מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

סיכום

כתב יד זה מציג טכניקה כדי להחיל או לשחרר כוחות על תאים או רקמות חסיד באמצעות מתיחה חד כיווני.

תקציר

כוחות מכאניים המופעלים על תאים ו / או רקמות לשחק תפקיד מרכזי בתהליכים רבים. פיתחנו מכשיר למתוח תאים מצופים בpolydimethylsiloxane קרום (PDMS), תואם עם הדמיה. טכניקה זו ניתנת לשחזור ותכליתי. קרום PDMS ניתן micropatterned כדי להגביל את התאים או רקמות לגיאומטריה ספציפית. הצעד הראשון הוא להדפיס micropatterns על הממברנה PDMS עם טכניקת UV עמוקה. קרום PDMS מותקן אז על אלונקה מכאנית. תא חייב על גבי הקרום עם גריז ביולוגית כדי לאפשר גלישה במתיחה. התאים הם זורעים ואפשרו להפיץ לכמה שעות על micropatterns. המדגם יכול להיות מתוח וunstretched מספר פעמים עם השימוש בבורג micrometric. זה לוקח פחות מדקה כדי להחיל את המתיחה לכל אורכו (בסביבות 30%). הטכניקה המוצגת כאן אינה כוללת מכשיר ממונע, אשר הוא הכרחי עבורpplying מחזורי מתיחה חוזרים ונשנים במהירות ו / או בשליטת מחשב מתיחה, אבל יכול להיות מיושם זה. מתיחה של תאים או רקמות יכולות להיות עניין לשאלות הקשורות לכוחות תא, בתגובת תא ללחץ מכאני או המורפוגנזה רקמות. מצגת וידאו זה יראה איך להימנע מבעיות אופייניות שעלולות להתעורר כאשר אתה עושה את זה סוג של ניסוי פשוט לכאורה.

מבוא

התאים המרכיבים את רקמות באורגניזמים גבוהים יותר כפופים למתחים מכאניים וכוחות המתיחה מגיעים גם מהסביבה החיצונית או מהתאים המקיפים את ^1,2. תאים חייבים להסתגל ולהתנגד לכוחות הללו על מנת לשמור על שלמות רקמה. כוחות כאלה הם גם חשובים עבור המורפוגנזה רקמות במהלך ^3,4 פיתוח. החלת כוחות מכאניים על תאים בתרבית היא דרך לחקות את מה שעלול לקרות ברקמה, אבל עם שליטה כמותיים ועצמאית של צורת התא ^ו5,6 עיוות תא. לשם כך, עשויות לשמש במספר טכניקות. אפשר ללחוץ על התאים (התא כולו או חלק ממנו), למשל באמצעות AFM או נגזרי ^7,8 או למתוח את מצע התאים גדלים על.

השיטה המתוארת במאמר זה מדגימה כיצד למתוח מצע מטוס מצופה בתאים. טכניקה זו פותחה במקור כדי להעריך את התפקיד של כוחות המופעלים על מ 'תאי יונקים itotic ^9. תאי mitotic להישאר מחוברים למצע דרך סיבי הכחשה ומותחים את הקרום שהפעילו כוח על אלה סיבים, אשר בתורו עורר את הסיבוב של ציר mitotic. העניין של שילוב micropatterns דבק ומתיחה הוא להשיג שליטה עצמאית של כוחות וצורה של תאים בודדים. זה למשל אפשר למתוח תא ביצה לצורה עגולה איזוטרופיים בצורה מושלמת, תוך מתיחת uniaxial מוחלת. אם התאים אינם קלועים בmicropatterns, uniaxial מתיחת תוצאות בהתארכות תא, עם רוב התאים שיש ציר ארוך מיושר עם ציר המתיחה. קשה לאחר מכן להפריד את ההשפעה של יישור ציר זמן ואת ההשפעה של המתיחה מוחלת על התאים.

