חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

phagocytes המקצועי, כוללים מקרופאגים, לשחק קריטי במערכת החיסונית. בנוסף להיותו קו הגנה הראשון של מערכת החיסון המולדת, הם גם לשחק תפקיד קריטי בהפעלה של החסינות אדפטיבית באמצעות האיתות ואנטיגן הצגת התפקיד ^1-3. בעוד שהפונקציה של phagocytes המקצועי היא רבת פנים, התבגרות phagosome היא עמוד השדרה הקריטית של פונקצית עיבוד bactericidal ואנטיגן של phagocytes המקצועי ^4,5. על היבלעות קולטן בתיווך והספיגה של יעד phagocytic, כגון חיידקים, phagosome המתהווה עובר רצף מורכב ומתוזמר היטב של אינטראקציה וחילופים עם תאים של רשת endocytic וכמה אברונים תאיים אחרים ^6. טבעו של התרכובות החליף עם גופים סלולריים אלה, כמו גם הרגולציה והתזמון של אירועי היתוך קובע את סביבת phagosomal luminal וphagosהרכב omal קרום, ולכן ^7, את גורלו של phagosome התבגרות ^8.

רלוונטי הפיזיולוגית של התבגרות phagosome מודגם על ידי האסטרטגיות המגוונות המועסקות על ידי פתוגנים תאיים שונים כדי לברוח מ, לעצור או לחתור תחת phagosome התבגרות ^9. רוב האסטרטגיות אלה במישרין או בעקיפין למנוע את השלב האחרון וקריטי של תהליך התבגרות phagosome: ההיתוך של phagosome עם תאי endosomal / lysosomal מאוחר, שמשווה להם את חלק הארי של אנזימי hydrolytic והגורמים אנטי בקטריאלי של phagosome בוגר ^{7 , 8,10.} ניתוח השלב האחרון וקריטי זו ולכן יכול לספק לנו אינדיקטורים חזקים על מצב ההבשלה של phagosomes ואם המצב הפיזיולוגי הטבעי הוא להיות חיובי או שלילי מושפע תחת ההגדרות הניסיוניות מסוימות כי הם מנוצלים.

תא endosomal מאוחר / lysosomal ים נחשב בדרך כלל להיות תאי המסוף של מסלול endocytic, מוגדרים ונבדלים מתאי endocytic המוקדמים על ידי הנוכחות של שונים, לביים מולקולות ספציפיות, סמן. למשל אנזימי hydrolytic או רכיבי קרום כגון חלבוני קרום lysosomal משויכים (מנורות) בין יתר ^11. Endocytic המסוף התייחסה מדורים מעתה בפשטות lysosomes-משמש גם כמקום המרכזי לשלבים הסופיים של מערכת העיכול בסוף phagocytic / endocytic המסלול ^12. בדרך זו, ניתן לטעון בדיקות nondigestible דרך אנדוציטוזה וmacropinocytosis מהסביבה תאית ומועברות דרך מסלול endocytic לlysosomes, שם הוא מצטבר ^13,14 לאחר ביצוע מחזור של ספיגה ומרדף מוגדר. בדיקות Fluorophore מצומדות למיקרוסקופ פלואורסצנטי כגון dextran פולימר nondigestible האורגני משמשות בדרך כלל כendocyticprobes ^15-17.

s = "jove_content"> בשיטה זו, אנו מתארים את הניצול של microbeads מצופה IgG כמטען phagocytic לחקור התבגרות phagosome ידי ניתוח אספקת תוכן luminal lysosomal לphagosomes. באמצעות בדיקה dextran fluorophore מצומדות כסמן לזיהוי בקלות של lysosomes במקרופאגים מח עצם לחיות נגזרים (BMM) ווידאו הדמיה הזמן לשגות עם מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה, אנו ממשיכים בתהליך הדינמי של משלוח המטען לphagosomes עם גבוה פתרון זמני. לאחר מכן, אנו מתארים כיצד ניתן להעריך את נתוני הזמן לשגות הדמיה נאספו באמצעות הקוד הפתוח ותוכנה זמינה באופן חופשי ניתוח תמונה, פיג'י (או ImageJ), מבחינה סטטיסטית נותח באמצעות Microsoft Excel ומוצג באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה ^14,18.

לאחר התיאור של השיטה שלנו, יכולים להיות מתוכננים ניסויים מקבילים באמצעות הגדרות וגורמים שונה כדי לחקור את ההשפעה שלהם על התבגרות phagosome; כמעט כל otהסוג של תאי phagocytic ראשוניים או תא שורה חסיד שלה, אובדן גנטי של ניסויי פונקציה כוללים גן עקום החוצה ולדפוק למטה, מוטציות או ביטוי של חלבוני איחוי, phagocytic-מטרות, תרכובות ציפוי microbead, בדיקות endosomal / lysosomal וגורמים כגון ציטוקינים, מעכבים כימיים, או siRNA בין השאר הם כל המשתנים שניתן ליישם את הגישה הבסיסית של שיטה זו.

