מדידת שינויים במגע רגישות בכף הרגל האחורית של עכברים באמצעות מנגנון אלקטרוני פון פריי

סיכום

מדידות פון פריי אלקטרוניות הן אלטרנטיבה יעילה ומשופרת לחוטי פון פריי הקלאסיים, מכיוון שהן מאפשרות מדידה מהירה ומדויקת של שינויים בספי הנסיגה המכאניים של מכרסמים לגירוי לחץ המופעל ברציפות לפני ואחרי אירוע דלקתי.

תקציר

מדידת שינויים הנגרמים על ידי דלקת בסף נסיגת כפות הרגליים האחוריות מלחץ מכני היא טכניקה שימושית להערכת שינויים בתפיסת הכאב אצל מכרסמים. ניתן למדוד את סף הגמילה תחילה בנקודת ההתחלה ולאחר מכן לאחר תרופות, ארס, פציעה, אלרגן או דלקת מעוררת אחרת על ידי הפעלת כוח מדויק על אזורים ספציפיים מאוד בעור. מכשיר פון פריי אלקטרוני מאפשר הערכה מדויקת של ספי משיכת כפות הרגליים האחוריות של העכבר שאינם מוגבלים על ידי גדלי החוטים הזמינים בניגוד למדידות פון פריי הקלאסיות. הקלות והמהירות של המדידות מאפשרות שילוב של הערכה של תוצאות רגישות מישוש במודלים מגוונים של כאב דלקתי ונוירופתי מהיר, שכן ניתן לבצע מדידות מרובות תוך פרק זמן קצר. ניתן לשלוט באופן פנימי במדידות ניסיוניות עבור נבדקים בודדים של מכרסמים כנגד תגובות בסיס בודדות וקריטריוני אי הכללה שנקבעו בקלות כדי לתקנן תגובות בסיסיות בתוך ובין קבוצות ניסוי. לפיכך, מדידות באמצעות מכשיר פון פריי אלקטרוני מייצגות שינוי שימושי של הבדיקות הקלאסיות המבוססות היטב המבוססות על נימה של פון פריי עבור אלודיניה מכנית של מכרסמים שניתן ליישם גם על מודלים אחרים של יונקים לא אנושיים.

מבוא

מחלות כרוניות לא מדבקות אחראיות לחלק לא פרופורציונלי של נטל התמותה והתחלואה האנושית¹. כאב כרוני מוכר יותר ויותר כמרכיב חשוב בנטל המחלה העולמי². זה סיפק תנופה גדולה לחידושים במניעה, ניהול וטיפול בכאב. יחד עם זאת, ישנן ראיות רבות לכך שהביולוגיה הבסיסית של הכאב היא מורכבת³. המנגנונים העומדים בבסיס כאב מגן, כמו גם כאב לא מסתגל וכרוני מצביעים על יחסי גומלין מורכבים בין מערכת החיסון למערכת העצבים^3,4. הבהרת מנגנונים אלה דורשת גישות ניסיוניות כמותיות קפדניות וניתנות לשחזור מניתוח מולקולרי לניתוח התנהגותי.

מודלים של מכרסמים לא יסולא בפז באפיון שחקנים מולקולריים של כאב דלקתי ונוירופתי⁵. הפחתת הזמן והעוצמה של תגובות שצוינו בעבר לגירויים מזיקים משמשת למדידת מצבי כאב בבעלי חיים אלה מכיוון שנבדקים מכרסמים אינם מסוגלים לדווח על תחושת כאב⁶. תגובות משתנות לטמפרטורה ולחץ משמשות בדרך כלל כמדדים לרגישות רקמות במודלים של מכרסמים של כאב דלקתי שיכול להיגרם על ידי זיהום^7,8, חשיפה כימית^{6, 9,10}, חתך כירורגי¹¹, כמו גם כאב נוירופתי הנגרם על ידי קשירת עצבים¹².

