדמיה. הערה: ca חיץ נוסף M9n יתווסף לכרית, כדי להבטיח שיש לי עוברים נזילים מספיקים להדמיה. במקום VALAP, וזלין ניתן להשתמש כדי לאטום באופן חלקי coverslips, אבל זה פחות נוקשה גורם coverslips להחליק ויכול לעלות על מטרות מיקרוסקופ.

5. הדמיה חיה

  1. כדי להמחיש neuroblasts, להשיג מתח תולעת שמבטא חלבון neuroblast הספציפית המצורף לחלבון פלואורסצנטי (למשל HAM-1: ה-GFP, מזהה מתח בCGC OP102). כדי לזהות קרום תא, להשתמש בזן תולעת שמבטא גם תחום חלבון שמכיר שומנים מצורפים לחלבון פלואורסצנטי שונה (למשל mCherry:. PH, מזהה מתח בCGC OD70).
  2. עוברי קציר מהרמפרודיטים ניאון שמרו על שליטה או צלחות RNAi ani-1 (ראו פרוטוקולים 3 ו -4), ולהכין שקופיות כפי שתואר לעיל (ראה 4 לפרוטוקול).
  3. עוברי תמונה ב4D (x, y, z וזמן לשגות) על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. השתמש באחת wiמערכת defield [מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי עם מסננים עבור ה-GFP וTexasRed, מטרות עד 60x או 100x, CCD ברזולוציה גבוהה מצלמה (התקן צמוד מטענים), ממונע שלב מאוד (למשל. Piezo Z) ורכישת תוכנה מיוחדת] או livescan סחפו שדה מיקרוסקופ confocal [אוטומטי סריקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 488 ננומטר ו561 לייזרי ננומטר, מטרות עד 100X, EMCCD מצלמה (CCD הכפלת אלקטרונים), ממונע ביותר במה (למשל Piezo Z) ורכישת תוכנה מיוחדת]. הערה: למערכת widefield, באמצעות נוריות ומצלמה EMCCD יגביל phototoxicity. כמו כן, מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב יכול לשמש במקום של מערכת השדה נסחפה.
  4. לחלוקת תא neuroblast תמונה משני המערכת, למצוא x, y מסגרות של עוברים באמצעות 10X או 20X המטרות, ולבחור x אופטימלי, מסגרת y בי העוברים עוברים עיבור הגבי (שלב קודם למתחם הגחון; איור 1 א) או בשלבים מוקדמיםשל מתחם הגחון (~ 350 דקות לאחר חלוקת התא הראשונה; איור 1 א).
  5. במיקרוסקופ השדה נסחף, השתמש ננומטר 488 ו561 לייזרי 100 mW ננומטר ב40% כוח עם שסע 50. על מערכת widefield, השתמש במסנני ה-GFP וTexasRed עם נמוכה בינוני עוצמת אור (אם לשליטה). הערה: למערכת widefield, יש נוריות phototoxicity הנמוך ועדיפות.
  6. שתי המערכת, השתמש במטרות שמן טבילת 60x או 100X ולאסוף 20 Z-ערימות של 0.2 מיקרומטר כל 2 דקות עבור סכום כולל של 10 דקות. הערה: למרות שHAM-1: ה-GFP וmCherry: בדיקות PH להביע ברמות גבוהות יחסית, זמני חשיפה לכל חללית יצטרכו להיות מותאמים למיקרוסקופים שונים. הערה: למערכת widefield, Z-ערימות פחות מומלצות להגביל phototoxicity והדמיה על פני תקופות זמן ארוכות יותר, השתמשו בנקודתי זמן פחות.
  7. כדי למזער phototoxicity הנגרם על ידי החשיפה של עוברים לאור UV על מערכת widefield (אם משתמש במרצדסאורי הנורה), לסגור את הצמצם ל30% ולהקטין את עוצמת האור (באמצעות מערכת תאורה מתכווננת). הערה: למרות שהרווח אינו נחוץ או באמצעות מערכת, ייתכן שיש לי מיקרוסקופים אחרים מקורות אור בעוצמות נמוכות יותר או מטרות עם פתחים מספריים שונים, שעשוי לחייב שימוש ברווח כדי להשיג תמונות של עוצמת פיקסל אופטימלית. בדוק את תנאי שימוש בעובר שליטה כדי להבטיח כי כל פנוטיפים שנצפו אינם בשל phototoxicity artifactual.