אנו מגדירים את המטרה ודרישות הבסיסיות של שיטה זו באופן הבא:

• מטרתה של השיטה: כדי לאפשר תצפית ישירה, כמוני ואיכותית וניתוח של התבגרות phagosome עם רזולוציה גבוהה זמנית בתאים חיים phagocytic.
• מטען phagocytic: microparticle מצופה כראוי או יעד ביולוגי. כאן אנו משתמשים IgG מצופה 3 מיקרומטר microparticles קלקר כדורי שהם הפנימו בקלות דרך phagocytosis קולטן בתיווך FC-γ. לחלופין, כל מיקרואורגניזם או מיקרופון מצופהניתן להשתמש roparticle שלקולט phagocytic נמצא על התאים.
• תאי phagocytic: תאי phagocytic חסיד המבטאים את הקולטנים phagocytic המתאימים. כאן אנו משתמשים BMMs עיקרי עכבר ששפע להביע את הקולטנים FC-γ. לחלופין, תאים דנדריטים (DC), מונוציטים או תאי אפיתל phagocytic או מוטציות הגנטיות שלהם או גרסאות עקום החוצה יכולים לשמש.
• מטען lysosomal: חללית lysosomal שכותרתו fluorescently. הנה, dextran 70,000 kiloDaltons (Dex70kD) מצומדת-טקסס האדומה משמש כמטען luminal של lysosomes. לחלופין, סמן כל fluorescently זיהוי של תא סלולארי או אברון, או בדיקה נאותה לנכסי phagosomal כגון קיבולת חומציות או degradative, יכול לשמש כדי לחקור את התקדמות הבשלת phagosome.
• השפעה גורמים: למשל, מולקולות איתות, תרכובות כימיות, גן עקום למטה, או ביטוי חולף של חלבוני מוטציה יכלו. הנה, יש לנו פרגאחד שימוש בגורם כזה לשם פשטות, אבל לדוגמה האחרונה עם ביטוי חלבון מוטציה וגורמים המשפיעים על לדפוק למטה ראו Kasmapour et al. ¹⁸ כל גורם שיכול להשפיע על phagocytosis או הנסיבות וניידות של phagosomes ו / או עלולים לשמש התאים שאינטראקציה עם phagosomes התבגרות.

טיפול בבעלי חיים ואת כל הנהלים בפרוטוקול זה פעלו בהתאם להנחיות מוסדיות ולאומיות.

הכן את ההכנות שמסומנות על ידי "Π-" לפני כן.

1. הכנת BMMs

1. לבצע קולינג של העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם.
2. הסר את עצם הירך ועצמות שוקה, עצמות חופשיות מרקמות ולקצץ את שני הקצוות לנגישות של מח העצם.
3. לשמור על עצמות בPBS קר כקרח או מדיום DMEM קר כקרח (בתוספת 100 U / ml פניצילין ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, על קרח עד לשלב הבא.
   הערה: התנהגות הצעדים מתחת לארון בטיחות ביולוגי בכיתה השנייה הבאים כדי לצמצם את הסיכון לזיהום.
4. לשטוף את החלל הלשדי עם PBS + פניצילין / סטרפטומיצין הקר באמצעות G 26 (0.45 מ"מ) מחט מחוברת למזרק 1 מיליליטר.
5. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה העדינה ב350 XG עבור 10 דקות, resuspend את הכדור ברפואת BMMium וצלחת במיקרוביולוגיה סטרילי noncoated צלחות פטרי.
   1. הכנה של מדיום BMM
      • הנשרים בינוני DMEM השתנה Dulbecco
      • FCS המומת 10%
      • supernatant תרבות שורת L929 תא 20% פיברובלסטים עכבר (מקור של גורם מגרה מושבה מקרופאג, M-CSF)
      • 5% בסרום סוס
      • 2 מ"מ גלוטמין
   2. הכנה של מדיום תרבות שורת תאי L929;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 בינוני
      • FCS המומת 10%
      • 2 מ"מ גלוטמין
   3. הכנת supernatant תרבות שורת תאי עכבר פיברובלסטים L929;
      • תאי המחוברות L929 פוצלו 1:04, בתרבית ב175 סנטימטר ² צלוחיות במשך 2 ימים באמצעות 20 מיליליטר L929 בינוני וsupernatant התרבות נאספו לאחר 48 שעות, מסוננות והוסיפו לBMM בינונית
6. דגירה התאים סמוקים מעצם הירך בחממה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ אווירה.
7. אחרי כל 48 שעה (72 שעה לכל היותר) של דגירה, לשאוב את המדיום ולהחליף על ידי בינוני BMM טריות, לתקופה של עד 10 ימים. יותר מ 95% מהתאים היו חיוביים ל CD14 כפי שנבדקו על ידי cytometry זרימה. CD14 הוא קולטן זיהוי תבניות ביטוי בעיקר על ידי מקרופאגים. על ידי קביעת אחוז התאים חיוביים לקולטן זה, תרבות טהורה של BMMs חסיד כבר נוצרה.

הערה: להכין ותרבות התאים בהתאם אם סוגי תאים אחרים נמצאים בשימוש.

2. ציפוי של microbeads כphagocytic מטענים

1. להכנת ההשעיה חרוז 1 מיליליטר, השתמש 400 μl של .2.5% 3 מיקרומטר microparticles carboxylated קלקר, או microparticles החלופי.
2. מעביר את ההשעיה חרוז לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, לשטוף 3x עם PBS ולהוסיף 500 מ"מ 2 100 μl - (N-morpholino) אתניםמלח נתרן חומצת ulfonic, מאגר MES בpH 6.7 לגלולת חרוז.
3. ממיסים 50 IgG עכבר מיקרוגרם (נוגדן IgG polyclonal) ב50 μl סטרילי DDH ₂ O ולהוסיף להשעיה חרוז.
4. מלא את ההשעיה עד 1 מיליליטר עם סטרילי DDH ₂ O (450 μl).
5. דגירה הפתרון ל15 דקות על גלגל מסתובב ב RT.
6. הכן EDAC מקשר צולב, N-hydrochloride-N'-ethylcarbodiimide (3-dimethylaminopropyl) בריכוז של 10 מ"ג / מיליליטר ולהוסיף 14 μl להשעיה חרוז.
   הערה: קישורים צולבים EDAC אמין קבוצות של IgG עם קבוצות carboxyl על פני השטח של חרוזים ומאפשרים הקיבוע של IgG על פני חרוז. זה קריטי לספיג חרוז ולכן הפתרון צריך להיות מוכן טרי.
7. דגירה ההשעיה על גלגל מסתובב במשך שעה 1 ב RT.
8. הוספת 14 μl של צולב מקשר EDAC דגירה ההשעיה על גלגל מסתובב במשך שעה 1 ב RT.
9. צנטריפוגה ההשעיה ב 10,000 XG במשך 2 דקות בmicrocentrifuge.
10. שטפו את החרוזים 3x בחיץ תחנה (1% Triton-X 100 ב10 מ"מ טריס, pH 9.4) כדי לעצור את תגובת cross-linking, על ידי resuspending גלולה בחיץ התחנה וספינינג הפתרון ב10,000 XG במשך 2 דקות.
11. לשטוף חרוזים 3x ב PBS ו resuspend את הכדור ב 1 מיליליטר PBS.
    אופציונאלי: הכן aliquots עבודה של 30-50 μl.
12. אחסן את ההשעיה חרוז מצופה IgG על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ -4 שבועות ולא לאפשר ההשעיה להיות מוקפאת.