רגישות מכנית, או תגובה לגירוי לחץ, נמדדת לעתים קרובות באמצעות חוטי פון פריי קלאסיים (CvF) - סדרה (למשל 0.4-15 גרם¹³) של קצוות משוקללים המיושמים ידנית על רקמת הבדיקה במרווחים סדרתיים עד להתנהגויות כאב בבקרות לעומת נבדקי ניסוי. ישנן שיטות שונות לשימוש בקצות או בשערות אלה כדי להעריך רגישות מכנית^6,13; השיטה הנפוצה ביותר היא כדלקמן. טיפ עם לחץ מסוים (בתוך הסדרה; לדוגמה, 2 G^{, 13}) נבחר כנקודת התחלה, וסף הנסיגה של חולדה או עכבר של 50% (עוצמת הגירוי הנדרשת כדי לייצר תגובה 50% מהפעמים שהקצה מוחל על הרקמה) נקבע על ידי תנועה למעלה ולמטה במשקל הקצה בהתבסס על הצגת התנהגויות תגובה שצוינו קודם לכן¹³. לאחר מכן מושווים סף גמילה מוחלט של 50% לקבוצות הטיפול בין נקודות הזמן הבסיסיות ואחרי הטיפול. טכניקה ידנית זו גוזלת זמן רב למדי. בנוסף לזמן המוגבר שמבלה כל נבדק בתא פון פריי, זה גם מגדיל את מספר הפעמים שקצות בדיקה במשקלים שונים מוחלים על רקמות דלקתיות וגורמים לאי נוחות רבה יותר למכרסמים במחקר. יתר על כן, סף נסיגה של 50% מחושב ומושווה בין קבוצות מכרסמים; התגובות האישיות של נבדקי הניסוי בדרך כלל אינן מנורמלות לתגובות הבסיס האישיות הלא מטופלות שלהם, למעט, למיטב ידיעתנו, יוצא מן הכלל^{אחד 6}. כתוצאה מכך, נבדקים מכרסמים אינם מדווחים בדרך כלל ככאלה שהוקצו לקבוצות טיפול על בסיס תגובות בסיס עקביות בטווח שנקבע בעבר וגם נבדקים בודדים אינם מוערכים על בסיס קבוצה מיושמת באופן עקבי של קריטריוני אי הכללה המאפשרים לתקנן את תגובות הבסיס עבור כל קבוצה מסוימת של מחקרים ובדיקות.

כאן, אנו מציגים שיטה חלופית למדידת רגישות המישוש של כף הרגל האחורית של העכבר בעקבות חשיפה לארס Bothrops jararaca באמצעות מכשיר פון פריי אלקטרוני (EvF). קוניה ועמיתיו^היו חלוצים בשימוש בטכניקות EvF במכרסמים והשוו באופן שיטתי את יעילות CvF ו-EvF כדי להוכיח ש-EvF מספק מדד "רגיש יותר, אובייקטיבי וכמותי" של רגישות למישוש במודלים של מכרסמים של כאב דלקתי. בקצרה, במדידות EvF, קצה פוליפרופילן פון פריי לא היגרוסקופי בקוטר אחיד (0.8 מ"מ) בעל קשיחות מתאימה לרקמה הנבדקת מחובר לבדיקה אלקטרונית וקריאה המציגה את הכוח/משקל שבו המכרסם נסוג מהקצה. ישנם מספר הבדלים חשובים בין מדידות CvF ו-EvF. ראשית, תהליך מדידת התגובות הבסיסיות והניסיוניות באמצעות EvF יעיל מאוד מכיוון שניתן להפעיל לחץ על הכף האחורית בכוח הולך וגובר עד שיש תגובה ואין צורך לשנות טיפים כמו ב-CvF; בעלי חיים מבלים פחות זמן כלואים בתאי הבדיקה ולכן הם פחות לחוצים ונוחים יותר במהלך הניסוי. שנית, EvF מאפשר קלות יחסית ביישום של קריטריוני אי הכללה רציונליים עבור נבדקי המחקר בצורה של טווחים של סף בסיס מקובל. זה מאפשר סטנדרטיזציה של תגובות בסיסיות בתוך ובין קבוצות טיפול. שלישית, תגובת הנבדק לאחר טיפול ניסיוני מושווה תמיד לתגובת הבסיס האישית שלו, מה שיוצר בקרות פנימיות חשובות למדידות. רביעית, הדיוק של ספי הנסיגה נרשם ברמת רזולוציה גבוהה יותר מכיוון שניתן להפעיל לחץ ברציפות ולא במרווחים זמינים בצורה של משקולות של חוטים ידניים. כמו במבחני CvF מתוכננים היטב, ניסויים מבוססי EvF מבוצעים גם עם אותו חוקר (עיוור לטיפול) שמפעיל את הכוח ומתעד את התנהגויות התגובה. חשוב לציין שטכניקה זו דורשת זמן ומאמץ מצד החוקרים כדי לבסס עקביות פנימית של המדידות ודורשת תכנון ניסויים כך שיינתנו קצבאות מתאימות לעכברים שייתכן שיהיה צורך לשלול עקב תגובות בסיס לא עקביות.

