מאמר שיטה

הוכחת סמים רבים עמידים חפת Mycobacterium Microarray ההגברה

DOI:

10.3791/51256

⸱

25 באפריל 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Akonni Biosystems, Inc.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray MDR-TB שיכול לשמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים. Microarray הגברה משלב הגברה סימטרית PCR, בחירת גודל היעד, תיוג היעד, וכלת microarray בתוך פתרון אחד ולתוך תא microfluidic אחת. שיטת עיבוד אצווה באה לידי ביטוי עם שילוב 9-Plex סימטרי אב וmicroarray אלמנט ג'ל בצפיפות נמוכה לgenotyping חפת סמים רב Mycobacterium עמיד (MDR-TB). הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשלים ב6 שעות ולספק גנוטיפ נכון עם לפחות 1,000 שווה תא של הדנ"א הגנומי. שילוב על גבי שבב צעדים לשטוף אינו ריאלי, אשר יגרמו לשיטת amplicon סגורה לגמרי ומערכת. עם microarray הגברה ההיקף של ריבוב מוגבל סופו של דבר במספר זוגות פריימר שניתן לשלב מ 'אדון יחידix ועדיין להשיג רגישות רצויה ומדדי ביצועים ספציפיים, במקום מספר הבדיקות שהם משותקים במערך. כמו כן, בסך הכל בפעם הניתוח יכול להתקצר או התארכה בהתאם לשימוש הספציפי המיועד, שאלת מחקר, ומגבלות רצויות של זיהוי. עם זאת, הגישה הכללית מייעלת באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה על ידי צמצום מספר שלבי עיבוד ידני אינטנסיביים וזמן רב, ומספקת נתיב ביוכימי וmicrofluidic פשוט עבור תרגום אבחון מבוסס microarray לתוך פרקטיקה קלינית שגרתית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרה גילוי מוקדם וטיפול מהיר נחשבים שליטת האסטרטגיות היעילות ביותר להפחית חפת Mycobacterium הילוכים (MTB) 1, ועכשיו יש הסכמה רחבה בקהילת שחפת שנקודת הטיפול (POC) או בסמוך לבדיקת POC לאבחון שחפת בו זמנית ויש צורך בעמידות לתרופות (DR). טכנולוגיות כגון GeneXpert של קפאידים ובדיקות הגברה אחרות חומצות גרעין לצמצם את הזמן לאבחון לחולי שחפת רבות, ולספק קריאה מתוך מהירה מצביע על עמידות לריפאמפין או מוטציות שנבחרו מקנות עמידות לתרופות הראשונות או שנייה אחרות קו 2. למרות בדיקות הגברה בזמן אמת וחומצות גרעין בידוד תרמיות נועדו לזהות את מוטציות עמידות לתרופה שתוביל לMDR-TB, הספקטרום של מוטציות הם מזהים הוא לעתים קרובות מספיק כדי לעצב משטר תרופה אישי המתאים לפרופיל העמידות לתרופות של החולה, ואילוצים טכניים הקשורותכדי לדבר לחצות אופטי או את המורכבות של תהליכים כימיים הגברה ודיווח מאי 3-7 להגביל את מספר הלוקוסים או מוטציות שאותרו. לכן, טכנולוגיות זיהוי עם יכולת ריבוב גבוהה יותר נדרשות כדי לטפל בפערים ידועים באבחון POC MDR-TB.

