ציטוטוקסיות יעילות של טיפול פוטודינמי בתאי אוסטאוסרקומה<em&gt; במבחנה</em

סיכום

הפרוטוקול דיווח כאן מאפשר ההערכה של היעילות של טיפול פוטודינמי (PDT) בשורות תאים ואופטימיזציה של הגדרות PDT לפני יישום הטיפול במודלים של בעלי חיים.

תקציר

בשנים האחרונות, חל קושי במציאת טיפולים יעילים יותר נגד סרטן עם תופעות לוואי מערכתיים פחות. לכן הטיפול פוטודינמי הוא גישה חדשנית לטיפול סלקטיבית יותר גידול.

טיפול פוטודינמי (PDT), שעושה שימוש בפוטוסנסיטייזר רעיל (PS), אשר, על הפעלה עם אור באורך גל מסוים בנוכחות חמצן, יוצר רדיקלים שיעוררו תגובה ציטוטוקסיות ^1. למרות אישורה לפני כמעט עשרים שנה על ידי ה-FDA, PDT הוא כיום משמש רק לטיפול במספר מצומצם של סוגי הסרטן (עור, שלפוחית ​​השתן) ומחלות nononcological (פסוריאזיס, keratosis actinic) ^2.

היתרון העיקרי של השימוש בPDT הוא היכולת לבצע טיפול מקומי, המונע תופעות לוואי מערכתיות. יתר על כן, היא מאפשרת טיפול בגידולים באתרים עדינים (למשל סביב עצבים או כלי דם). הנה, intraoperatיישום ive של PDT נחשב באוסטאוסרקומה (OS), גידול של העצם, כדי למקד את לוויני גידול ראשוניים נשאר מאחור בגידול רקמות לאחר כריתת גידול כירורגית. הטיפול שמטרתו להפחית את מספר הישנויות ולצמצם את הסיכון לגרורות (לאחר ניתוח).

במחקר הנוכחי, אנו מציגים במבחנה נהלי PDT להקים הגדרות PDT אופטימליות לטיפול יעיל של שורות תאים בשימוש נרחב מערכת הפעלה המשמשות לשחזר את המחלה האנושית בעכברי מודל OS intratibial מבוססים היטב. הספיגה של mTHPC נ.ב. נבדקה בספקטרופוטומטר וphototoxicity היה עורר עם עירור אור הלייזר של mTHPC ב652 ננומטר כדי לגרום למוות של תאים הוערך עם assay WST-1 ועל ידי הספירה של תאים ששרדו. הטכניקות הוקמו תאפשר לנו להגדיר את הגדרות PDT אופטימליות למחקרים עתידיים במודלים של בעלי חיים. הם כלי קל ומהיר להערכת היעילות של טיפול פוטודינמי in vivo.

מבוא

המצב של היום של טיפול האמנות של אוסטאוסרקומה (OS), גידול עצם עיקרי, כולל שילוב של כימותרפיה adjuvant הניאו וניתוח. משטר טיפול זה גילה עלייה בשיעור ההישרדות של חולים עם מחלה מקומית מכ 20% לפני השימוש בכימותרפיה, כדי כיום בין 60-70% ^{3, 4.} עם זאת, בשני העשורים האחרונים, ההישרדות הכוללת של חולים עם מחלת OS מקומית התייצבה ^{4, 5.} יתר על כן, 30-40% מהחולים האלה להשנות תוך 3 שנים לאחר אבחון וחולים עם מחלה גרורתית ימשיכו להיות הישרדות עניות של 20-30% ^{4, 6, 7.} כדי לשפר את התוצאה של חולים אלה, אסטרטגיות טיפוליות חדשות צריכים להיות מפותחות.

טיפול פוטודינמי (PDT), טיפול נגד סרטן ולא רומן, משתמש באור באורך גל מסוים לעירור של photosensiTizer (PS), אשר מצטבר בתאים הסרטניים לאחר הזרקתה למחזור הדם. אור עירור הלייזר של PS מייצר רדיקלים בנוכחות החמצן, אשר לגרום לתגובה ציטוטוקסיות בתאים סרטניים ומוות של תאים. חוץ ממנגנון עיקרי זה, שני PDT נוסף עורר תהליכים ביולוגיים יתרמו לצמיחת גידול מופחתת: PDT גורם להתכווצות כלי דם והיווצרות קרישי דם על נימי הדם הזעיר וגידול, וכתוצאה מכך היפוקסיה מקומית ואנוקסיה בתוך הגידול, מה שמוביל לאוטם גידול. לבסוף, PDT נפצע ותאים סרטניים מתים לעורר תגובה חיסונית מקומית, תכונה ייחודית למדי של PDT. זה כולל את מערכת המשלימה והפעלה של אנטיגן הצגת תאים דנדריטים ^8. לכן, תנאים שנוצרו להצגת אנטיגנים סרטניים עם ההפעלה הבאה של תאי הלימפה, מה שמובילים לחסינות ספציפית גידול.