הערכה קלה ליישום, יעילה ומבוקרת היטב של רגישות מכנית מקלה על הוספת הערכה התנהגותית למודלים של אירועים דלקתיים כגון ארס - הדוגמה שהשתמשנו בה כאן כדי להמחיש את היכולות והעוצמה של מדידות EvF במדידת שינויים ברגישות המישוש. מצאנו כי עכברים שוויצריים זכרים ND4 הראו רגישות מכנית מוגברת בעקבות הזרקת ארס שמקורו בצפע הבור הדרום אמריקאי Bothrops jararaca בכפה האחורית. תגובות התנהגותיות לוו בבצקת, זרם של נויטרופילים ודה-גרנולציה של תאי פיטום ברקמה הפגועה.

פרוטוקול

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכללת מקאליסטר (IACUC) אישרה את כל הפרוטוקולים. עכברים שוויצריים זכרים בני 8-12 שבועות ND4 שימשו לניסויים אלה.

1. הכנה והזרקה של ארס Bothrops jararaca

1. זהירות: ארס B. jararaca רעיל. ללבוש כפפות, מסכה והגנה על העיניים בעת הטיפול באבקה והכנת תמיסות.
2. יש לתת 45 מיקרוגרם/ק"ג ארס B. jararaca (משטר שנקבע על ידי ניסויים קודמים של תגובת מינון) או 0.9% מי מלח (10 מיקרוליטר) באמצעות הזרקה תוך-פלנטרית לשתי הכפות האחוריות באמצעות מזרקי אינסולין של 3/10 מ"ל עם 29 גרם x 1/2 במחטים. הערה: בהתאם לתכנון הניסוי, ניתן להזריק בנפרד פתרונות טיפול ובקרה לכל כף אחורית בהתאמה כדי לספק בקרות פנימיות בתוך כל נבדק.

2. התקנה ותפעול אלקטרוני של מכשירי פון פריי

1. הנח את יחידת פון פריי האלקטרונית על מעמד הבדיקה. ודא שהגשושית והכבל מחוברים כראוי ליחידת התצוגה, והפעל את המכשיר. הגדר את הקריאה לאפס (0.00 גרם) במצב ההגדרה, והנח בעדינות את משקל הבדיקה שסופק (5.00 גרם) על החרוט של בדיקת פון פריי.
2. רשום את הקריאה במחברת מעבדה, וחזור על הליך זה בסיום מפגש הבדיקה. אם יש פער גדול מ-0.20 גרם בין קריאות משקל הבדיקה שלך לפני ואחרי מפגש הבדיקה, או אם הקריאה משתנה לאחר הפעלת משקל הבדיקה, ייתכן שיהיה צורך בכיול מחדש של המכשיר (על ידי היצרן).
3. כדי להעריך את סף הנסיגה של כף העכבר האחורית, השתמש בקצה הפוליפרופילן המתאים מבין אלה שסופקו עם הבדיקה. בחירת הטיפ תלויה ברקמה הנבדקת. טיפים קשיחים עובדים היטב עבור רקמת כף הרגל האחורית הפחות רגישה והקשוחה יותר, בעוד שקצוות גמישים למחצה עשויים להיות בחירה טובה יותר עבור אזור רך יותר כמו רכס איברי המין (Chatterjea, לא פורסם). הרכיב בעדינות את הקצה הנוקשה על חרוט הבדיקה.
4. כדי להקליט את הלחץ המרבי המופעל, העבר את מצב ההפעלה מהגדרה לפעולה כך שהלחץ המרבי המופעל יירשם בתצוגה. במצב זה, קריאת הלחץ המקסימלית המופעלת תישמר על מסך התצוגה כאשר הגשושית נסוגה.

