סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
סחר endocytic מוסדר הוא המנגנון המרכזי המאפשר מגוון רחב של אירועי neuromodulatory, על ידי השליטה באופן דינמי קולט, ערוץ יון, והצגה פני תא טרנספורטר בזמן בקנה מידה דקות. יש מגוון רחב של מנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבונים בודדים. מחקרים חוקרים את הבסיס המולקולרי של סחר הסתמכו בעיקר על biotinylation פני השטח כדי למדוד באופן כמו שינויים בביטוי פני חלבון קרום בתגובה לגירויים אקסוגניים ומניפולציה גנטית. עם זאת, גישה זו הייתה מוגבלת בעיקר לתאים בתרבית, אשר לא יכול לשקף נאמנה את המנגנונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית במשחק בנוירונים בוגרים. יתר על כן, גישות תאים בתרבית עשויות לזלזל הבדלי אזור ספציפי במנגנוני סחר בנשים. כאן, אנו מתארים את הגישה המרחיבה biotinylation פני תא להכנת פרוסה המוח החריף. אנחנולהוכיח כי שיטה זו מספקת גישה באיכות גבוהה למדידת שינויים מהירים ברמות פני חלבון קרום בנוירונים בוגרים. גישה זו עלולה להיות כלי רחב בתחום הסחר בendocytic העצבית.
מבוא
סחר endocytic הוא מנגנון סלולארי בכל מקום שמכוונן מצגת קרום הפלזמה של מגוון רחב של חלבוני קרום נפרד. אנדוציטוזה מספקת חומרים מזינים חיוניים לסביבה תאית 1 וdesensitizes איתות קולטן בתגובה לקולטן הפעלה 2. Endocytic מחזור חזרה לקרום הפלזמה יכולה בנוסף לשפר את האיתות תאית על ידי הגדלת רמות ביטוי חלבון על פני תא 3. יתר על כן, הפרעות סחר קרום הם מעורבים במספר רב של מחלות ומצבים פתולוגיים 4,5, והדגישו את הצורך לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים בסחר endocytic חלבון. בעוד חלבונים רבים לנצל מנגנונים קלאסיים clathrin תלוי הפנמה, הרכבה ראיות בשנים האחרונות מוכיח כי מנגנוני endocytic clathrin....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הטיפול בבעלי החיים וקצירת רקמה בוצע בהתאם להנחיות של אוניברסיטת ועדת שימוש בבעלי חיים מוסדי טיפול בית הספר לרפואה של מסצ'וסטס (IACUC), בעקבות # פרוטוקול A1506 אישר (Melikian, PI).
פתרונות נדרשים
נוזל השדרתי מלאכותי (ACSF) - הפוך טרי מדי יום
125 mM NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ אא 2 PO 4, 1.2 מ"מ MgCl 2, 2.4 מ"מ CaCl 2, 26 מ"מ NaHCO 3,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
טרנספורטר דופאמין העצבי הפנים בתגובה להפעלת PKC בשורות תאי 16-20. למרות דיווחים רבים הוכחת הפסדי משטח DAT-Induced PKC במגוון רחב של שורות תאים ומערכות ביטוי, זה כבר מאתגר כדי לאשר את הממצא הזה בנוירונים דופאמין בתרבית 21-23. אנחנו השתמשנו פרוסות של הסטריאטום עכבר כדי לבדוק ישירות אם DAT מפנים בתגובה להפעלת PKC בנוירונים דופאמין המבוגרים. בעקבות הכנת פרוסה, פרוסות היו התפצלו לפתע לאורך קו האמצע ופרוסות ממטוסים זהים טופלו ± 1 מיקרומטר phorbol אצטט Myristate-13 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למרות ידע רב שנים שסחר endocytic ביקורתי איתות הסינפטי משפיע במוח, זה הוכיח מאתגר למדוד כמותית שינויים בביטוי פני חלבון בתאי עצב בוגרים. בעבודה זו, אנו מדווחים גישה אמינה לתייג חלבון משטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות. יש הכנות פרוסה מוח בעל היסטוריה ארוכה של שירות עבור קלטות אלקטרו, כפי שהם שומרים על קשרים סינפטיים ותא כדאיות עד שעות לאחר ההכנה שלהם. יתר על כן, יכולה להיות מותאמים אסטרטגיות חיתוך לשמר קשרים סינפטיים מסוימים בין אזורי מוח השונים של עניין.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים סכסוך שעם העבודה הזאת.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי DA15169 וDA035224 לHEM
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סולפו NHS-SS-ביוטין | פירס | 21331 | |
| סטרפטווידין אגרוז | פירס | 20347 | |
| אלבומין סרום בקר ללא IgG, ללא פרוטאז | סיגמא | A3059 | |
| מיקרוטום רוטט | |||
| אמבט מים רועדים | שונים | ||
| מוסיף תחתית רשת Millicell (8 & מיקרו; m גודל נקבוביות) | Millipore | PI8P 012 50 | ניתן לכבס אותם ביד ולעשות בהם שימוש חוזר |
מקורות
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