הערה: חומר משמר כגון אזיד נתרן בריכוז סופי של 0.02% (w / v) ניתן להוסיף להשעיה כדי למנוע צמיחה וזיהום חיידקים. במקרה זה שטיפת חרוזים לפני השימוש בו צריכה להתבצע כדי למנוע השפעות רעילות של חומר משמר. צנטריפוגה aliquot של ההשעיה על 10,000 XG במשך 2 דקות ולשטוף את החרוזים על ידי מחדשהשעיית גלולה ב-PBS. חזור 3x כביסה.

3. הכנת Dextran בדיקה מלאי הפתרון

1. ממיסים את טקסס האדומה 70,000 kiloDaltons Dextran (Dex70kD) ב-PBS ב20 מ"ג / מיליליטר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס, על פי הוראות היצרן.
   הערה: שמור את המניות ב -20 ° C עד מספר חודשים, או על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות, עיין בתיעוד של היצרנים.
2. הכן את פתרון dextran לניסוי מהמניות על ידי דילולו במדיום תרבית תאים מלא DMEM (DMEM, FCS 10%, 2 מ"מ L-גלוטמין) על כ 1 מ"ג / מיליליטר (פי כמה פתרון מרוכז שיהיה מדולל ל ריכוז סופי של עבודה 20 מיקרוגרם / מיליליטר לפני בנוסף לתאים).
3. השתמש במים אמבט אולטרסאונד כדי sonicate aliquot dextran במשך 5 דקות כדי homogenize הפתרון ולפזר אגרגטים שמאוחר יותר יכולים להוביל לדור חפץ במהלך הדמיה.
4. צנטריפוגה ב g המרביבמשך 5 דקות בmicrocentrifuge כדי להסיר כל גושים או מזהמים שלא נמסו מהפתרון.
5. להעביר בזהירות את supernatant לצינור טרי, תוך הימנעות גלולה בחלק התחתון של הצינור ולדלל את הפתרון לריכוז העבודה הסופי של 20 מיקרוגרם / מיליליטר במדיום תרבית תאים מלא DMEM.
6. סינון סטרילי הפתרון באמצעות מסנן רכוב 0.2 מזרק מיקרומטר.

4. Dextran Preloading

1. תאי זרע בצלחת זכוכית תחתונה הדמיה תא חי ודגירה של לפחות 12 שעה (על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO אווירה ₂₎ כדי להבטיח התקשרות והתאקלמות.
   הערה: ישנן מנות תחתית כוס מפולחת זמינות המאפשרות ביצוע ניסויים מרובים (עד ארבעה תאים) לכל צלחת.
2. הכן את dextran בפתרון DMEM כפי שתואר בפרוטוקול 3. לחמם את dextran הכין בפתרון DMEM, תוך שימוש באמבט מים ב 37 ° C.
3. לשאוב בינוניnd להוסיף פתרון dextran לתאים בזהירות ולדגור על 37 ° C ב 5% CO ₂ לאטמוספרה 2-8 שעה לספיגה.
   הערה: תכנית ולייעל את הפרוטוקול המבוסס על סוג הבדיקה ותא המשמש ולשמור בקפדנות משך זה כשחוזר על ניסויים. זה חיוני עבור הפרופיל של הצטברות dextran במסלול endocytic ולכן שחזור של ניסויים.
4. שטוף תאי 3x עם prewarmed DMEM הבינוני מלא; בינוניים לשאוב ולשטוף תאים בזהירות עם מדיום חדש.
5. דגירה תאים עם מדיום DMEM מלא ל4-12 שעות ב 37 ° C ב 5% CO ₂ אווירה.
6. שטוף תאים פעם אחת עם DMEM הבינוני האדום ללא prewarmed מלא פנול המסונן.
7. לקבלת תוצאות הדמיה אופטימליות, שינוי לprewarmed בינוני מלאה פנול המסונן DMEM האדום ללא לפחות 30 דקות לפני תחילת ההדמיה. פנול אדום עלולים לגרום למרווה של אותות ניאון, הגדלת רעשי רקע וובכך להפחית את ניגוד תמונה ובהירות.

הערה: הגדר את המיקרוסקופ והגדרות ההדמיה מראש, על פי פרוטוקול מתוכנן ומותאם המבוסס על הסוג של חללית ותאים שנמצאים בשימוש.