3. שיקולים כלליים להערכת סף משיכת כפות אחוריות

1. באופן אידיאלי, יש צורך בשני חוקרים כדי למדוד את סף נסיגת הכף האחורית (רגישות מכנית) באמצעות מכשיר EVF - אחד להפעלת המכשיר וביצוע המדידות, ואחר לתמלל את המדידות המוקלטות ולטפל בעכברים.
2. על מנת להפחית את ההטיה, החוקר המפעיל את המכשיר צריך להיות עיוור לטיפולים ולערכי סף הגמילה שנרשמו. יתר על כן, כדי להבטיח עקביות בין המדידות, אותו אדם צריך להעריך את כל ספי הנסיגה הבסיסיים והניסיוניים.
3. בצע את כל המדידות בחדר שקט ומבוקר טמפרטורה, ובאותה שעה ביום^ה-14.
4. הנסיין המתעד את המדידות צריך למקם כל עכבר בתאים נפרדים של בית פולימתיל מתאקרילט (PMMA) מרובה יחידות המוגדר על מעמד רצפת רשת. מכסים את התאים במכסי PMMA מחוררים, ומניחים חפץ כבד מעל, כדי למנוע מעכברים לברוח. הנח חומר סופג מתחת למעמד כדי לספוג/לאסוף פסולת מופרשת. אפשר לעכברים להתאקלם במשך 15 דקות בתאים לפני הערכת סף הנסיגה הבסיסית או הניסיונית ^6,7,10.
5. הכפות האחוריות של העכברים צריכות להיות נגישות בקלות דרך פתחי רצפת הרשת; לכן, הניחו את מעמד רצפת הרשת בגובה נוח על עגלה עם בלמים, או על ספסל יציב הנגיש מכל הצדדים.
6. במהלך המדידות, ייתכן שיהיה צורך להסיח את דעתם של עכברים באמצעות כדור מזון¹⁵ הממוקם ממש מחוץ לתא המדידה או רעש קל מאוד המופק על ידי הקשה או הפעלת עט לאורך רשת התיל של רצפת החדר לפני, אך לא במהלך, המדידה. זה גורם לעכבר להחזיק מעמד, מה שמאפשר לנסיין להתחיל לבצע מדידות ביתר קלות.

4. הערכת סף נסיגה של כפות אחוריות בסיסיות

1. יש לבצע את הסט הראשון של מדידות הבסיס 48 שעות לפני מתן הטיפול. אפס את הגשושית בעת הרכבת הקצה הקשיח. בעזרת שתי ידיים, הרם את הגשושית לאט כדי לעורר את האמצע (אזור כרית כף הרגל) של הכף האחורית השמאלית או הימנית (אם שתי הכפות קיבלו את אותו טיפול).
2. הגדל את הלחץ בהדרגה עד שנצפו התנהגויות תגובה נוסיספטיביות מוגדרות כגון נסיגת כפות אחוריות, ליקוק כפות אחוריות או קפיצת ארבע כפות^6,10. הנחו את החוקר השני לתמלל את הלחץ שעורר את ההתנהגות הנצפית.
3. מדוד את סף הנסיגה של העכבר הממוקם בתא הסמוך. המשך עד שתעריך את סף הנסיגה של כל עכבר פעם אחת. חזור על הפעולה ארבע פעמים נוספות, כך שכל עכבר נמדד פי 5 כפי שתואר קודם לכן¹⁰.
4. עבור כל עכבר, חשב את הערך החציוני של 5 המדידות, ולאחר מכן חשב כמה כל ערך חורג מהחציון. בחר 3 ערכים החורגים הכי פחות, וממוצע אותם כדי לקבל סף משיכה בסיסי כפי שתואר קודם לכן¹⁰. בהדגמה זו, המדידה תוקננה על ידי שימוש ב-3 מתוך 5 ערכים; בעוד שהמספרים הספציפיים של המדידות יכולים להשתנות בהתאם לתכנון הניסוי, חשוב לוודא שכל העכברים נדקרים מספר שווה של פעמים כדי להעריך את קווי הבסיס.
5. חזור על המדידות הבסיסיות 24 שעות לאחר מכן. בצע 5 מדידות לכל עכבר, וממוצע את 3 הקרובות ביותר לחציון כדי לקבל סף נסיגה בסיסי.
6. כדי לחשב את סף הנסיגה הבסיסי הממוצע של עכבר, ממוצע את סף הנסיגה הבסיסי שלו שנלקח ב-48 ו-24 שעות לפני הטיפול. אם סף הנסיגה הממוצע של קו הבסיס נמוך מ-3.50 גרם, או אם שני ערכי הסף הבסיסיים שונים ב-2.00 גרם או יותר, אל תכלול את העכבר בניסוי. קריטריונים אלה מבטיחים שלכל העכברים בניסוי יש תגובות בסיס עקביות, וסף נסיגה בסיסי גבוה מספיק המאפשר צפייה בסף נמוך יותר לאחר הטיפול.
7. הערה: סף ההחרגה יהיה תלוי ברקמה הנבדקת, בזן בעלי החיים הנחקר ובסוג הקצה בו נעשה שימוש. לדוגמה, מצאנו ש-3.5 גרם הוא אמת מידה שימושית לרקמת כף הרגל האחורית ND4, אך אזורים רגישים יותר כמו הרכס האנו-גניטלי זקוקים לסף הרחקה נמוך יותר (Chatterjea, לא פורסם).
8. הקצה עכברים לקבוצות טיפול כך שבסיס הנסיגה הממוצע של קבוצות הניסוי יהיה דומה ככל האפשר לפני מתן הטיפולים.

