הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.

תקציר

פרוטוקול זה מפרט שיטה לנתח את היכולת של אבות היווצרות הדם מטוהרים כדי ליצור תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC) בתיקון של Peyer מעיים (PP). אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs, לין ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ FLT3 ⁺⁾ היו מטוהרים ממח העצם של עכברי C57BL6 ידי FACS והועברו לעכברי נמען שאין אוכלוסיית PDC משמעותית בPP, במקרה זה, Ifnar ^{- / -} עכברים שימשו כמקבלי העברה. בחלק מהעכברים, ביטוי יתר של גורם גדילה ליגנד תאים דנדריטים FLT3 (Flt3L) נאכף לפני מאמצי העברת CDPs, באמצעות העברת גנים הידרודינמית (HGT) של פלסמיד Flt3L הקידוד. ביטוי יתר Flt3L מרחיב אוכלוסיות DC מקורם אבות הועברו (או אנדוגני) hematopoietic. ב7-10 ימים לאחר העברת אב, pDCs שעולה מהאבות העבירו adoptively נבדלו מתאי נמען עלבסיס של ביטוי סמן CD45, עם pDCs מCDPs הועבר להיות CD45.1 ⁺ ומקבלי להיות ⁺ CD45.2. היכולת של CDPs הועבר לתרום לאוכלוסיית PDC בPP ולהגיב לFlt3L הוערכה על ידי cytometry זרימה של השעיות תא בודדות PP מעכברי נמען. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבדוק אם אוכלוסיות אב אחרות הן מסוגלים לייצר PP pDCs. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את התפקיד של גורמים שהם חזו להשפיע על התפתחות PDC בPP, על ידי העברה תת אב עם מציאה מתאימה, נוקאאוט או ביטוי יתר של הגורם ו / או התפתחותי המשוערת על ידי מניפולציה ציטוקינים במחזור באמצעות HGT . שיטה זו גם עשויה לאפשר ניתוח של כמה pDCs PP משפיע על התדירות או פונקציה של תת חיסון אחר בPPS. תכונה ייחודית של שיטה זו היא השימוש בIfnar ^{- / -} עכברים, אשר מראה מדולדל קשות ביחס PP pDCs לבעלי חיים מסוג בר, ובכך allowiהכינון מחדש ng של PP pDCs בהעדר תופעות של בלבול מקרינה קטלנית.

מבוא

הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול להעריך האם אבות תאים דנדריטים משותפים (CDPs) מסוגלים לתת עלייה לתאים דנדריטים plasmacytoid אוכלוסייה (PDC) בתיקון של Peyer (PP). המטרה הכללית של שימוש בשיטה זו הייתה להעריך את הרגולציה ההתפתחותי של pDCs בתיקון של Peyer (PP PDC). מהסיבה זו חשובה היא שpDCs PP שונה מpDCs נמצא ברקמות אחרות, כוללים מח עצם, דם וטחול, ולכן לא ברור אם pDCs PP ואוכלוסיות PDC אחרות הן מבחינה התפתחותית ו / או תפקודי בנושא. באופן ספציפי, pDCs ידוע נרחב על היותו הסוג העיקרי אני אינטרפרון מפיקים (IFN) בתוך מערכת hematopoietic, בתגובה לחיוג כמו קולטן 7 ו 9 גירוי (TLR7 / 9) על ידי מהיר IFN ההפרשה ^1-3. יחד עם זאת, pDCs PP חסר בייצור הסוג אני IFN בתגובה לגירוי ^4,5 אגוניסט TLR. זאת ועוד, PP pDCs גם שונה מpDCs נמצא במח עצם וטחול בהדורש אותות מהסוג אני אינטרפרון רצפטור (IFN) (IFNAR1) או IFN איתות STAT1 מולקולה לפיתוח ו / או ההצטברות ⁵ שלהם. נתונים אלה הציעו את האפשרות שמנגנוני פיקוח שונים לשלוט pDCs PP לעומת pDCs באיברים אחרים (למשל מח עצם, טחול) ^5.