5. הוספת חרוזים מצופים IgG

1. לאזן aliquot של 1% השעיה חרוז preprepared לRT וsonicate באמבט מים אולטרסאונד ל2-3 דקות.
2. להוסיף 1-6 μl של ההשעיה חרוז 1% לבינוניים המלא המסונן פנול האדום DMEM החופשי מתחת לארון בטיחות ביולוגי בכיתה השנייה כדי למזער את הסיכון של זיהום (ריכוז התחלה טוב הוא 1 סנטימטר μl / 2 ² משטח צלחת).
   הערה: כאן BMMs היו זורעים ב25,000 תאים / היטב ו6 μl של 1% השעיה חרוז המניה התווספה למדיום בצלחת. זה בערך שווה יחס חרוז / תא של 15:01. היחס צריך להיות מותאם לסוג של התאים המשמש ולחומר חרוז; i.דואר. יש חרוזים לטקס בצפיפות נמוכה ולא לשקוע לקרקעית במהירות, ואילו חרוזי פוליסטירן לשקוע ובאים במגע עם התאים חסיד הרבה יותר מהר ובכך במספרים גדולים יותר.
   הערה: בהתאם לניסוי, זה עשוי להיות יתרון לבחור את האזור שיקוים מראש. השעיה חרוז ואז ניתן להוסיף רק לאותו אזור הספציפי של צלחת תחתית זכוכית, ולכן מגדילה את ההסתברות של התבוננות אירועי ספיגה נוחה.
3. הענן הסמיך של חרוזים יכול להיות מפוזר בעדינות על ידי pipetting ההשעיה בצלחת זכוכית התחתונה.
4. חכה עד חרוזים לשקוע לתחתית צלחת זכוכית התחתונה וכ באותו מישור עם תאי phagocytic חסיד.
5. להתמקד באזור של עניין (ROI) ולהתחיל זמן לשגות הדמיה.

הערה: ייתכן שיהיה צורך בכוונון העדין של הפוקוס בזמן הדמיה היא בתהליך, בהתאם למערכת ההדמיה המשמשת, STAbility והניידות של התאים שנצפו. עם זאת, שימו לב שזה עלול להפוך את הבלתי אפשרי, הניתוח הנכון של phagosomes שמאוד לסטות מהמטוס של מוקד כתוצאה ממיקוד מחודש.

6. הדמיה

עקוב אחר הקווים המנחים הכלליים הבאים לאיכות הדמיה אופטימלית;

1. השתמש במערכת הדמיה confocal כגון מערכת לייזר דיסק לסריקת או ספינינג.
   הערה: סריקת מיקרוסקופ confocal לייקה TCS SP5 AOBS לייזר הנשלט על ידי התוכנה לייקה LAS AF ומצויד בחדר בקרה סביבתית שימש כאן להדמית וידאו הזמן לשגות.
2. למטב את הגדרות ההדמיה כגון מהירות סריקה, הגדלה, רזולוציה, וכו '. באופן שיאפשר לשיעור של פריים בכל שנייה 7-20, בהתאם למערכת בשימוש.
   הערה: כאן, מהירות סריקת 200 הרץ, זום סורק 2x ומיצוע קו 2-3x ברזולוציה של resu 512 x 512 פיקסליםlted בזמן הקלטה בין 3-5 שניות / ראמה. שיעור של פריים בכל 10 שניות היה בשימוש כדי להקליט זמן לשגות סרטים עם משכי זמן של לפחות 120 דקות.
3. השתמש בהגדרות עירור / פליטה מתאימות המבוססות על המערכת המשמשת הדמיה ובדיקה (ים).
   1. למטב את הגדרות כדי למנוע צילום הלבנה מוגזמת.
      הערה: כאן, טקסס האדומה Dextran 70kD היה נרגש באמצעות DPSS (561 ננומטר) אור לייזר והפליטה זוהה על ידי גלאי לייקה היברידי (HYD) ב600-650 ננומטר עם שיא הפליטה ב 610 ננומטר. עוצמת לייזר צריכה להיות מותאמת לעוצמת האות והמשיך נמוכים ככל האפשר כדי למזער צילום הלבנה של fluorophore (ים) והשפעת רעילות תמונה של אור הלייזר על התאים. באופן כללי, חשוב לאזן את מהירות סריקה, מיצוע קו, רזולוציית סריקה, מרווח מסגרת ומשך ההדמיה כדי להשיג עוצמת אות תקינה ויציבה וללכוד את משך ספיגת חרוז ופרו התבגרות phagosome המלאסס.
4. כולל ערוץ בהיר שדה (BF) להתבוננות בחרוזים אם הם לא מצומד עם fluorophore.
   הערה: לצד ערוץ טקסס האדום, ערוץ BF שימש כדי להמחיש את חרוזים, אותו לייזר DPSS שימש כמקור ואות האור זוהה עם מכפיל תמונה גלאי (PMT).
   הערה: ודא כדי להחיל הגדרות הקלטה זהות בעת רכישת נתונים שהם ייאסף. פרמטרים החשובים ביותר הם: עוצמות לייזר עירור, הגדרת גלאי, הגדרות רכישה, הגדלת מרווחים ומסגרת. לא משתמש במרווחי מסגרת זהים יחייב צעד עקום מיצוע כנקודתי נתונים התצפית לא חופפות (לדוגמא: לאסוף תצפית עם מסגרות שנרכשו בכל שנייה 7 עם קבוצה נוספת עם מסגרות בכל שנייה 12). זה יגדיל את הצעדים הנדרשים לצורך הערכת הנתונים ודורש תוכנה נוספת עם פונקציה עקומה מיצוע, כגון OriginLab 'תוכנת סטטיסטיקת Pro של מקור (http://www.originlab.com/).
5. רצוי, לשמור את הווידאו בזמן לשגות בקובץ בפורמט יליד מערכת ההדמיה משמשת ולהימנע מיצוא בפורמטים דחוסים.