הערה: ניתן לבצע מדידות בסיסיות לפני 48 שעות לפני הניסוי. עם זאת, יש להשלים לפחות 2 סטים של מדידות בסיסיות במרווחי זמן קבועים לפני תחילת הטיפולים.

5. הערכת סף נסיגה ניסיונית של כפות אחוריות

1. העריכו את סף נסיגת הכפות האחוריות (רגישות מכנית) לאחר הטיפול בנקודות זמן מתאימות שנקבעו על ידי תכנון הניסוי. החזירו עכברים לכלובים שלהם עם גישה למזון ומים מיד לאחר השלמת המדידות.
2. בצע את השלבים המתוארים לעיל; בצע 3 במקום 5 מדידות כדי להפחית את האפשרות לגירוי יתר של רקמת הכף האחורית (המטופלת) במיוחד אם יש להעריך את הרגישות במספר נקודות זמן. אם שתי מדידות מתוך השלוש שנלקחו שונות ביותר מ-2.00 גרם, בצע מדידה רביעית.
3. חשב את הממוצע של 3 מדידות כדי לקבל סף נסיגה ניסיוני עבור כל עכבר. עבור כל עכבר שעבורו נלקחו 4 מדידות, חשב את הממוצע של שלושה החורגים הכי פחות מהחציון, על מנת לקבל את סף הנסיגה הניסיוני.
4. כדי להשיג סף נסיגת דלתא עבור כל עכבר בנקודת זמן מסוימת, הפחיתו את קו הבסיס מסף הנסיגה הניסיוני. חזור על הפעולה עבור כל העכברים וכל נקודות הזמן הניסיוניות⁹.
5. לבצע ניתוח סטטיסטי מתאים על הנתונים שנאספו. כאן השתמשנו ב-JMP 9.0 (SAS, Cary, NC) כדי לבצע ניתוח פוסט-הוק חד-כיווני של ANOVA ו-Tukey HSD.

תוצאות

מתן ארס מקומי של B. jararaca גורם לשינויים ברגישות המישוש של כף הרגל האחורית ובבצקת רקמות בעכברים זכרים שוויצריים ND4.

שעה וחצי לאחר מתן ארס של 45 מיקרוגרם/ק"ג, עכברים זכרים ND4 משכו את כפות רגליהם האחוריות בלחץ נמוך ב-3.0 גרם מקו הבסיס (איור 1A). נסיגה בסיסית עבור כל הקבוצות התרחשה ב~4.5 גרם של לחץ מופעל; לאחר טיפול בארס, עכברי ניסוי משכו את כפות רגליהם האחוריות בלחץ מופעל של 1-1.5 גרם (נתונים לא מוצגים). עכברי ביקורת שטופלו במי מלח הראו ירידה מועטה עד ללא ירידה בתגובה ללחץ בהשוואה לנקודת ההתחלה בכל נקודות הזמן שנבדקו. ירידה בסף התגובה בעכברים שטופלו נשמרה בבירור 3 ו-6 שעות לאחר הארס (איור 1A) ולא ניתן היה להבחין ביניהם לבין קבוצת הביקורת במשך 24 שעות (הנתונים לא מוצגים). הכפות האחוריות של עכברים מורעלים הראו בצקת רקמות האופיינית לדלקת. לאחר 1.5 שעות לאחר מתן הארס, כפות הרגליים האחוריות המטופלות, שנמדדו כפי שתואר קודם לכן¹⁰, היו בעובי של 1.5 מ"מ מאשר בנקודת ההתחלה; בצקת נמשכה במשך 3 ו-6 שעות (איור 1B). לעומת זאת, כפות שטופלו במי מלח לא הראו נפיחות או שינוי בעובי במהלך תקופת הניסוי. עבור הניסוי המייצג המוצג כאן, בסך הכל נעשה שימוש ב-21 עכברים למדידות בסיסיות ו-14 נבחרו להכללה בניסוי. אלה הוקצו לקבוצות טיפול כך שתגובות הגמילה הממוצעות בנקודת ההתחלה היו בסביבות 4.5 גרם לכל קבוצה בכללותה.