עד כה, PDT כבר בשימוש לטיפול בסוגים שונים של גידולים ברקמות רכים וhyperplאסיה של, כגון keratosis actinic, ושטו בארט, גידולי Endobronchial, סרטן שלפוחית ​​השתן, קרצינומה של תאים הבזליים, וטיפול פליאטיבי של סרטן הראש והצוואר ^2. הטיפול ידוע לגרום נמק בקנה מידה מקומי, גדול עם מעט תופעות לוואי בלבד, ולכן יש לו הפוטנציאל למיגור רקמת גידול באופן סלקטיבי. למרות יתרונות אלה, היישום של PDT נשאר מבחינה טכנית תובעני יותר מהממשל של תרופות כימותרפיות. על מנת להשיג יעילות מרבית, ריכוז PS, זמן חשיפה לאור וסך העברת אנרגיית אור צריך להיות מותאם. ניתן לעשות זאת בניסויי vivo, אבל, בגלל המספר הגדול היחסי של פרמטרים שצריכים להיות מותאמים, הוא יעיל יותר בהתחלה כדי לקבוע תנאים אופטימליים במבחנה.

בניסויים שתוארו להלן, שבדקנו את היעילות במבחנה של PDT באמצעות CHL PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyphenyl)אורין, מקוצר mTHPC (איור 1 א). mTHPC הוא החומר הפעיל במוצר הרפואי Foscan, אשר משמש כיום במרפאת לטיפול פליאטיבי של סרטן הראש והצוואר. זהו אחד נ.ב. החזק ביותר, גרימת נזק לתאים מסיביים כבר בריכוזים נמוכים, וזה הודגם להיות עדיף על PS האחר במונחים של רקמת חדירה ^{9, 10.} ספקטרום בליעת האור שלו (איור 1) מראה שתי פסגות בולטות, אחד ב417 ננומטר ושני ב652 ננומטר, המשמשות ללוקליזציה רקמות של צבירת PS ולזירוז PDT, בהתאמה.

נכון לעכשיו, ניסוח liposomal לmTHPC הוא בפיתוח. כאן, אנו מתארים את הנהלים לכמת את הספיגה של ניסוח liposomal זה, ולבצע PDT בשתי שורות תאי מערכת הפעלה אנושיות; HOS גרורתי הנמוך ותאי 143B גרורתי גבוהים. חלק מהנתונים שהוצגו כאן כבר דיווחו ¹¹ קודם לכן. הגישת דואר המתוארת כאן מאפשרת לנו לחקור את ההשפעה של פנוטיפ גרורתי ביעילות PDT. 143B תאים, הזריקו orthotopically לגפיים האחורי של עכברי SCID חסרים חיסוניים לגרום לגידולי intratibial גרורות ראשוניים, מודל חיקוי המחלה הגרורה האדם באופן הדוק. לכן, בניסויים במבחנה המוצעים הם בצורה מושלמת מתאימים כדי להעריך את ההגדרות אופטימלי PDT להיות מאוחר יותר נעשה שימוש בניסויי in vivo.