הערה: כאן, זמן לשגות סרטים נשמרו בפורמט הטבעי של לייקה LAS AF קבצים, אשר לאחר מכן ישירות מיובא כדי לפתוח בפיג'י (LIF.). פיג'י היא מסוגלת לקרוא את הפורמטים של קבצים המקוריים מרוב יצרני מיקרוסקופ באמצעות היבואן התוספת פורמטי ביו הכלול. יצוא קובץ סרט הזמן לשגות בסדרת תמונה עם JPG או TIFF או כקובץ וידאו בפורמט AVI מיכל אינו הכרחי או מומלץ. בנוסף לשמירה על איכות תמונה הטובה ביותר האפשרית מתוך ההתבוננות המקורית על ידי הימנעות אלגוריתמי דחיסת lossy (לדוגמא JPEG), תוך שימוש בפורמט קובץ מיקרוסקופ האם מבטחת שעוצמות meta-נתונים של הקובץ (חותמות זמן, הגדלה, לייזר ורכישה, הגדרות גלאי וכו ') נשמרה וזמין לפיג'י. עם זאת, אם מסיבה כלשהי, קבצי וידאו הזמן לשגות צריכה להיות מיוצאים בפורמט שונה לניתוח, הקפד להשתמש בפורמטים של קבצים דחוסים כגון סדרת תמונת TIFF וצבע RGB נפרד (אדום, ירוקים, כחולים) ערוצים כבר בשלב זה כ צעד, כמו פיג'י לעתים קרובות לא ניתן להפריד בהצלחה את ערוץ BF מערוצי צבע אחרים בקבצים מיוצאים. כמו כן, הקפד לשמור את קבצי מיקרוסקופ המקוריים כנקודת התייחסות.

7. ניתוח של סרטי זמן לשגות

1. השתמש ImageJ, פיג'י או כל תוכנה אחרת המספקת יכולת ניתוח עמותת אותות אנלוגים.
   הערה: כאן, פיג'י הייתה בשימוש לניתוח הזמן לשגות סרטים. פיג'י היא הפצת ImageJ המכילה חבילת עיבוד תמונה עם תפריטים מחדש כלי ותוספות מקוריות נוספות, זמינים להורדה בחינם בhttp://fiji.sc. התהליך המתואר בכת זויון מתואר באיור 2.
2. פתח את הקובץ בפיג'י על ידי לחיצה על "קובץ", "פתח" ובוחר את הקובץ, או על ידי גרירה ושחרור של הקובץ לפיג'י.
3. בחר את האפשרויות הבאות;
   1. סטאק צפייה: צפו במחסנית עם hyperstack,
   2. אפשרויות צבע: מצב צבע בצבעים,
   3. ערוצים מחולקים לחלונות נפרדים: ערוצי פיצול (לכל צבע ערוצי RGB שנרשם חלון נפרד ייפתחו).
4. במקרה סדרת תמונה היא לשמש, לטעון את הסדרה לפיג'י על ידי לחיצה על "קובץ", "תמונה ברצף" "יבוא" ולבחור בכל קובץ תמונה בתיקייה שמכילה את סדרת תמונת היעד.
   1. הגדר מסנן ותנאים לטעינה תמונות שנבחרו בסדרה, למשל;
      1. מספר התמונות: כמה מסגרות הן להיות טעון.
      2. החל תמונה: איזו תמונה היא מסגרת ההתחלה בסדרה.
      3. תוספת: התוספת ביןלהיות טעונה במסגרות (כל מסגרת, בכל מסגרת שנייה, וכו '.).
      4. שם קובץ מכיל: סינון לערוץ מסוים משתמש בשם הקובץ (לדוגמא על ידי קביעת "c001", וכך בדרך כלל תמונות מ" ערוץ 1 "מסומנות לאחר צבע הפרדת הזמן לשגות וידאו רב ערוצי).
5. הסר את קנה מידה על ידי לחיצה על "נתח", "קבע בקנה מידה ...", סימון התיבה "גלובל" ולחיצה על "לחץ כדי להסיר בקנה מידה".
   הערה: שלב זה מאפשר ניתוח של התמונות במקרה בהגדלה שונה הייתה בשימוש במשך הקבוצות ניסיוניות השונות, כי הם צריכים להיות מוערכים על בסיס פיקסל. אם הגדרות ההגדלה תמיד נשמרו קבועה וקובץ מיקרוסקופ האם היה מיובא ישירות לפיג'י, ניתן לדלג על שלב זה, כפי שפיג'י יכולה להבין ולהשתמש בנתוני הגדלה וקנה מידה מmetadata של קובץ מיקרוסקופ.
6. הגדר את פרמטר מדידהים על ידי לחיצה על "נתח", "מדידות הגדר" ובודק את התיבות הבאות: "אזור", "סטיית תקן", "צפיפות משולבת", "תווית תצוגה" ו" Mean ערך אפור ".
7. להפנות לערוץ הצבע שמכיל את האות מהבדיקה שתימדד ולאשר עם "אישור".
8. עבור למסגרת בה המדידות הן להיות נכתבו ובחר את חלון ערוץ BF על ידי לחיצה על הקצה העליון של החלון.
9. השתמש "כלי הבחירה הסגלגל" כדי לבחור אזור של עניין (ROI), כלומר החזר השקעה חוזר בחרוז הפנים. ודא כי הבחירה מצוידת היטב לקצה החיצוני של חרוז הגלוי כמו בערוץ BF.
   הערה: בעת שימוש במחשב, החזק את מקש Shift-תוך שימוש בכלי הבחירה כדי להבטיח החזר השקעה חוזר.
10. להתחיל את המדידה בצורה אופטימלית כמה מסגרות לפני ההיבלעות המלאה של חרוז הושלמה ולבמסגרת בה חרוז-phagosome המתהווה נוצר במלואו הוא נוצר וכוס phagocytic סגורה. זה צריכה להיות יחסית להבחין בבירור בערוץ BF.
11. עבור ל" נתח "ולחץ על" מדוד "לבצע את המדידה; התוצאה תוצג בחלון נפרד שכותרתו" תוצאות ".
12. עבור למסגרת הבאה, להתאים את המיקום של ההחזר על ההשקעה במקרה חרוז עבר, וחזור על המדידה. התוצאה תתווסף לרשימה בחלון התוצאה; כל מסגרת ניתחה יכולה להיות מזוהה על בסיס הערך בעמודה "לייבל".
    הערה: שימוש במקשי קיצור (לדוגמא "M" למדד) יכולה באופן משמעותי להאיץ את תהליך ההערכה; לראות את הרשימה של קיצורי דרך ולהקצות תחפושת אלה תחת התפריט "תוספים".
13. לאחר שסיים את המדידה של כל המסגרות הרלוונטיות, ניתן להעתיק את התוצאות ליישום גיליונות אלקטרוניים כגון MS Excel. בטור "IntDen" מתאר את intensitieים של האזור שנבחר בערוץ שהמדידה הייתה מנותב ל.