B. jararaca הנגרמים על ידי שינויים ברגישות המישוש מלווים בדה-גרנולציה של תאי פיטום וזרם נויטרופילים לכפות האחוריות של עכברים שוויצריים ND4.

בנוסף לרגישות מישוש מוגברת ובצקת רקמות, הערכנו גם זרם נויטרופילים (איורים 2A-B) ודה-גרנולציה של תאי פיטום (איורים 2C-D) בכפות האחוריות של עכברים מורעלים לעומת עכברים שטופלו במי מלח. נויטרופילים הם התאים הדלקתיים הראשונים שמגויסים לנגע ממחזור הדם וידועים כמתווכים תגובות נוסיספטיביות דלקתיות^10,16,17. תאי פיטום הם תאי זקיף השוכנים ברקמה¹⁸ ודה-גרנולציה של תאי פיטום נקשרה לתגובות נוסיספטיביות בכפה האחורית של עכברים¹⁰ ובדורה מאטר של חולדות¹⁹.

כאן, מצאנו שזרם הנויטרופילים לכפות האחוריות הארסיות גדל כמעט פי 1,000 בהשוואה לכפות האחוריות שטופלו במי מלח (איור 3A) כפי שהוערך על ידי ספירת קטעי רקמה פלנטרית סגיטלית מוכתמים בהמטוקסילין-אאוזין 4 מיקרומטר פרפין¹⁰ שנקטפו בשעה וחצי לאחר מתן הארס מעכברים שעברו המתת חסד.

בכפות שטופלו במי מלח, תאי פיטום פלנטרי ברקמת הכף האחורית היו שלמים ברובם או הראו דה-גרנולציה קלה (איור 3B). לעומת זאת, כפות אחוריות מורעלות הראו 15-20% דה-גרנולציה מתונה ונרחבת של תאי פיטום (איור 3B). קטעי הרקמה שתוארו לעיל נצבעו בכחול טולואידין ומספר הגרגירים הנראים לעין נספרו לכל תא פיטום שנצפה כדי לוודא את מצב הדגרנולציה כפי שתואר קודם לכן¹⁰.

איור 1. מתן ארס מקומי של B. jararaca גורם לשינויים ברגישות המכנית של כף הרגל האחורית, ובצקת רקמות בעכברים זכרים שוויצריים ND4. סף הנסיגה הבסיסי ורוחב כפות הבסיס הוערכו לאחר 48 ו-24 שעות לפני הטיפול התוך-פלנטרי בארס B. jararaca (Bjv; 45 מיקרוגרם/ק"ג) או ברכב (מי מלח) (10 מיקרוליטר). סף הגמילה הוערך ב-1.5, 3 ו-6 שעות לאחר הטיפול (A). רוחב כף הרגל (רוחב ממוצע של כף הרגל השמאלית והימנית של עכבר) באזור אמצע הכף הוערך באמצעות מחוגה דיגיטלית בנקודת ההתחלה ולאחר מכן 1.5, 3 ו-6 שעות לאחר הטיפול כדי לקבוע בצקת רקמות כפי שתואר קודם לכן¹⁰ (B). המובהקות מושווית לעכברים שטופלו בסאל (* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 בהתאמה). n = 10-11 עכברים לקבוצת טיפול. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. רגישות מכנית הנגרמת על ידי ארס B. jararaca מלווה בפירוק תאי פיטום וזרם נויטרופילים לכפות האחוריות של עכברים זכרים שוויצריים ND4. 3 עכברים/טיפול הומתו על ידי CO₂ לאחר 1.5 שעות לאחר הטיפול וכפות רגליהם האחוריות נכרתו, אוחסנו בפורמלין 10% למשך 24 שעות, והועברו ל-70% אתנול, הוסר במשך 1-2 שבועות ב-15% EDTA, והוטמע בפרפין. חתכים סגיטליים של 4 מיקרומטר נצבעו בהמטוקסילין-אאוזין (A-B) וכחול טולואידין (C-D) להדמיית נויטרופילים (A-B) ותאי פיטום (C-D), בהתאמה. התמונות נרכשו ב-400X ו-1,000X כפי שצוין. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. רגישות מכנית הנגרמת על ידי ארס B. jararaca מלווה בעלייה משמעותית ברמות הפירוק של תאי פיטום וזרם נויטרופילים לכפות האחוריות של עכברים זכרים שוויצריים ND4. נויטרופילים ותאי פיטום על קטעי רקמה מוכתמים נספרו באמצעות מיקרוסקופ CX21LED אולימפוס. נויטרופילים נספרו ב-3 כפות אחוריות לכל טיפול מהעקב ועד אצבעות הרגליים בשדות ראייה סמוכים בהגדלה של פי 400 (A). תאי פיטום נספרו ב-3 כריות רגליים/טיפול וסטטוס הדגרנולציה שלהם ניקוד על סמך מספר הגרגירים הנראים מחוץ לגבולות התא: שלמים (0), קלים (0-10), בינוניים (10-20), נרחבים (21+), כפי שתואר קודם לכן¹⁰ (B).  כדי להימנע מספירת אותם תאים פעמיים, החוקרים העריכו את מספרי הנויטרופילים ואת רמות הדגרנולציה של תאי הפיטום בחלקי הכפות האחוריות השתמשו ברשת העינית. החוקרים היו עיוורים לטיפולs. המובהקות הושוו לעכברים שטופלו ב-Sal (* = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 בהתאמה). n = 3 עכברים לקבוצת טיפול. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