Microarrays ומבחני הבדיקה השורה אישרו-WHO Hain יכולים לתת מענה "גן מרובה, מוטציות רבות" האתגר של אבחון MDR-TB 8-29. למרבה הצער,, פלטפורמות גילוי אלה המבוססים על הכלאת ריבוב משתמשות רב שלבי, מסובכים, ופרוטוקולים הפתוח amplicon הדורשים הכשרה משמעותית ומיומנות בטכניקות מולקולריות. Microarray ההגברה 30 נועד לטפל בכמה microarray זרימת העבודה אלה ודאגות תפעוליות. עקרונות fluidic פישוט הם כדי להגביר, להכליא, ולזהות מטרות חומצות גרעין בתוך תא microfluidic אחת. המשתמש מציג mas החומצה והגברת הגרעיןter לערבב לתוך תא fluidic עם טפטפת ומתחיל פרוטוקול הרכיבה התרמי. לשיטת העיבוד אצווה שמוצגת כאן, microarrays נשטפים לאחר מכן בפתרון בתפזורת, מיובש, וצלם. מחקר זה מדגים את הפונקציונליות של microarray הגברה באמצעות בדיקת MDR-TB microarray לrpoB (30 מוטציות), katG (2 מוטציות), Inha (4 מוטציות), rpsL (2 מוטציות), embB (מוטציה 1), IS1245, IS6110 , והגברה פנימית ושליטה הכלאה. זוג תואם לפחות אחד מבדיקות microarray (wildtype (WT) ומוטציה של נוקלאוטיד יחיד (MU)) כלול בכל אחד מוטציה של עניין. חומצות גרעין מזוקקים ממ 'עמיד סמים רב שחפת הן מזני שחפת TDR הבנק ביום 31. microarrays אלמנט ג'ל מיוצרים על מצעי זכוכית על ידי copolymerization בעצם כפי שתואר במקומות אחרים 32, פרט לכך שאנו משתמשים מונומר 4% ו0.05 מ"מ כל אחד בדיקה בpolymerizתערובת ation. מערכים מוקפים באטם 50 מיליליטר לפני השימוש. לאחר שלבי רכיבה התרמית, הכלאה, ולשטוף, microarrays ההגברה הם צילמו על מנתח נייד Akonni. , עוצמות אות משולבות מתוקן רקע מתקבלות הגלם. תמונות tif באמצעות אלגוריתם מעגל קבוע. רעש עבור כל רכיב ג'ל מחושב כשלוש פעמים סטיית התקן של רקעי נקודה המקומיים. מטרות גן נחשבות בדרך כלל לגילוי עבור יחס אות לרעש (SNR) ערכי ≥ 3. על מנת לקבוע את קיומו או היעדריו של מוטציה ספציפית בכל גן או קודון, יחס מבחין מחושב מערכי יחס האות לרעש כ( WT-MU) / (WT + MU). יחסי מבחין <0 מעידים על מוטציה סמים התנגדות במוקד, ואילו יחסים> 0 מעידים על רצף wild-type.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למעבדות שפעלו באמצעי זהירות PCR אוניברסלי, זה מבצעי יעיל יותר כדי לכלול כמה microarrays הגברה ואטמים לכל מצע ולשטוף את כל microarrays ההגברה בו זמנית במכל בתפזורת, כפי שמתואר כאן. פורמטים מתכלים זמינים לביצוע שלבי כביסה microarray לאחר הגברה ב, מבחן amplicon סגור אטום לחלוטין, כפי שדווחו במקומות אחרים 30,33.