פרוטוקול

1. השוואה בין הספיגה של mTHPC בנמוכה ביותר בהתאמה וגרורתי HOS ושורות תאי 143B OS

1. להכין מדיום תרבית תאים המכיל DMEM, Ham F12, וסרום חום מומת עוברי עגל ב4.5:4.5:1 יחס.
   הערה: ניסוח liposomal של mTHPC נ.ב. היה מומס במים בריכוז סופי של 1.5 מ"ג / מיליליטר mTHPC.
2. HOS פלייט 0.2 x 10 ⁶ ותאי 143B / גם ב6 צלחות היטב (triplicates עבור כל תנאי) ולתת לתאים לדבוק לילה.
   שים לב: המספר צריך להיות מותאם לשורות תאים בודדות. Confluency של 80-90% הוא מתאים ביותר בעת הניסוי.
3. ביום למחרת, דגירה התאים עם ריכוז קבוע של mTHPC לתקופות זמן שונה (ספיגה תלויה בזמן), או עם עלייה בריכוזים של mTHPC במהלך פרק זמן קבוע (ספיגה תלויה במינון).
4. דגירה התאים עם mTHPC עבור p זמן מסויםoints או ריכוזים של mTHPC.
   שים לב: במחקר זה, הן את HOS ושורות תאי 143B הודגרו עם 0.6 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC עבור 0, 2.5, 5, או 10 שעה, או עם 0, 0.6, 2.5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC במשך 5 שעות. פרקי הזמן שיושמו ומינונים עשויים להשתנות תלוי בשורה של התאים המשמשת.
5. זכור תמיד לעבוד בחושך או בתנאי תאורה מעומעמים כדי למנוע חשיפה לאור ישירה של התאים.
6. לאחר הדגירה של התאים בתנאים מצויינים, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. בשלב הבא, לנתק את התאים עם 0.5 מיליליטר טריפסין / EDTA ולספור את התאים.
7. לאחר ניתוק, צנטריפוגה התאים ב XG 400 למשך 5 דקות, לשאוב את המדיום וresuspend תאי PBS לצפיפות סופית של 200,000 תאים / מיליליטר.
8. של ההשעיה התא שהושגה פיפטה 100 μl (כלומר 20,000 תאים) בצלחת 96 היטב ולמדוד את הקרינה של תאים אלה בספקטרופוטומטר הקרינה. ההגדרהשל מדידות הקרינה mTHPC הם: 417 ננומטר לעירור ו652 ננומטר לפליטה.
9. על מנת לחשב את כמות mTHPC המופנם לכל תא, לנרמל את יחידת הקרינה היחסית (RFU) למספר התא ונפח תא כדלקמן:
10. הכן את עקומת סטנדרט באמצעות ריכוזים שונים של mTHPC ב-PBS 0-4 מיקרוגרם / מיליליטר (מדידות בשלושה עותקים לשימוש). פיפטה של ​​דילול כל 100 μl בצלחת 96 היטב ולמדוד את הקרינה של הבארות תוך שימוש בהגדרות שתוארו בשלב 1.6.
11. מחלקים את RFU (המתקבל ל20,000 תאים) על ידי שיפוע העקום הסטנדרטי ליניארי של mTHPC, אשר נותן את הריכוז של mTHPC (במיקרוגרם / מיליליטר) בבאר.
12. מחלקים ריכוז mTHPC זאת על ידי 10 כדי לקבל את הסכום הכולל של mTHPC בבאר אחת (במיקרוגרם, המייצג את ההשעיה תא 100 μl) ולחלק את הערך הזה בנפח של 20,000 תאים.
13. לחשב את הנפח עם הנוסחה לתחום: (4/3 π x) xr ^3. השג את הרדיוס r על ידי מדידת הקוטר של 20 תאים trypsinized תחת מיקרוסקופ, וחלוקת ערך זה על ידי 2.
14. לבסוף, לנרמל את כל הערכים לאלו שהושגו עבור תאי HOS לאחר 10 שעות של דגירה (ספיגה תלויה במינון) או מטופלים עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC (ספיגה תלויה בזמן), שנקבעו ל100%.

2. מדידה של phototoxicity של PS במבחנה

1. זרעי 3,000 תאים / היטב בצלחת 96 היטב (triplicates עבור כל ריכוז של mTHPC משומש) ולתת להם לדבוק בלילה. כמו כן להכין צלחת 96 היטב נוספת ולטפל בתאים כמתואר בהמשך, אבל אז לשים אותם בצד להדמיה בניגוד שלב.
   שים לב: המספר צריך להיות מותאם לכל שורת תא בודדת. Confluency של 50-60% בעת הניסוי הוא אידיאלי.
   1. זכור להוסיף את שליטת הרעילות הכהה המתאימה של תאים לכל אחד מריכוזי mTHPC.se הם תאים שיהיה הודגרו בהעדר או הנוכחות של ריכוזים נבחרים של mTHPC, אבל לא יהיה מואר.
2. ביום למחרת, דגירה התאים עם ריכוזים שונים של mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר) בהתאם לשורות התאים ו לשמור אותם בחושך במשך 5 שעות.
   1. עיין בסעיף 1.3.2
      הערה: זמן הדגירה לפני התאורה תלויה בשורת התאים ועל PS בשימוש, ולכן מומלץ לבדוק את הריכוזים שונים ובנקודתי זמן שונות בניסויים נפרדים.
3. לאחר דגירה לתקופה הזמן המצוינת, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהוסיף בינוניים טרי חדש ללא mTHPC.
4. להאיר את התאים עם לייזר 652 ננומטר דיודה, ספציפי לספקטרום ספיגת mTHPC (ראה איור 1).
   1. הגדר את הלייזר ל21.88 mW / ² סנטימטר כוח בגובה של 13.5 dista סנטימטרNCE מהתאים, על מנת לקבל את מנת אנרגיה של 5 J / ² סנטימטר. להאיר את התאים ל230 שניות. אל להאיר את תאי שליטת רעילות הכהים (עם ובלי mTHPC).
      שים לב: תמיד להרכיב משקפיים כדי להגן על העיניים מפני אור הלייזר המשמש לעירור של PS.
5. לאחר הארה, לשמור על התאים בחושך ב37 º C למשך 24 שעות. בהמשך לכך, להוסיף tetrazolium מסיס במים מגיב (WST-1) (10 μl/100 μl של מדיום).
6. שלוש שעות לאחר התוספת של המגיב WST-1, למדוד את הספיגה של בארות בודדות של צלחת 96 היטב ב415 ננומטר.
7. כדי לחשב את אחוז התאים ששרדו, קבע את הממוצע של הערכים שהתקבלו עבור תאי mTHPC שאינו מטופלים עבור כל תנאי ל100% (המוארים כלומר, ללא mTHPC וnonilluminated, ללא mTHPC).