הרציונל שהוביל לפיתוחה של שיטה זו היה מבוסס על ההתקדמות בהבנת ביולוגיה של תאים דנדריטים (DC). רוב, אם לא כולם, תת DC נובעים מאבות hematopoietic המבטאים את FMS-כמו טירוזין קינאז 3 קולט (FLT3) ^6-10, עם זאת, פיתוח DC אינו מוגבל למיאלואידית הקלאסית ומסלולי הלימפה. לדוגמא, ⁺ אבות FLT3 נפוצים מיאלואידית (CMPs, לין ^- IL-7R ^- SCA-1 ^- c-kit ⁺ CD34 ⁺ FcγR ^{lo / -)} להצמיח CDPs (לין ^- c-kit ^lo CD115 ⁺ FLT3 ^+), אשרשעות נוספות להבדיל לpDCs וDCs הקונבנציונלי (cDCs) ^9,10. לעומת זאת, FLT3 ⁺ אבות הלימפה נפוצים (CLPs, לין ^{- והנה +} SCA-1 ^lo c-kit IL-7R) לפתח בעיקר לpDCs ^11. לכן, מחקרים קודמים מצביעים על pDCs לנבוע מלפחות 2 אוכלוסיות אבות היווצרות הדם נפרדות לפי תקנה של Flt3L, אם כי הניתוח הטיפוסי הוגבל למח עצם, הטחול ו / או תת PDC הדם. לכן, אוכלוסיית האב (ים) שיוצרת PP pDCs נדרשת חקירה. הבנת מקורותיה של PP pDCs תשפוך אור על השאלה האם הם חולקים מסלולים התפתחותיים משותפים עם אוכלוסיות PDC אחרות, או לנצל את המנגנונים שונים בדורם בPP.

יתרון ייחודי של הגישה המתוארת כאן הוא השימוש בעכברים מראים כי מחסור חמור בPP pDCs כנמענים להעברת המאמצת של אבות היווצרות הדם. עכברים עם גןמחיקת טיק בגן המקודד IFNAR1 (Ifnar ^{- / -} עכברים) או STAT1 (Stat1 ^{- / -)} גילתה דלדול בולט בPP pDCs ^5. לכן, זנים אלה מספקים סביבה שבה pDCs PP מופחתים, המאפשרים לימודי העברת מאמצת שיש לבצע בהיעדר משטרי אבלציה הסלולרי חזקים כמו קרינה קטלנית. כוח נוסף של השיטה המוצגת כאן הוא השימוש בהעברת גנים הידרודינמית (HGT) כדי לעורר את הכמויות במחזור גבוהות של Flt3L. זה מספק גישה יעילה עלות לגרום Flt3L in vivo, לעומת הזרקה של חלבון רקומביננטי. מחקרים רבים, כוללים אלה במעבדה שלנו, יש מועסקי HGT לגרום כמויות ציטוקינים במגוון רחב של תנאי ניסוי ^5,12,13.

חלוקת העבודה ותפקידים חיסוניים מדויקים לDCS היא עניין המרכזי באימונולוגיה. בפרט, pDCs הם מתווכים חשובים של סובלנות אוראלית ואנטי ויראלית המערכתיתתשובות, ובכל זאת הם מופיעים גם לתרום לפיתוח וההתמדה של אוטואימוניות והסרטן ^14-17. הפרוטוקול המתואר במסמך זה יאפשר למנגנוני התפתחות ויסות PP pDCs כדי להיחקר באופן מלא יותר. בנוסף, גישה זו עשויה לאפשר מחקרים כדי להעריך את תפקוד PP PDC, וניתן להארכה להבנת הוויסות והתפקוד של אוכלוסיות אחרות של מערכת חיסון בתוך PPS.

פרוטוקול

יש לקבל את האישור מוסדי מראש לכל מניפולציות הניסוי שתוארו במסמך זה כרוך בעכברים. אלה כוללים שימוש בעכברי C57BL6 לבידוד של תאי אב במח עצם, Ifnar ^{- / -} עכברים כנמענים להעברת מאמצת של אבות hematopoietic ושימוש בHGT לביטוי יתר של ציטוקין in vivo. דיור הולם וטיפול בבעלי החיים גם חייבים להינתן על ידי החוקר או מוסד. יתר על כן, ייתכן שיידרש אישור מוסדי לפלסמידים המשמשים בהעברה הידרודינמית גן (כלומר אישור ה-DNA רקומביננטי). המחקרים שתוארו כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש ב UT MD Anderson Cancer Center.

1. ין העברה הידרודינמית (HGT)

צעד זה צריך להתבצע 2 ימים לפני העברת המאמצת של CDPs כדי לגרום למחזור Flt3L להרחבת DC in vivo ^5. יחסי ציבורepare לפחות 5 עכברים / קבוצת נמען.