8. תיקון הלבנת

בהתאם לבדיקת שימוש והגדרות הדמיה, צילום הלבנה עלולה להתרחש. בהתאם להיקפה, זה יכול מאוד להשפיע על התוצאה של ההערכה. עם זאת, השפעה זו ניתן לתקן באופן חלקי על ידי יישום שיעור שווה אך הפוך של שינוי בערכים שנמדדו. אם הוא קיים, מקדם צילום הלבנה יכול להיות מחושב על ידי מדידת הירידה תלוית זמן עוצמת אות בכל המסגרת, או אזור ספציפי חתוך של המסגרת, בפרק הזמן הרלוונטי לניתוח של כל phagosome. תהליך זה מתואר באיורים 3 ו -4.

1. תחת תפריט "תוספים" של פיג'י, להשתמש "זמן סדרת Analyzer" plug-in כדי לקבוע את הירידה הכללית בכל המסגרת, או עוצמת החזר על ההשקעה ספציפית אות בדיקה לאורך זמן (איור 3).
   הערה: סדרות עתיות Analyzer תוסף זמין להורדה בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html, במקרה שלא קיים כבר בתפריט תוספים.
2. העלילה המדידה נגד זמן (בשניות) ב-MS Excel, רק למסגרות שמתאימות למסגרות של phagosome מנותח.
3. החלת קו מגמה ליניארי (איור 4 א) לעלילה; שיפוע שלילי לאות יורדת מעיד על קיומו של אפקט הלבנת-תמונה.
4. להחיל את השיפוע ההפוך לערכים מphagosome ניתח (4B דמויות ו4C): עוצמת אות מתוקנת (SI) = גלם SI + (זמן בשניות * להפוך מדרון)

הערה: כל phagosome ניתח אחד יצטרך פרק זמן מסוים (החל מ מסגרת ספיגה מלאה) במהלך סרט הזמן לשגות נרשם; צילום bleacהינג חייב להיות מחושב מחדש שלאורך מסוים ויהיה תקף רק לתיקון הערכים שנמדדו מזה phagosome הספציפי.

9. הערכת הנתונים

1. לאסוף נתונים ולחשב את השגיאה הממוצעת וסטטיסטית של הערכים מתוקני הלבנת בתוכנה מתאימה.
2. להתוות את הנתונים המוערכים בצורה מתאימה.

הערה: כאן, הסטטיסטיקה המדעית והתוויית תוכנת GraphPad פריזמה (http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/) הייתה בשימוש. תוכנת Prism היא מסוגלת ליצור ולהתוות עקומה ממוצעת עם מחווני שגיאה המקביל כל עוד יש את כל הנתונים באותה מסגרת הדולר (כלומר כל נרכשו עם באותו מרווחים, כגון מסגרת אחת כל 10 שניות).

הערה: וריאציות רחבות של ערכי SI המוחלט בתוך חזרות של אותו experimסט ent יציג שגיאה סטטיסטית גדולה מאוד ולעבד את הנתונים לבלתי שמיש. זה יכול להיות המקרה אם הפרוטוקול, הגדרות למשל הדמיה, אינו מוחזקים זהה לחלוטין בין חזרות ניסוי שונות שיש שנאסף.

ההכנה הנכונה של התאים והחרוזים להדמיה היא קריטית. איור 1 מציג את קווי המתאר של הזריעה, בדיקה טעינה וצעדי הדמיה ראשוניות בשיטה זו, המבוסס על הפרוטוקול מותאם שלנו לBMMs. זה חיוני, אפוא, כי הפרמטרים הפרוטוקול להיבדק ומותאם בהתאם לסוג של תאים ובדיקות שיש לעשות שימוש ב.

לאחר תוספת של חרוזים מצופים IgG לתאים שנטענו מראש, חשוב ששדה הראיה הוא נבחר באופן לספק את המספר הגדול ביותר של אירועי ספיגה פוטנציאליים במספר הגדול ביותר של תאים אפשריים, תוך שמירה על הגדרת הגדלה המוגדרת מראש של הפרוטוקול. כמתואר באיור 2, גישה זו יכולה לספק למספר גדול יותר של phagosomes analyzable בכל סרטון וידאו הזמן לשגות. בנוסף להגדלת נקודות נתונים לוידאו תשואה של כל קבוצת ניסוי, זה מקטין את הווריאציה הוצגה על ידי periphe משתנהתנאי RAL ומגביר את חוסנם של הנתונים.