3. הערכה של מספר סלולרי על ידי ספירת תאים

1. תאי זרע 20,000 /ll בצלחת 24 גם ולתת להם לדבוק בלילה.
2. דגירה התאים עבור שעה 5 עם mTHPC (0.001, 0.003, 0.15, 0.6, ו1.25 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהאיר אותם כפי שתואר לעיל.
3. לאסוף את המדיום, לשטוף את תאי פעם עם PBS, trypsinize אותם ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב XG 400 למשך 5 דקות.
4. לאחר צנטריפוגה, לשאוב את המדיום וresuspend התאים 200 μl של מדיום חדש.
5. ספירת התאים בתא נויבאואר.

תוצאות

בעזרת הטכניקות כאן דיווחו, אנחנו בדקנו PDT מבוסס mTHPC בתאי מערכת הפעלה אנושיים. ראשית, הספיגה תלויה בזמן ובמינון של mTHPC נחקרה בHOS גרורתי הנמוך ובשורות תאי 143B OS גרורתי מאוד. ספיגת mTHPC יכולה להיות מוערכת על ידי מדידת הקרינה של mTHPC עם ספקטרופוטומטר הקרינה (איור 2, לשכפל באישור מריידי et al. ^11). איור 2 א ממחיש את הספיגה של mTHPC באופן תלוי בזמן. עוצמת הקרינה של ההשעיה התא מייצגת את הרמות תאית של mTHPC. איור 2

דיון

כדי להשיג cytotoxicity האופטימלי בתגובה לPDT, זה הכרחי כדי לבחור את הגדרות לייזר אור הנכונות ובזמני דגירה. הנהלים שתוארו כאן הם עקביים ויעילים כדי לקבוע ספיגת PS ולכמת cytotoxicity PDT מושרה במבחנה. שימוש באורכי גל הקליטה הספציפי של mTHPC PS, ספיגת PS הסלולרית ניתן לקבוע באופן ישיר, וPS יכול להיות מופעל כדי ליצור מיני חמצן תגובתי ציטוטוקסיות.

שימוש בהגדרה זו במבחנה, ניתן להתאים את כל הפרמטרים כג...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	PAA GmbH , פרייבורג, גרמניה	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, פרייבורג, גרמניה	E15-817
סרום עגל עוברי מושבת בחום	GIBCO, באזל, שוויץ	10500-064
mTHPC	biolitec Research GmbH, ינה, גרמניה		מכיוון שהנוסחה הליפוזומלית הזו מקורה במחקר & D אין מספר קטלוגי זמין כרגע. מלאי: 1.5 מ"ג/מ"ל; מסופק בתערובת 9:1 של דיפלמיטואיל פוספטידילכולין (DPPC) ודיפלמיטואיל פוספטידילגליצרול (DPPG; >טוהר 99%)
Spectramax Gemini XS קורא צלחות	מכשירים מולקולריים, Sunnyvale, CA	ID# 861
מיקרוסקופ Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena גרמניה
Ceralas PDT 652 nm לייזר	biolitec AG, Jena, גרמניה	LD652nm2W400u
ריאגנט טטרזוליום מסיס במים (WST)	Roche Diagnostics AG, רוטקרויץ, שוויץ	1644807