1. כדי להשיג HGT יעיל, כלי השיט של הנמען Ifnar דם ^{- / -} עכברים ⁽⁺ CD45.2) צריכים להיות מורחב על ידי חשיפת עכברים למנורת חימום ל5-10 דק '.
2. מניחים את העכבר במכשיר עוצר ולחטא את זנבו עם 70% אתנול.
3. הזרק 5 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד Flt3L ב2 מיליליטר של PBS סטרילי לתוך זנב וריד באמצעות מחט G 27. לקבוצת הביקורת, להזריק 5 מיקרוגרם של וקטור ריק (pORF) דרך וריד הזנב כפי שצוין.
4. לפקח על עכברים ל15-30 דקות כדי לוודא שאין השפעות מזיקות של ההזרקה לוריד זנב. להחזיר עכברים למתקן דיור למשך 2 ימים.

2. בידוד של Hematopoietic אבות מעכבר מח עצם

יש לבצע שלב זה 2 ימים לאחר HGT. השתמש CD45.1 ⁺ עכברי congenic כמקור לתאי אב במח עצם להעברת מאמצת לנמען Ifnar ^{- /}- בעלי חיים (CD45.2 ^+). בפרוטוקול זה, זני congenic נדרשים להבחין תורם וDCS-נגזר נמען, וכן כדי למנוע דלדול בתיווך חיסונית בשל חוסר התאמת MHC. כ 10-20 עכברים יידרשו כדי לספק כמות מספקת של תאי אבות היווצרות הדם (10 ⁵ תאים / עכבר נמען) לניסויי ההעברה.

1. להרדים CD45.1 congenic 10 ⁺ עכברים על ידי CO ₂ מחנק ונקע בצוואר הרחם.
2. מניחים כל פגר על מגש נתיחה ולעקר את הבטן ורגליים עם 70% אתנול.
3. עושה חתך באמצע הבטן וחתך את העור מהבטן לכל רגל, חיתוך עור לאורך רגלו.
4. להסיר בעדינות את העור מכל רגל, ולחתוך ולהסיר את הרגליים מן הפגר במפרק הירך באמצעות מספריים חדים.
5. מוציאים בזהירות את השרירים מהירך ועצם השוק של כל רגל באמצעות סכין חד.
6. להסירשני הקצוות של עצם הירך ועצם שוק עם אזמל חד ולמקם את העצמות בצלחת תרבות המכילה מלא RPMI (RMPI 10% בסרום חום מומת שור העובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, פירובט נתרן 1 מ"מ ו50 β-mercaptoethanol מיקרומטר) .
7. הכן את מזרק המכיל 1 מיליליטר של RPMI השלם, מחובר למחט G 27.
8. להכניס את מחט 27 G לתוך קצה אחד של עצם הירך או שוקה. לשטוף את מח העצם מהירך או השוקה בעדינות על ידי הזרקת RPMI להשלים לתוך העצם. ודא שתאי מח עצם הוצאתו מהעצמות, זה יכול להתבצע על ידי בחינה ויזואלית איתור מדיה גורשה שמופיעה מעונן.
9. חזור על שטיפת כל 3x עצם ירך ועצם השוק כדי להסיר ביסודיות תאי מח עצם.
10. הכן השעיה תא בודדת על ידי pipetting בעדינות תאים למעלה ולמטה 3-5x בצלחת התרבות.
11. להסיר שאריות על ידי העברת תאי מח עצם דרך מסננת 40 תא מיקרומטר, הצבת התאים הקרינו לcultur חדשהצלחת דואר. לשבש כל גושי תאים המופיעים במסננת על ידי לחץ עדין עם סוף בוכנת מזרק סטרילי.
12. Lyse תאי דם האדום (RBC) הנמצאים בהשעית התא במח עצם המוחלטת עם מאגר תמוגה RBC מסחרי להוראות היצרן. השתמש 2 מיליליטר buffer/4-6 תמוגה RBC x 10 ⁷ תאים (בדרך כלל בתאים מעכבר אחד) וזמן דגירה של 5 דקות ב RT.
13. לשטוף את תאי מח עצם על ידי pelleting תאים על ידי צנטריפוגה במשך 4 דקות בשעה XG 500, בעדינות aspirating מדיום התרבות, resuspending ב10 מיליליטר חיץ FACS (1x PBS + 2 מ"מ EDTA + 1% FBS), תאי pelleting ידי צנטריפוגה ובעדינות aspirating לשטוף מאגר.
14. חזור על לשטוף, כמתואר בשלב 2.13, עבור סכום כולל של 2 שוטף.