מומלץ כי הליך מדידת אות עמותה (איור 2) יבוצע על ידי אותו אדם ובצורה עיוורת, אם אפשר. זה יכול לעזור להפחית את השגיאה על ידי ביטול מקורות אישי טעייה רבות ולהפחית את ההטיה, כהחזר על ההשקעה שהוקצתה לכל phagosome היא להיבחר ועבר באופן ידני אחרי כל מסגרת.

אמנם באופן טבעי את הכלל של "גודל המדגם הגדול יותר, טוב יותר" חל גם כאן, אנו נמנעים מהערכה יותר מ -5 חרוז-phagosome לכל תא בשדה הראייה כדי למנוע מתן משקל רב מדי לתא בודד כהתנהגות של כל תאים בתוך אותה התרבות הוא לא בהכרח הומוגנית 19. phagosomes אלה צריכים להיות נבחר באופן אקראי ככל האפשר. בהקשר זה, פרמטרים כגון phagosomes להיות גלוי במלואו במישור המוקד לכל משך הזמן של הדמיה וגם לא להיותמושפע הלבנת צילום מוגזמת הם חיוניים. יתר על כן, uptaking מספר גדול של חלקיקים גדולים על ידי תא בודד יכול להשפיע על דינמיקת ההיתוך לphagosomes בתא זה, ולכן יש לתת העדיפות לphagosomes הuptaken מוקדם יותר בתהליך על ידי יחסית "תא ריק". ככלל, המדידות בממוצע מלפחות חמישה תאים ממרחק של עד חמישה ניסויים בלתי תלויים (ומכאן, עד 25 phagosomes) אמורות לספק למובהקות סטטיסטיות טובות.

היישום של סדרות עתיות ניתוח או שיטה דומה כדי לזהות השפעת צילום הלבנה אפשרית (איור 3) הוא מאוד חשוב, כמו כמה בדיקות יסבלו מהלבנה חזקה בעוד חלקם מאוד צילום יציב. צעד תיקון צילום הלבנה (איור 4) צריך להיות מיושם רק אם אפקט הלבנה חזק הוא ציין בכל הניסויים עם אותה הבדיקה. יש לציין שיכול לתקן את התהליך הזה באופן חלקי בלבדההשפעה של הלבנת. חשוב לציין, הלבנת מוגזמת במקרים בודדים בלבד יכולה להיות סימן לתנאי nonoptimal, כגון עירור הלא נכון או הגדרות הדמיה, pH הבינוני הלא נכון, תאים בריאים, או חומרים כימיים nonfresh.

באיור 5 ג, חרוז-phagosome מסומן בחץ באיור 5 א ובאיור 5, הוא ניתח ועוצמת אות Dex70kD עמותה (SI) להתבגרות phagosome במהלך פרק זמן של 90 דקות היא להתוות. מקור הרעש בעקומה הוא מסגרת מסגרת וריאציות של האות הנמדדת בשל גורמים כגון חסימה של phagosome נותח על ידי תנודות phagosome ומישור מוקד אחרות. עם זאת, המגמה הזמנית של עמותת אות לphagosome היא בקלות ברורה. לאחר ממוצע של הניתוח מ10 phagosomes משני תאים גלויים באיור 5A, עקומה ממוצעת ניתן להתוות (איור 5D) שעבורו הדואר הסטטיסטיrror ניתן להתוות כסטיית התקן של ממוצע (SEM) או סטיית התקן (SD) בהתאם לגודל המדגם ותנאי ניסוי. בעוד ערכי SI המוחלט של עקומת הממוצע בדרך כלל שונים מזה של כל phagosome ניתח אחד, המגמה הזמנית היא בדרך כלל דומה מאוד. לאחר ניתוח, ניתן להסיק שהמשלוח של Dex70kD כמטען luminal lysosomal לחרוז-phagosomes בBMMs הסוג בר הגיע לרמה בתוך דקות 35-40 לאחר phagocytosis.

שיטה זו ולכן יכולה להיות מועסק על מנת לחקור את ההשפעה האיכותית או כמותי של גורמים שונים בתהליך התבגרות phagosome.