דיון

מדידת השינויים בתגובות הגמילה היא כלי חשוב המשמש להערכת שינויים ברגישות המישוש במודלים של כאב ודלקת של מכרסמים. כאן אנו מדגימים את התועלת של מכשיר פון פריי אלקטרוני לביצוע הערכה זו. ישנם מספר יתרונות לטכניקה זו: 1) אנו יכולים להעריך במהירות את תגובות הנסיגה ללחץ המופעל עבור עכברים מרובים במספר נקודות זמן קרובות למדי זו לזו, 2) אנו יכולים להשתמש בקצה יחיד כדי להפעיל לחץ רציף וספציפי על אזור קטן של רקמה, 3) אנו יכולים למדוד במדויק את הלחץ המדויק המופעל כדי לקבל תגובת נסיגה, ו-4) אנו יכולים ליישם בקלות חתכים בסיסיים חזקים, קריטריונים להחרגה ובקרות פנימיות כדי להבטיח שהערכות התנהגותיות יהיו מדויקות ואובייקטיביות ככל האפשר.

השלבים הקריטיים להבטחת התוצאות הטובות ביותר עבור בדיקת EvF הם כיול מוקדם של המכשיר ושיטות מדידה עקביות. כמפורט בסעיף הפרוטוקול, יש לטפל במכשיר בזהירות ולהבטיח כיול נכון לפני ובמהלך השימוש. לפני ביצוע מדידות כלשהן, יש לאשר את קריאות משקל הבדיקה כדי להבטיח תפקוד אופטימלי של המכונה. אם הקריאות משתנות באופן משמעותי או אם קריאות משקל הבדיקה אינן מדויקות, יש לפנות מיד ליצרן כדי לכייל את המכשיר. עם זאת בחשבון, מומלץ להחזיק מכשיר פון פריי אלקטרוני לגיבוי, במידת האפשר, כדי לא לפגוע בניסויים רגישים לזמן עקב צורך בלתי צפוי בכיול המכשיר. יתר על כן, חוקר יחיד ומאומן היטב צריך לבצע את כל המדידות הבסיסיות והניסיוניות עבור מחקר נתון או סדרת ניסויים תוך שהוא נשאר עיוור לקבוצות הטיפול. יש להעריך עכברים בחדר שקט, להחזיק בטמפרטורה קבועה, להתאקלם בתאי ה-EvF למשך 15 דקות לפחות אך לא לרסן אותם בתא יותר מהנדרש (במיוחד אם נלקחות מדידות מרובות ביום אחד) כדי למזער שינויים התנהגותיים הנגרמים על ידי מתח ואי נוחות.

מדידות EVF מציעות שיפורים משמעותיים ביחס לטכניקות ה-CvF הקיימות. חוקרים יכולים להפעיל לחץ רציף ואינם צריכים לעבור בין קצות במשקלים שונים כפי שנעשה בניסויי נימה CvF⁶. זה מוביל לפחות דקירות ברקמה, וזה רלוונטי במיוחד במקרה של רקמה מודלקת או פצועה. ניתן למדוד לחץ מדויק שבו מתרחשת נסיגה לעומת שימוש במדידות נסיגה של 50% המוגבלות גם על ידי משקלי נימה זמינים המשמשים במדידות CvF¹³. מכיוון שניתן ליישם קריטריונים רציונליים ואחידים (כפי שנדון לעיל), ניתן להקצות עכברים לקבוצות ניסוי כך שלכל הקבוצות יש קווי בסיס ממוצעים דומים בתחילת הניסוי. מדידות EvF מעריכות את השינויים בתגובה ההתנהגותית לגירוי נתון, ולא את התגובות המוחלטות עצמן. לכן, השינוי של כל עכבר בתגובה הנוסיספטיבית נמדד כהבדל בין הנסיגות הניסיוניות האישיות והבסיסיות שלו, ובכך מספק בקרות פנימיות לכל מדידה שנעשתה.