3. סלולרי הקרינה המופעל מיון (FACS) כדי לבודד CDPs

צעד זה דורש גישה למפריד תא MidiMACS ועמודות MACS LD להליך בחירה שלילית ראשוני,כמו גם מכונה FACS עם לפחות 3 בלייזרים על מנת לטהר את קבוצת משנה אב ססגוניות לאחר צביעה עם נוגדנים מצומדות fluorescently.

1. לאחר לשטוף את השני בשלב 2.14, לספור את תאי מח עצם. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר בשלב 2.13 ו resuspend במאגר FACS כדי להשיג ריכוז סופי של 4 x 10 ⁷ תאים לכל 30 μl של חיץ FACS.
2. כדי להכין את התאים לFACS, תאי שושלת שלילית מועשרים ראשון על ידי טכניקת סלקציה שלילית שמסירה תאי שושלת חיובית מתערובת מח עצם באמצעות כרומטוגרפיה עמודת חרוז מגנטי. להליך הבחירה השלילי, להוסיף 1 מיקרוגרם של כל אחד מהנוגדנים הבאים החולדה מסחרית אנטי עכבר (שרירי בטן) שמזהים סמני שושלת hematopoietic: CD3, CD19, CD11c, CD11b, וטר-119 אבס. שרירי הבטן יש להוסיף בנפח של 2 μl / Ab להשעית תא 30 μl בחיץ FACS.
3. דגירה ההשעיה התא על 4 מעלות צלזיוס במשך 30דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של חיץ FACS כמתואר בשלב 2.13.
4. Resuspend תאים להשיג ריכוז סופי של 4 x 10 ⁷ cells/40 μl של חיץ FACS. הוסף 20 μl של עז אנטי עכברוש microbeads המגנטי IgG לכל 40 μl של השעיה תא. מערבבים בעדינות ולדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטוף תאים עם 10 מיליליטר של חיץ FACS כמתואר בשלב 2.13.
5. Resuspend עד 10 תאי מח עצם ^ב8 500 μl של חיץ FACS.
6. טען עמודת LD MACS על מפריד תא MidiMACS להוראות היצרן וprerinse הטור עם חיץ FACS 2 מיליליטר.
7. החל את ההשעיה התא במח עצם לעמודה, טעינה עד 5 x 10 ⁸ תאים ב2.5 מיליליטר של חיץ FACS. ודא צינור איסוף (צינור חרוטי 15 מיליליטר) ממוקם מתחת לעמודה. לשטוף את עמודת 3x עם 2 מיליליטר של חיץ FACS / לשטוף, ולאסוף את התאים שעוברים דרך העמודה, שיהיה מועשרת עבורתאי שושלת שלילית. ספירת התאים בחומר eluted (לשטוף דרך) מהטור.
8. כדי לבצע סלקציה חיובית של תת אב hematopoietic על ידי FACS, תאי כתם עם שרירי הבטן הבאים fluorescently מצומדות:-IL-7R (פסיפיק בלו), FLT3 (PE), SCA-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit שרירי בטן (APC.Cy7), בתוספת תערובת של אבס סמן השושלת מכוון נגד CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 וTer119 (כל כותרתו עם PerCP Cy5.5). השתמש 0.5-1 μl של כל Ab בנפח כולל של 100 μl. דגירה השעיה תא על 4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
9. שטוף תאים כפי שצוין בשלב 2.13 ו resuspend במאגר FACS בריכוז של 2-3 x 10 ⁷ תאים / מיליליטר. סנן תאים דרך צינור כובע מסננת תא 35 מיקרומטר כדי להסיר גושי תא. השלב אחרון זה הוא חיוני כדי למנוע סתימה במכונה FACS.
10. מניחים את ההשעיה התא בצינור FACS על הבמה FACS ולמיין CDPs (לין ^- c-kit ^והנה CD115 ⁺ FLT3 ⁺⁾ עלבסיס פרופיל הסמן המצוין. איסוף תאים מטוהרים בצינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר של RPMI המלא.
11. רשום את המספר המוחלט של תאים ממוינים בסוף ריצת FACS. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה כפי שצוין בשלב 2.13 ו resuspend ב סטרילית PBS לניסויי העברת מאמצת.