6. ניתוח מיקרוסקופית נתונים

  1. כדי לנתח את התמונות, קבצי יצוא כמו בפורמט TIFF ולפתוח את הפורמט TIFF כמחסנית תוך שימוש בתוכנה מיוחדת, כגון תכנית עיבוד תמונה מבוססת ג'אווה (למשל ImageJ, NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/). הערה: בהתאם לתוכנת הרכישה משמשת כדי לאסוף את התמונות, אפשר לשמור את הקבצים בצורתם המקורית ונפתחו בImageJ. זה עדיף כמטה נשמר עם הקבצים.
  2. הפרד את המחסניתל" תמונות "ובחר נקודות זמן ו-Z-מטוסים בהתאם לצורך. הערה: למרות ערימת 20 Z-המטוסים נלקחת, רבים של neuroblasts הם <1 מיקרומטר עבה בעובר מאוחר האמצע ויש צורך רק כמה Z-מטוסים.
  3. לסדר מחדש את מטוסי Z שנבחרו עבור כל נקודת זמן ולבצע את התחזיות נפרדות Z-מחסנית. לאחר מכן, מחסנית התחזיות עבור כל נקודת זמן יחד כדי להפוך את רצף זמן.
  4. לבצע התאמות לבהירות / או והניגוד לכל ערוץ.
  5. לאחר מכן, בחר אזור של עניין, לחתוך (ולסובב במידת צורך) באזור.
  6. ליצור תמונות הממוזגות באמצעות הפונקציה 'הערוצים התמזגו' ולבחור בצבע שונה עבור כל ערוץ. המרת תמונות הממוזגת ל RGB.
  7. הפוך תמונות בגווני אפור לכל ערוץ מהצעדים 6.3 או 6.4 (פונקצית שימוש 'הפוך' תחת 'עריכה') כדי להמחיש תמונות בצורה ברורה יותר.
  8. לשמור את כל תמונות הסופיות כפורמט TIFF 8 ביט כדי להפוך דמויות בsoftw וקטור מבוססתוכניות או כקבצי Quicktime לעשות סרטים.
  9. אם מדידות של גודל פיקסל יש צורך (למשל לכלול סרגל קנה מידה עם התמונות), השתמש ImageJ, או תוכנות עיבוד תמונה אחרות כדי למדוד את גודלו של העובר. הערה: תמונות שנאספו באמצעות יעדים שונים יהיו גדלי פיקסל שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול ניסוי זה מתאר כיצד חלוקת תאי תמונה בג elegans עוברים במהלך אמצע העובר. בפרט, היא מתארת ​​כיצד neuroblasts תמונה, אשר עשוי להקל המורפוגנזה אפידרמיס. המורפוגנזה עוריות מתרחשת עקב שילוב של שינויי צורת תא אפידרמיס, הגירה והידבקות, אלא גם מסתמך על אותות כימיים או מכאניים מneuroblasts הבסיס (איור 1). Neuroblasts מפרישות רמזי הדרכה שקבלו על ידי קולטנים על פני השטח של תאי האפידרמיס הגחון, המסדיר 10,14,25 ההגירה שלהם. יתר על כן, neuroblasts הן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בסוגים שונים של מיקרוסקופ לחלוקות תא תמונה במהלך אמצע העובר. בפרט, פרוטוקול זה מדגיש עד כמה לתמונת חלוקת neuroblasts, תאים שעשויים להקל המורפוגנזה אפידרמיס. תקשורת בין התאים חשובה להיווצרות רקמה במהלך פיתוח מטזואניים וג elegans הוא מודל מצוין ללמוד היווצרות רקמה בגוף חי. אירוע אחד שמתאר בצורה יפה את משחק הגומלין של רקמות הוא המורפוגנזה אפידרמיס, אשר מכסה את העובר בשכבה של תאי האפיתל. בפרט, מתחם הגחון הוא התהליך שבו תאי האפידרמיס הגחון ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להכיר בכך שעבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה מענק (NSERC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרביושופ קנדה בע"מ#AGR001.1להכנת לוחות C. elegans NGM ו-RNAi Agar