אולי המגבלה המשמעותית ביותר של EvF היא שבדומה למקבילו הידני, אותו חוקר חייב לבצע את כל המדידות עבור סדרה מסוימת של מדידות בסיסיות וניסיוניות. זה הופך את הרחבת הטכניקה למאתגרת מבחינת זמן, כוח אדם וציוד. אנו מוצאים כי ניתן למדוד ~20 עכברים בכל פעם (תלוי בתצורת תאי הבדיקה) תוך 30-45 דקות או פחות במספר נקודות זמן בתנאי שיש לפחות 45 דקות בין המדידות. שיקול קשור בהקשר זה הוא עקומת הלמידה של נסיינים בודדים. יש לבסס עקביות פנימית לפני שחוקר בודד יכול לצאת לניסוי בקנה מידה מלא וזה דורש שעות רבות של תרגול ייעודי הכולל מדידות תגובה חוזרות ונשנות עד להשגת העקביות הרצויה. בנוסף, שימוש בחיתוכים בסיסיים מרמז שלא ניתן לכלול את כל העכברים המבוססים על ניסוי; אנו מוצאים ש-25-30% מהעכברים המבוססים על כל ניסוי אינם נכללים בדרך כלל.

במונחים של שינויים ויישומים עתידיים, מדידות התנהגותיות של EvF מוסיפות ממד רב עוצמה למגוון רחב של מודלים של דלקת כדי לנתח כאב חריף ו/או כרוני במקביל שיכול לעמוד בבסיס פתולוגיות דלקתיות. בארס, מצאנו כי שינויים בולטים ומהירים ברגישות המישוש ליוו את התוצאות הצפויות של נפיחות רקמות, גיוס לויקוציטים ודגרנולציה של תאי פיטום בכפות האחוריות של עכברים זכרים ND4. ממצאים אלה מאששים תצפיות קודמות לגבי תרומתם של מתווכי תאי פיטום לרגישות תרמית בחולדות²⁰ ורגישות מכנית הנגרמת על ידי ארס B. jararaca בעכברים שוויצריים ND4 שנמדדו באמצעות CvF²¹. ניתן לשנות בקלות את פרוטוקול ה-EvF לשימוש ברקמות שאינן כף הרגל האחורית, למשל בטן⁷ ורכס אנו-גניטלי⁸ שבו משתמשים כיום ב-CvF. ניתן להתאים בקלות מודלים של מכרסמים של אלרגיות, ריפוי פצעים, נוירופתיות ופתולוגיות אחרות כדי לכלול מדדים של רגישות מכנית ברקמות כולל ומעבר לכף האחורית.

לסיכום, EvF היא טכניקה שימושית ויעילה המעדכנת גישה קלאסית למדידת כאב במכרסמים ומהווה כלי חדש וחשוב בחקירת המנגנונים הבסיסיים המורכבים של כאב במגוון רחב של מודלים של מחלות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברים זכרים שוויצריים ND4	Harlan	0-32	עכברים ששימשו כאן היו בני 8-12 שבועות ושוכנו ושימשו בהתאם להנחיות IACUC של מכללת מקאלטר.
מזרק אינסולין 3 מ"ל/100 עם 29 גרם 1/2 במחט	BD	BD309301	יש להשליך לאחר כל שימוש למיכל המתאים.
B. jararaca ארס	Sigma	V5625	זהירות: חומר רעיל. יש ללבוש הגנה על העיניים והעור. יש להמיס במי מלח סטריליים של 0.9%.
מכשיר פון פריי אלקטרוני; בדיקה = טווח 90 גרם	IITC	2394	זז בעדינות וודא שהוא תמיד אופקי. לאפס את הבדיקה, לחץ על "תוכנית" ו"נקה". למעבר ממצב הגדרה להפעלה, לחץ על "פונקציה" (לקריאת "MH") או "MAX".
מעמד רשת + תאי PMMA	IITC	410	הנח על משטח ספסל יציב או עגלה עם ארבעה גלגלים על מנת לגשת לכל הצדדים.
קצוות קשיחים אלקטרוניים של פון פריי בלבד, טווח 90 גרם	IITC	2390	n/a