1. התקנה

  1. לחלץ ולטהר חומצות גרעין מהדגימה בתנאי בטיחות ביולוגיות מתאימים עם שיטה של ​​בחירה. הדרישה היא שחומצות גרעין תהיה של טוהר מספיק להגברה סימטרית, זמנית ה-PCR.
  2. הכן את סביבת עבודה על ידי ניגוב משטחים וציוד עם פתרונות decontaminating.
  3. הנח ריאגנטים הגברה על קרח או בלוק קר.
  4. תווית צינור microfuge 1.5 מיליליטר סטרילי לתערובת ההורים ההגברה, ולתייג microfuge 0.2 מיליליטר סטרילי tuלהיות עבור כל דגימה.
  5. לאחר ריאגנטים מופשרים, בקצרה מערבולת ולאסוף תוכן לחלק התחתון של הצינור עם דופק ספין במיני צנטריפוגות. לא מערבולת פולימראז תקי. בעדינות קפיצית הצינור לערבב ופעל עם דופק ספין במיני צנטריפוגות.
  6. הכן תערובת אב הגברה שימוש בכמויות התגובה לכל מדגם מוצגות בטבלה 1. כדי להסביר את אי דיוקים pipetting אפשריים, להכין נפח תגובה אחת לפחות יותר מאשר המספר הכולל של דגימות בטיפול. שים לב שתערובת ההורים מכילה פולימראז תקי נוסף, מעל ומעבר למה שמסופק עם חיץ PCR muliplex. הוסף רק את שליטת הגברה / עיכוב לתערובת האמן אחרי כל ריאגנטים האחרים משולבים, והצינורות מגיב המניה חזרו לאחסון.
מגיב נפח לכל מדגם (μl) סופי []
Mulitplex PCR הצפת עם HotStar תקי פלוס 25 1x
אלבומין בסרום שור (BSA) 0.55 0.6 מ"ג / מיליליטר
פוראמיד 3.8 .7.6%
פולימראז תקי נוסף 0.8 יחידות / μl (סה"כ 4 יחידות)
תמהיל פריימר MDR-TB 15.75 -
H-RNase ללא 2 O 2.1 -
הגברה / עיכוב בקרה 1 5.0 FG / μl
סך הכל 49

טבלת 1. הרכב MDR-TB microarray ההגברה מיקס מאסטר.

  1. מערבולת תערובת ההורים ולאסוף תוכן לחלק התחתון של הצינור עם דופק ספין במיני צנטריפוגות.
  2. שלב 49 μl של תערובת הורים ו1 μl של מ ' ה-DNA שחפת לכל אחד מצינורות המדגם משלב 1.4, לעיל. לחיצוני, אין שליטת תבנית (NTC), השתמש 1 μl מים כיתה ביולוגיה מולקולרית במקום של מ ' דגימת DNA שחפת. ורטקס ודופק ספין הצינור (ות) בסיום.

2. טען Microarrays ההגברה

  1. הוספת 48 μl של כל ערבוב / מדגם הורים על מרכז microarrays המיוחסים להם, נזהרה שלא לגעת בmicroarray עצמו.
  2. במקום להחליק על גבי עטיפה של אטם microarray וחותם, נזהרות שלא מלכודת כל בועות אוויר בתא microarray. בועות האוויר עלולות להשפיע לרעה על יעילות הגברהועלול ליצור חפצים או רעש בתמונה microarray שלאחר מכן.

3. רכיבה על אופניים תרמיים

  1. ברגע שכל microarrays נטען עם מדגם, מצעי מקום בCycler התרמי הבלוק השטוח. ודא כי אפשרות המכסה המחוממת מופעלת "כבויה". ציוד המתקבל מAkonni Biosystems כבר יהיה prequalified לשימוש. אחרת, זה מאוד חשוב לוודא כי את Cycler הבלוק השטוח התרמית (ים) מספקת אחידה (ים), חימום עקבי בכל מצעי microarray.
  2. פתח את תוכנת Cycler התרמית, בחר את התכנית המתאימה, הזן "μl 50" לעוצמת התגובה, וליזום במנוסה. פרוטוקול הרכיבה התרמית שתואר כאן מורכב:
    צעדים רכיבה על אופניים תרמיים
    1 88 ° C 5 דקות
    2 88 ° C 30 שניות
    3 55 ° C 1 דקות
    4 65 מעלות צלזיוס 30 שניות
    5 חזור על שלבים (2-4) ל50 מחזורים
    6 65 מעלות צלזיוס 3 דקות
    7 55 ° C 3 שעות
  3. המספר הכולל של מחזורים תרמיים ו55 C ° זמן המתנה לאחר הגברה הוא משתנה בלתי תלוי שהמשתמש רשאי לשנות, במידת צורך או מתאים לניסוי הספציפי. בגלל תערובת ההורים MDR-TB יוצרת amplicons סימטרית (בעיקר חד גדילים), זה בדרך כלל מועיל לכלול מחזורים תרמיים יותר אחר עלולים להיות מנוצל לפרוטוקול קונבנציונלי, מעריכי PCR הגברה.
  4. כאשר תכנית רכיבה על אופניים וכלת התרמית היא מלאה, בסופו של התכנית, להסיר את microarrays ההגברה, לסגור את התוכנה, ולכבות את Cycler התרמית (ים).