Bio Basic Inc.#9002-18-0להכנת חיידקים צלחות אגר LB
AgaroseBioShop Canada Inc.#AGA001.500
נגד עכבר Alexa Fluor 488 נוגדןLife Technologies Corporation (Invitrogen)#A11029
נוגדן נגד עכבר נגד GFPRoche Applied Science#11814460001
אנטי-ארנב Alexa Fluor 568 נוגדןLife Technologies Corporation (Invitrogen)#A11011
AmpicillinBioShop Canada Inc.#AMP201.5אחסן אבקה בטמפרטורה של 4 מעלות; C ואמפיצילין מומס ב-20 מעלות; C
בקטופטון  (פפטון-א')ביו בייסיק בע"מ
CaCl2 (סידן כלורי)BioShop Canada Inc.#C302.1
כולסטרולביושופ קנדה בע"מ#CHL380.25להתמוסס באתנול
DAPI סיגמא-אולדריץ'#D9542השתמש לצביעה של חומצות גרעין (DNA)
גליצרולביושופ קנדה בע"מ.#GLY001.1
IPTG (איזופרופילתיו-ובטא;-גלקטוזיד)ביו בייסיק בע"מ#367-93-1יש לאחסן אבקה ו-IPTG מומס בטמפרטורה של -20 מעלות; C
KH2PO4 (אשלגן פוספט, מונובסיס)BioShop Canada Inc.#PPM666.1
K2HPO4 (אשלגן פוספט, דו-בסיסי)BioShop Canada Inc.#PPD303.1
L4440  (וקטור הזנה)Addgene#1654יש לשמור כמלאי גליצרול בטמפרטורה של -80 מעלות; C
MgSO4    (מגנזיום גופרתי)ביושופ קנדה בע"מ#MAG511.500
NaCl (נתרן כלורי)ביו בייסיק בע"מ#7647-14-5
Na2HPO4 (נתרן פוספט, דו-בסיסי)Bio Basic Inc.#7558-79-4
סרום חמור רגיל (NDS)Wisent Bioproducts#035-110
n-פרופיל-3,4,5-טריהידרוקסיבנזואט (פרופיל גלאט)אלפא אזר#A10877
פולי-L-ליזיןסיגמא-אולדריץ'#P8920לתוצאות מיטביות שקופיות מיקרוסקופ שלוש פעמים 
סטרפטומיציןביושופ קנדה בע"מ#STP101.50אחסן אבקה בטמפרטורה של 4 מעלות; C וסטרפטומיצין מומס ב-20 מעלות; C
טטרציקליןביושופ קנדה בע"מ#TET701.10אחסן אבקה בטמפרטורה של 4 מעלות; C וטטרציקלין מומס ב-20 מעלות; C
Tween-20ביו בייסיק בע"מCAS#9005-64-5
טריפטוןביושופ קנדה בע"מ#TRP402.500
תמצית שמריםביו בייסיק בע"מ#8013-01-2
#G213

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  3. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  4. Pennisi, E. Worming secrets from the C. elegans genome. Science. 282, 1972-1974 (1998).
  5. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99, 123-132 (1999).
  6. Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. The C. elegans Research Community. , 1-22 (2005).
  7. Zhang, H., Gally, C., Labouesse, M. Tissue morphogenesis: how multiple cells cooperate to generate a tissue. Curr. Opin. Cell Biol. 22, 575-582 (2010).
  8. Kiehart, D. P. Wound healing: the power of the purse string. Curr. Biol. 9, 602-605 (1999).
  9. Ikegami, R., et al. Semaphorin and Eph receptor signaling guide a series of cell movements for ventral enclosure in C. elegans. Curr. Biol. 22, 1-11 (2012).