המכשיר מתאים לכל הדמיה תא חי, הכולל מיקרוסקופ פלואורסצנטי לשגות זמן רב, וניתן להוסיף תרופות במהלך הניסוי. שיטת micropatterning יובס העמוקה ¹⁰תואר בפירוט בAzioune et al. ¹¹ דפוסים על PDMS תוארו בAzioune et al. ¹² הווה מתיחת פרוטוקול הוא גרסת וידאו של קארפי et al. ¹³

פרוטוקול

1. פסיבציה של PDMS

1. חותכי חתיכה של PDMS כ 35 מ"מ x 20 מ"מ מגיליון שהוכן מראש (למשל, GelPak, כפי שמופיע בטבלה של חומרים).
2. הסר את החלק העליון ושכבות מגן התחתונה של פלסטיק (במידת צורך) ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את PDMS בפלסטיק (לא תא התרבות שטופלה) צלחת פטרי.
3. שטוף את PDMS עם אתנול 70% למשך 5 דקות על הכתף ב30 תנודות / דקה.
4. ייבש את פני השטח על ידי זורם אוויר על זה.
5. להאיר עם UV העמוק (λ = 180 ננומטר) במשך 5 דקות במרחק מנורות UV של כ -5 ס"מ (ראה גיליון חומרים למנורת התייחסות; פרמטרים ישתנו למנורות שונות).
6. הכן 200 μl של פתרון EDC / NHS עבור כל PDMS חתיכה (זה חייב להיות מוכן רק לפני השימוש בגלל תגובתיות של הפתרון דועכת בעניין של שעות). עבור 1 מיליליטר של 0.05 M MES + 0.5 חיץ M NaCl ב-pH 6.0, להוסיף 11.5 מ"ג sulfo-NHS ו19.2 מ"ג של EDC.
7. העברPDMS גיליונות מצלחת פטרי למכסה של צלחת פטרי, שלא היה מוארת. זה יבטיח כי הסביבה של PDMS מאוד הידרופובי ולהקל על השלב הבא.
8. הוספת פתרון EDC / NHS ודגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר.
9. יש לשטוף EDC / NHS עם מים.
10. הוספת פתרון PLL-G-PEG (0.5 מ"ג / מיליליטר בHEPES pH 10 מ"מ 8.6) ו דגירה מהשעה 3 בלילה בטמפרטורת חדר.
11. יש לשטוף את PLL-G-PEG עם מים. PDMS פסיבציה (פונקציונליות עם PLL-G-PEG) יכול להיות מאוחסן במשך כמה ימים ב 4 ° C.

2. דפוסים של PDMS

1. קח דף PDMS ולמקם אותו על photomask קוורץ סינטטי הנושא את microfeatures לדפוסים (ראה איור 1). הנח את צד PDMS הנושא את PLL-G-PEG מול צד הכרום של photomask.
2. להאיר למשך 7 דקות באמצעות photomask במרחק מנורות UV של כ -5 ס"מ.
3. מוסיף מים על המסכה + PDMS ולקלף את PDMS לאט את המסכה.
4. דגירה עם פתרון פיברונקטין ב50 מ"ג / מיליליטר במאגר HEPES ב-pH 8.6 במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. אפשר להשתמש באחרים חלבוני ECM, אבל אלה לא נבדקו עם פרוטוקול זה.
5. יש לשטוף עם PBS.

3. הרכבה ההתקנים

1. הר PDMS פסיבציה בעבר על מכשיר המתיחה (ראה דיון לפתרון בעיות).
   1. צרף צד אחד של PDMS לחלק הקבוע מהאלונקה.
   2. תקן את הצד השני לחלק הנייד של האלונקה ללא הידוק רב מדי של גיליון PDMS.
2. לחתוך מלבן של PDMS (22 מ"מ x 19 מ"מ) בדקירת PDMS עבה וחתך מלבן אחר בתוך כדי שתהיה בריכה (או מסגרת) שיישמר על התאים ותקשורת (ראה איור 2).
3. להוסיף גריז סיליקון תחת זה PDMS בריכה ולמקם אותו על גבי גיליון PDMS ליצור medium שמירה על בריכה. הגריז יאפשר הגלישה של הבריכה מעל גיליון PDMS במהלך מתיחה.