4. שטפי ויבשים

  1. לשטיפת עד 24 מצעים בו זמנית, להכין לפחות 250 מיליליטר 1x SSPE - 0.1% חיץ לשטוף X-100 טריטון, ושתי מכולות עם לפחות 250 מיליליטר deionized או מים כיתה מילי-Q כל אחד. לשטוף החיץ יכול להיות מוכן מראש.
  2. להסיר להחליק את המכסה ואטם מתא microarray הגברה באמצעות מלקחיים שטוח סוף בזהירות. שלב זה הוא הנקודה שבה יש את הסיכון הגדול ביותר של מערכי יסוד ג'ל מזיקים מבחינה פיזית. השתמש בבקרת זיהום PCR המתאימה כדי למנוע את ההתפשטות של חומצות גרעין מוגברות בתוך סביבת העבודה.
  3. הנח מצעי microarray בהחזיק שקופיות היסטולוגיה, ולמקם את כל השקופיות לפח לשטוף המכיל חיץ לשטוף. כסה את המכל עם מכסה.
  4. שטוף microarrays ל10 דקות בטמפרטורת חדר עם תסיסה עדינה.
  5. טובלים את microarrays פעמים בכל שלוש בשתי כביסות רצופות של deionized אומים מילי-Q כיתה, ואוויר יבש.

5. הדמיה

תמהיל פריימר MDR-TB סימטרי יוצר amplicons כותרת Cy3. ניתן הדמיה microarrays אלמנט ג'ל עם כל תרמי microarray סטנדרטי מסוגל Cy3 הדמיה. הליך ההדמיה הבאה הוא ספציפי לתמהיל MDR-TB מאסטר, תרמי נייד שדה Dx2100, ותוכנה לניתוח אוטומטי הניתן על ידי Akonni.