4. העברת מאמצת של CDPs

צעד זה נעשה בדרך כלל במתקן בעלי החיים שבו עכברי הנמען הם שוכנו. בהתאם למיקום של המכונה FACS, זה עשוי להיות כרוך בהובלה של אוכלוסיות תאים ובתאים המטוהרים למתקן בעלי החיים לפני העברת מאמצת. צריכה להיות כל הזמן השעיות תא אב סטריליים ומועברות על קרח.

1. הכן השעיות תא להזרקה על ידי דילול 10 ⁵ CDPs מטוהר בהיקף כולל של 100 סטרילי PBS μl. הנח השעיה תא במזרק המצורף למחט G 27.
2. לחשוף את הנמען Ifnar ^{- / -} עכברים (CD45.2 ⁺⁾ למנורת חימום ל5-10 דקות כדי להשיג זריקה יעילה דרך וריד הזנב.
3. מניחים את העכבר במכשיר עוצר ולחטא את זנבו עם 70% אתנול.
4. הזרק 10 CDPs ⁵ מטוהר FACS-ב100 μl PBS לתוך זנב וריד באמצעות מחט G 27.
5. לפקח על עכברים ל15-30 דקות כדי לוודא שאין השפעות מזיקות של ההזרקה לוריד זנב. להחזיר עכברים למתקן דיור.

5. בידוד של PP ומדידה של PDC סכומים

1. ב7-10 ימים לאחר העברת מאמצת, להרדים עכברי הנמען. בעדינות לפתוח את העכבר על ידי לנתיחה ולחשוף את המעי.
2. הסר את כל המעי ולמקם אותו במגבות נייר ספוגות PBS. לאסוף את כל PPS הגלוי לאורך הקיר של המעי הדק באמצעות מלקחיים ומספריים בסדר. יש עכברים בדרך כלל 5-10 PP / עכבר, שהם שונים מזקיקי הלימפה מבודדים מצאו ^- C57BL6 וIfnar ^{- /}לאורך המעי הדק ^18. שים לב שPPS הוא לעתים קרובות מבני ברור אפילו בתוך עכבר אחת, להבטיח כל כך בזהירות את כל PPS מזוהים וגזור.
3. הנח PPS בצלחת פטרי המכילה PBS, ולהשתמש במלקחיים כדי להסיר את צואה. חזור על תהליך זה פעמיים כדי לנקות PPS.
4. Digest PPS עם מ"ג / IV collagenase מיליליטר 1 ב10 פתרון מיליליטר של 1x האנק מאוזן מלח (HBSS) ב50 מיליליטר בקבוקון עם ערבוב נמרץ במשך שעה 1 ב 37 ° C.
5. הנח את PP מתעכל בתא העליון של תאי מסננת תא וכוח 40 מיקרומטר דרך מסננת עם בוכנת מזרק סטרילי. אסוף את ההשעיה תא PP בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
6. גלולה תאי PP מתוחים על ידי צנטריפוגה ב XG 500 לדקות 5 ו resuspend ב 6 מיליליטר של 37% פתרון Percoll (37% Percoll בRPMI בינוני). מניח בעדינות 6 מיליליטר של 70% פתרון Percoll (70% Percoll במדיום RPMI) מתחת להשעית התא, כדי ליצור שיפוע צעד Percoll.
7. צנטריפוגה תאים ל20 דקותt XG 800 עם צנטריפוגה לנתק. תאים חד גרעיניים יעברו לממשק 37/70%. לאחר צנטריפוגה, אוכלוסיית התאים חד הגרעיניים צריכה להיות שנאספו על ידי pipetting זהיר באזור הממשק. גלולה שנאספו תאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעמיים ב50 מיליליטר של RPMI / לשטוף מלא. נפח גדול משמש כדי להבטיח הסרת Percoll מלאה.
8. כתם תאי PP נאספו עם הנוגדנים הבאים כדי לזהות pDCs העכברי הנובעים מהאבות העבירו adoptively (CD45.1 ^+), או עכברי נמען (CD45.2 ^+): CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (פסיפיק בלו), CD11b (Cy5.5 PerCP), B220 (APC), Siglec-H (PE) וPDCA-1 (ABS FITC). לבצע ניתוח cytometry זרימה של תאי PP כפי שצוין בצעדים 3.9 ו3.10. לזהות pDCs ידי CD11c ⁺ CD11b ^- B220 ⁺ Siglec-H ⁺ PDCA-1 ⁺ פנוטיפ. מספרי PDC מוחלטים ניתן לקבוע על ידי המשוואה הבאה:% pDCs x למספר תא tal PP = PP pDCs.