  10. Chin-Sang, I. D., George, S. E., Ding, M., Moseley, S. L., Lynch, A. S., Chisholm, A. D. The ephrin VAB-2/EFN-1 functions in neuronal signaling to regulate epidermal morphogenesis in C. elegans. C. elegans. Cell. 99, 781-790 (1999).
  11. Wang, X., Roy, P. J., Holland, S. J., Zhang, L. W., Culotti, J. G., Pawson, T. Multiple Ephrins Control Cell Organization in C. elegans Using Kinase-Dependent and -Independent Functions of the VAB-1 Eph. Mol. Cell. 4, 903-913 (1999).
  12. Chin-Sang, I. D., Moseley, S. L., Ding, M., Harrington, R. J., George, S. E., Chisholm, A. D. The divergent C. elegans ephrin EFN-4 functions in embryonic morphogenesis in a pathway independent of the VAB-1 Eph receptor. Development. 129, 5499-5510 (2002).
  13. Ghenea, S., Boudreau, J. R., Lague, N. P., Chin-Sang, I. D. The VAB-1 Eph receptor tyrosine kinase and SAX-3/Robo neuronal receptors function together during C. elegans embryonic morphogenesis. Development. 132, 3679-3690 (2005).
  14. Bernadskaya, Y. Y., Wallace, A., Nguyen, J., Mohler, W. A., Soto, M. C. UNC-40/DCC, SAX-3/Robo, and VAB-1/Eph polarize F-actin during embryonic morphogenesis by regulating the WAVE/SCAR actin nucleation complex. PLoS Genet. 8, (2012).
  15. Piekny, A. J., Werner, M., Glotzer, M. Cytokinesis: welcome to the Rho zone. Trends Cell Biol. 15, 651-658 (2005).
  16. Piekny, A. J., Maddox, A. S. The myriad roles of Anillin during cytokinesis. Sem. Cell Dev. Biol. 21, 881-891 (2010).
  17. Zhao, W. M., Fang, G. Anillin is a substrate of anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) that controls spatial contractility of myosin during late cytokinesis. J. Biol. Chem. 280, 33516-33524 (2005).
  18. Piekny, A. J., Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis. Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).
  19. Hickson, G. R., O’Farrell, P. H. Rho-dependent control of anillin behavior during cytokinesis. J. Cell Biol. 180, 285-294 (2008).
  20. Fraser, A. G., Kamath, R. S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., Ahringer, J. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  21. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  22. Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook, The C. elegans Research Community. , 1-61 (2006).
  23. Maddox, A. S., Habermann, B., Desai, A., Oegema, K. Distinct roles for two C. elegans anillins in the gonad and early embryo. Development. 132, 2837-2848 (2005).
  24. Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100, 64-119 (1983).
  25. Chin-Sang, I. D., Chisholm, A. D. Form of the worm: genetics of epidermal morphogenesis in C. elegans. Trends Genet. 16, 544-551 (2000).
  26. Zhang, H., Labouesse, M. Signaling through mechanical inputs – a coordinated process. J. Cell Sci. 125, 3039-3049 (2012).
  27. Guenther, C., Garriga, G. Asymmetric distribution of the C. elegans HAM-1 protein in neuroblasts enables daughter cells to adopt distinct fates. Development. 122, 3509-3518 (1996).
  28. Audhya, A., et al. A complex containing the Sm protein CAR-1 and the RNA helicase CGH-1 is required for embryonic cytokinesis in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol. 171, 267-279 (2005).
  29. Maddox, A. S., Lewellyn , L., Desai, A., Oegema, K. Anillin and the septins promote asymmetric ingression of the cytokinetic furrow. Dev. Cell. 12, 827-835 (2007).
  30. Dorn, J. F., et al. Actomyosin tube formation in polar body cytokinesis requires Anillin in C. elegans. Curr. Biol. 20, 2046-2051 (2010).
  31. Calixto, A., Ma, C., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nat. Methods. 7, 554-559 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA

מאמרים קשורים