איור 1. הכנת תאים להדמיה. BMMs Preprepared הם זורעים בצלחת זכוכית תחתונה שעה לפחות 12 לפני תוספתשל דקסטראן, פתרון של dextran במדיום הוא הוסיף ב20 ריכוז מיקרוגרם / מיליליטר וטופחו במשך 2-8 שעות (טעינה), תאים נשטפים, בינוני טרי הוא הוסיף והתא טופח במשך לפחות 4 שעות (צ'ייס), תאים שטפתי שוב והשעיה חרוז הוא הוסיף ממש לפני תחילת ההדמיה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. הדרכת צעד אחר צעד לניתוח תמונה. לאחר טעינת הזמן לשגות וידאו או תמונה ברצף בערוצים שונים בפיג'י, ההערכה כדלקמן בשלבים הבאים (שים לב שהדמות מתארת ​​קולאז' תמונה ולא את כל החלונות המוצגים כאן יישארו פתוחים בו זמנית ). (א) לפי "נתח" בתפריט, פיקסל לקנה המידה מרחק מתאפסת במקרה meta-נתונים של התמונות אינם זמינים לפיג'י, הגדלה שונה כבר השתמשה בעבר בפיג'י או הקלטות הזמן לשגות הן בהגדלות שונות, על ידי לחיצה על (ב) "קבע קנה מידה", ( ג) סימון תיבת "גלובל", המחילה את האיפוס לכל סדרת התמונה שנטענה בהמשך ולחיצה על "לחץ להסרת סולם". (ד) ודא כי הן השדה הבהיר הסדרה (BF) ערוץ תמונה (שבו חרוז-phagosomes גלוי לעין) והערוץ המכיל אות בדיקה נטענים ויש לי את אותה מסגרת ספירה המדויקת וממדים פיקסל, למשל. שתי סדרות של כל 400 מסגרות עם 450 x 450 ממדי פיקסל. (ה) תחת תפריט "נתח", ניתן להגדיר את הפרמטרים של הערכה תחת "מדידות הגדר", שבו "אזור", "צפיפות המשולבת" ופרמטרים "תווית תצוגה" צריכים להיות נבחרות. (ו (ז) הדבר מבטיח המדידה של עוצמת אדום הערוץ באותו האזור של העניין (ROI) שמסומן על ידי הקו המקווקו והחץ הלבן באדום ערוצים. ההחזר על ההשקעה בחוזר נבחרה בערוץ BF באמצעות כלי הבחירה "הסגלגל". (ח) התחל את המדידה תחת, "מדוד" "נתח" או באמצעות פקודת הקיצור, וחזור לכל מסגרת של הסדרה כולה למשך הרצויה של ניסוי (למשל 90 דקות). בכל מסגרת, להעביר ולהתקין מחדש את מיקום ROI לחרוז-phagosome של הריבית ולציין כי הולכים למסגרת הבאה בסדרת BF ונותן את הפקודה "מדוד" באופן אוטומטי מודד את ההחזר על ההשקעה במסגרת המקבילה האדום הערוץ. תוצאות (i) מדידהיופיע כרשימה בחלון "תוצאות". תחת העמודה "לייבל", המסגרת המדויקת עבור כל קו מזוהה בבירור; להשתמש בזה כדי לבדוק למדידה חוזרת ונשנית של מסגרת אחת או דילוג על פריימים בסדרת תמונה ארוכה. (י) "IntDen" קצר לצפיפות משולבת הוא פרמטר הפלט הקריטי; להעתיק לפחות את התווית ואת הערכים "IntDen" לגיליון MS Excel להמשיך עם ההערכה. היחידה של ערך IntDen אינה מוגדרת ומצוין כיחידות שרירותיות (AU), זה לא יוצר שום בעיות, כל עוד הפרוטוקולים הם אחריו בקפדנות. בר סולם הוא 10 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. ניתוח של צילום הלבנה.60; (א) סדרת תמונה פתוחה בערוץ של עניין ולוודא הסולם הוסר במידת הצורך, (ב) לפי קליק "תוספים" תפריט (ג) "זמן סדרת מנתח". (ד) שימוש בכלי הבחירה המלבני, לצייר את ההחזר על ההשקעה מלבני המכסה את כל המסגרת כמעט, או לפחות את התא כולו של עניין לכל האורך של הסרט, (ה) להוסיף את ההחזר על ההשקעה שנבחרה, (ו) לחץ על "קבל ממוצע "תוצאות ו( ז) יוצגו ב" זמן עקבות" שולחן ו" זמן עקבות עלילה הממוצעת ". שים לב עם זאת, כי רק ערך "ממוצע" (Mean עוצמה) זממו נגד מספר המסגרת ולא את הערך "IntDen". (ח) על פי "ניתוח" בתפריט, "מדוד" לרוץ מבלי לשנות את כל פרמטרים אחרים, כדי למדוד את "IntDen" עבור בדיוק את אותו ההחזר על ההשקעה באותה המסגרת. זה יספק את המקבילה שליעוצמה ב" IntDen ", השתמש בערך זה כדי לחשב את מקדם ההמרה (שווה ל" השטח "), ויתאר את" IntDen "של ההחזר על ההשקעה של כל המסגרת נגד זמן בשניות ב-MS Excel. (י) לחץ על "רשימה", להעתיק את רשימת הערכים לגיליון Excel ולהמיר את כל הערכים "Mean" לערכי "IntDen". לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. תיקון של צילום הלבנה. בהתאם לבדיקת שימוש והגדרות הדמיה, צילום הלבנה עלולה להתרחש. זה יכול מאוד להשפיע על התוצאה של ההערכה.) ערכי הגלם IntDen (בau) של חללית מכל המסגרת הם זממו נגד זמן בשניות ב-MS Excel. להוסיף ליניאריקו מגמה;.. מדרון בבירור שלילי מעיד על קיומו של אפקט הלבנת-תמונה ב ') כדוגמא, החלת השופכין התהפכו על IntDen הגלם באמצעות נוסחת תיקון תשואות ערכי IntDen IntDen תיקן C) תוקנו מפוצה באופן חלקי על השפעה של צילום הלבנה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 5. מצגת של תאים, קינטיקה ומיצוע של האות המתוקנת נציג. א) BMMs טעון עם חללית dextran בדקות 0 על ספיגה של חרוז מצופה IgG מצויינים על ידי החץ. בר סולם הוא 10 מיקרומטר. מתאים לסרט 1 B) 2.5x מוגדל להכניס מסרט הזמן לשגות, המתאר את phagosome הצביע במשך תקופה של 85 דקות לאחר ספיגה, שקר בצבע עבור הראות טובה יותר עם ​​תראה למעלה שולחן "Thal" (LUT) בImageJ. ההחזר על ההשקעה phagosome הנמדדת מצויינים עם הקו המקווקו הלבן. מקרים של משלוח dextran וצבירה בphagosome מסומנים עם חצים לבנים. C) אותות הקרינה של דקסטראן טקסס האדום 70kDa נמסרו מlysosomes לphagosome המצוין. ד) מתוקן, בממוצע ערכי IntDen הקרינה מ10 phagosomes בתוך שני התאים הצביעו ± SEM . לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

יש המחברים אין לחשוף.