4. דפוסי התאים

1. לנתק את התאים מ50% בקבוק תרבות confluency עם Versene.
2. ספירת תאי resuspend אותם בריכוז של 200,000 תאים / מיליליטר.
3. הוסף 1 מיליליטר של השעיה תא בבריכה (ראה דיון לפרטים נוספים).
4. בואו התאים להיקשר לדפוסים ל10-30 דקות (תלוי בסוג התא, הרשתית-1 תאים ייקחו 10 דקות ותאי הלה 20 דקות).
5. בעדינות לשטוף את התאים הצפים עם מדיום equilibrated (לאזן בינוני בחממה).
6. בואו התאים התפשטו לכמה שעות על הדפוסים (RPE-1 יצטרך לפחות 2 שעות; תאי הלה יצטרכו 3 שעות).
7. הוספת coverslip על גבי הבריכה כדי למנוע דליפת אידוי ובינוני במקרה הפסקות PDMS.
8. שים את המכשיר על מיקרוסקופ הפוכה ולהתחיל הדמיה. הימנע משימוש באוב טבילת שמןjectives כפי שהוא לא יעבוד בשל בעיות מיקוד.

5. מתיחה

1. סובב את בורג micrometric תוך תיקון מיקום הבמה בx-, (בעיקר x) y-, וציר ה-z. מיקום הבמה צריך להיות מתוקן כדי לנטרל את הרחבת PDMS ואובדן המיקוד. (ראה "במתיחה" הפסק בדיון).

תוצאות

הטכניקה שהוצגה בפרוטוקול וידאו זה אפשר את היישום של כוחות על סיבי ההכחשה של תאי יונקים mitotic. ואכן, במהלך חלוקת תא, בשלב mitotic, תאי יונקים לחזור לקחת את הצורה של כדור ולהשאיר מאחור כבלים אקטין דקים מוקפים בקרום אשר מחוברים למצע. כבלים אלו (סיבי הכחשה), הם הזיכרון של הגיאומטריה התא לפני שהוא הולך לחטיבה. ביצוע micropatterns עם UV העמוק דרך photomask על סרט דק PDMS (איור 1) אפשר שליטה הגיאומטרית של הידבקות תא. על ידי מתיחת המצע בתחילת metaphase, חלק מסיבי ...

דיון

למרות שטכניקה זו נעשתה שימוש פעמים רבות ונבדקה ביסודיות, ישנם מספר שלבים קריטיים שיכול להוביל לניסוי נכשל.

אודות PDMS:

לעבודה זו, GelPak, גיליון דק PDMS זמין מסחרי, היה בשימוש. לחלופין ניתן להטיל גיליונות PDMS ישירות מתערובת PDMS. אנו ממליצים להשתמש GelPak כי זה שחזור יותר, ופחות סביר לשבור לעומת PDMS בהתאמה אישית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
GelPak	GelPak	PF-60-X4	עובי/דביקות שונים זמינים. חלופה אחת יכולה להיות להטיל את ה-PDMS  שלך; עצמך.
גריז סיליקון	GE Bayer סיליקונים	Baysilone-Paste	זה תואם ביולוגית
מכשיר מתיחה	GREM mé אלונקה קניק	2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	יציב 6 חודשים ב-20 ° C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide מלח נתרן)	Sigma	56485	הגנה מפני לחות
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 מ"ג)SurfaceSolutions	(ציריך)
מסכת פוטו קוורץ סינתטית	Toppan		קח מסכת פוטו בינארית סטנדרטית בקוורץ
פיברונקטין מפלזמת בקר	סיגמא	F1141