  1. ודא שכבל Ethernet מהתרמי מחובר למחשב.
  2. הפעל את תרמי. מתג ההפעלה ממוקם בלוח האחורי של המכשיר. נוריות כחולים בחזית תרמי תאיר כאשר תרמי הוא מופעל על.
  3. הפעל את המחשב.
  4. בשולחן העבודה של המחשב, לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה כדי להפעיל את תוכנת ניתוח תמונה האוטומטית.
  5. חכה לתוכנה כדי ליצור חיבור עם המצלמה תרמי. ברגע שנוצר החיבור, הכפתור Analyze הופך להיות זמין, והודעה "חיבור מוצלח" יופיע בפינה השמאלית התחתונה של המסך.
  6. הכנס את microarray ההגברה המיובש עם microarray מול מן המשתמש, וכיוון העדשה האובייקטיבית. אם microarray מכוון בצורה לא נכונה ביחס לעדשה והמצלמה, תוכנה לניתוח האוטומטי תיכשל למקם רשת על תמונת הקרינה.
  7. סגור את דלת הגישה. תצוגה מקדימה של תמונה תהיה זמינה על מסך המחשב.
  8. בחר את תסריט ניתוח MDR-TB מהתפריט הנפתח והזן את הזמן רצוי חשיפה (באלפיות שני). נקודת התחלה טיפוסית עבור microarrays ההגברה אלמנט ג'ל היא 100-500 אלפיות שנייה.
  9. פיקסלים רוויים יוצגו בתצוגה מקדימה באדום. התאם את זמן החשיפה כדי למזער את מספר הפיקסלים רוויים במקומות מסוימים.
  10. לחץ על נתח לרכוש ולנתח את תמונת הקרינה. התוכנה באופן אוטומטי למקםרשת assay הספציפי MDR-TB על גבי התמונה, לחלץ עוצמה משולבת וערכי רקע, ולדווח על תוצאות עמידות לתרופות וגנוטיפ. הניתוח האוטומטי ייקח בדרך כלל כמה שניות. עבור תמונות מאתגרות המכילות סריטות, אבק, לכלוכי ניאון, או נזק פיזי לתכונות microarray, ייתכן שהתוכנה צריכה עד 1 דקות כדי להשלים את הניתוח.
  11. ברגע שהניתוח הסתיים, לחץ על שמור, בחר את תיקיית יעד, הסוג בשם קובץ, ולחץ על אישור. נתוני microarray הבסיסיים נשמרים כקובץ xls. וניתן לייצא לoff-line מנתח, אם תרצה בכך.
  12. ברגע שהניתוח הושלם, להסיר את microarray ההגברה מתרמי, ולחץ על New כדי ליזום את הניתוח הבא.
  13. בסיום איסוף הנתונים, סגור את התוכנה, לכבות את המחשב, ולכבות את תרמי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח תמונה איכותי יכול לספק תובנות לגבי מקורות רעש ניסיוני או השתנות שמאתגרים לזהות בטבלאות נתונים שנוצרו על ידי תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית. לכן, זה יכול להיות שימושי כדי לבדוק חזותי ש1) כל אלמנטי ג'ל הם שלמות וללא ניזק, 2) הרקע הגלובלי הוא חופשי מחפצי ניאון שעשוי להשפיע על אות בודדת יחס רעש (SNR ערכים), 3) אין ראיות ל היווצרות בועה או הגברה / הכלאה לא אחידה על פני המערך, ו4) שהתוכנה זיהתה את כל הנקודות בצורה מדויקת על תמונת microarray. תמונות microarray ההגברה הדוגמא MDR-TB מוצג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם microarray הגברה היקף הריבוב מוכתב סופו של דבר על ידי היעילות של PCR אסימטרי זמנית, לא microarray. מניסיוננו, 10-12 זוגות פריימר ייחודיים ניתן multiplexed בקלות בפורמט microarray הגברה. קריטריוני פריימר ועיצוב חללית קונבנציונליים ולכן חלים על מבחני חדשים, חוץ מזה שצריך גם להביא בחשבון את האינטראקציות אפשריות בין חומצות גרעין פתרון שלב ובדיקות microarray משותקים, יעילות התרמית של Cycler התרמית, והכלאת בדיקה ההתנהגות במאגר PCR שגם מכיל primers PCR וחפצי הגברה משקל מולקולריים נמוכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) בAI089106 RC3 המענק.

חומצות גרעין MDR-TB סופקו על ידי תכנית הפיתוח של הקרן / האו"ם / בנק העולמי / ארגון הבריאות העולמית מיוחדת תכנית הילדים של האו"ם למחקר והדרכה במחלות טרופיות (TDR), ג'נבה, שוויץ.