תוצאות

התוצאות שלנו מראות אסטרטגית gating לבידודה של CDPs מתאי מח עצם של עכבר (איור 1), כמפורט בפרוטוקולים 2 ו -3. CDPs יהווה כ 0.1% בסך הכל תאי מח עצם, ויכול להיות מבודד בערך 4-6 x 10 ⁴ CDPs מעכבר אחד. עם העברת מאמצת, CDPs להתמיין pDCs וcDCs ^10.

דיון

טכניקת העברת המאמצת המתוארת כאן העריכה תרומת CDPs באוכלוסיית PP PDC עכברים נמען כי חסרים PP pDCs (למשל Ifnar ^{- / -} עכברים). בניסויים עתידיים, זה יהיה חשוב להעריך את הפוטנציאל של תת אב אחר ביצירת pDCs PP, בפרט אם pDCs PP נובע מFLT3 ⁺ CLPs. על שאלה זו הינה משמעותית שכן עדיין לא ברור מדוע pDCs PP הם ייחודי רגיש לאותות IFNAR-STAT1 לצבירת PP ^5, ואם pDCs PP לעקוב רמזים התפתחותיים דומים כמו pDCs באיברים אחרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C57BL/6J	JAX	664
B6. SJL	JAX	2014
RPMI	Invitrogen	11875-093
15 מ"ל צינורות חרוטיים	BD Biosciences	352095
50 מ"ל צינורות חרוטיים	BD Biosciences	352070
פינצטה
סטרילית מספריים
מספריים זוג גדול סטרילי
40 μ מסננת תאים	m BD Biosciences	352340
35 μ m צינורות מכסה מסננת תאים	BD Biosciences	352235
מאגר ליסינג RBC	Sigma	R7757
FACS מאגר			PBS, 2 מ"מ EDTA, 1% FCS, מסנן
מעוקר Percoll	GE Healthcare	17089102
10x HBSS	Sigma	H4641
קולגנאז IV	וורת'ינגטון	LS004188
עז נגד חולדות מיקרו-חרוזי IgG	Milteyni Biotec	130-048-501
LD column	Milteyni Biotec	130-042-901
חולדה נגד D3	BD Biosciences	555273
חולדה נגד CD19	BD Biosciences	553783
חולדה נגד CD11b	BD Biosciences	553308
חולדה נגד CD11c	BD Biosciences
553799 עכברוש אנטי-טר119	BD ביוסיינסס	553671
אנטי-CD3 (PerCP)	eBiosciences	45-0031
אנטי-CD19 (PerCP)	eBiosciences	45-0193
אנטי-CD11b (PerCP)	eBiosciences	45-0112
אנטי-CD11c (PerCP)	eBiosciences	45-0114
אנטי-F4/80 ( PerCP)	eBiosciences	45-4801
Anti-Ter119 (PerCP)	eBiosciences	45-5921
Anti-SCA-1 (PE. Cy7)	eBiosciences	25-5981
Anti-CD115 (APC)	eBiosciences	17-1152
Anti-c-kit (APC. Cy7)	eBiosciences	47-1171
Anti-IL-7R (Pacific Blue)	eBiosciences	48-1271
Anti-Flt3 (PE)	eBiosciences	12-1351
Anti-CD45.1 (APC. Cy7)	BD Biosciences	560579
Anti-CD45.2 (PE. Cy7)	Biolegend	109830
Anti-CD11c (Pacific Blue)	eBiosciences	48-0114
Anti-B220 (APC)	eBiosciences	25-0452
Anti-Siglec-H (PE)	eBiosciences	12-0333
Anti-PDCA-1 (FITC)	eBiosciences	Nov-72
Cell sorter	BD Biosciences		למשל BD מנורת
			חום
מסנן
1 מ"ל מזרקים	בקטון דיקינסון	309602
27½ מחטי G (סטריליות)	בקטון דיקינסון	305109