אנו מודים לד"ר טום Shinnick של המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן להדרכה בגנים ומוטציות הספציפיים שתיכלל בassay אב הטיפוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרו-מערכי הגברה MDR-TB, עם אטם מיושם והחלקות כיסוי חתוכות מראשAkonni BiosystemsInquire
Multiplex PCR, המכילה 2X מאגר PCR עם HotStar Taq בתוספתQiagen#206143
Taq פולימראזQiagen#201207
מים ללא RNAseQiagen#206143 
פורממידתרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ#BP227-500
20 מ"ג מ"ל-1 אלבומין בסרום בקר (BSA)Sigma-Aldrich#3B6917
5X תערובת פריימר MDR-TB מרוכזת פי 5Akonni BiosystemsInquire
500 fg uL-1 בקרת הגברה ועיכובAkonni BiosystemsInquire
20X SSPEThermo Fisher Scientific, Inc. #BP1328-4
טריטון X-100תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ#BP151-500
תרסיס חיטוי Current Technologies, Inc.
70% אלכוהול איזופרופילDecon Labs, Inc.#8416
מצלמת Microarray, עם תוכנה אוטומטית לניתוח תמונות ונתוניםAkonni Biosystems100-20011
מחזור תרמי עם תוספת בלוק שטוחAkonni Biosystems100-10021
תחנת שטיפה בתפוקה גבוהה ומחזיק שקופיותArrayItHTW
מלקחיים לניתוחThermo Fisher Scientific, Inc.#10-300
מיני וורטקסרVWR#3365040
מיני צנטריפוגהVWR#93000-196
ערכת מדחס מברשת אווירפנאומטית מרכזית#95630
ערכת #BRSPRAY128

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemaire, J. -F., Casenghi, M. New diagnostics for tuberculosis: fulfilling patient needs first. J. Int. AIDS Soc. 13, 40(2010).
  2. World Health Organization. Tuberculosis diagnostic technology landscape. 42, World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2012).
  3. Notomi, T., Okayama, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 28, e63(2000).
  4. Vincent, M., Xu, Y., Kong, H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 5, 795-800 (2004).
  5. Pritchard, C. G., Stefano, J. E. Amplified detection of viral nucleic acid at subattomole levels using Q beta replicase. Ann. Biol. Clin. 48, 492-497 (1990).
  6. Compton, J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 350, 91-92 (1991).
  7. Guatelli, J. C., Whitfield, K. M., et al. Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1874-1878 (1990).
  8. Shi, X. C., Liu, X. Q., Xie, X. L., Xu, Y. C., Zhao, Z. X. Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance. Chin. Med. J. , 3292-3297 (2012).
  9. Troesch, A., Nguyen, H., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays. J. Clin. Microbiol. 37, 49-55 (1999).
  10. Caoili, J. C., Mayorova, A., et al. Evaluation of the TB-biochip oligonucleotide microarray system for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 44, 2378-2381 (2006).
  11. Waddell, S., Laing, K., Senner, C., Butcher, P. Microarray analysis of defined Mycobacterium tuberculosis populations using RNA amplification strategies. BMC Genomics. 9, 94(2008).
  12. Fukushima, M., Kakinuma, K., et al. Detection and identification of mycobacterium species isolates by DNA microarray. J. Clin. Microbiol. 41, 2605-2615 (2003).
  13. Park, H., Jang, H., et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array. J. Clin. Microbiol. 43, 1782-1788 (2005).
  14. Yao, C., Zhu, T., et al. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin. Microbiol. Infect. 16, 1639-1643 (2010).
  15. Sun, A. H., Fan, X. L., et al. Rapid detection of rpoB gene mutations in rif-resistant M. tuberculosis isolates by oligonucleotide microarray. Biomed. Environ. Sci. 22, 253-258 (2009).
  16. Volokhov, D. V., Chizhikov, V. E., Denkin, S., Zhang, Y. Molecular detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Methods Mol. Biol. 465, 395-417 (2009).
  17. Fu, L., Shinnick, T. M. Understanding the action of INH on a highly INH-resistant Mycobacterium tuberculosis strain using Genechips. Tuberculosis. 87, 63-70 (2007).
  18. Fu, L. M., Shinnick, T. M. Genome-wide exploration of the drug action of capreomycin on Mycobacterium tuberculosis using Affymetrix oligonucleotide GeneChips. J. Infect. 54, 277-284 (2007).
  19. Denkin, S., Volokhov, D., Chizhikov, V., Zhang, Y. Microarray-based pncA genotyping of pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis. J. Med. Microbiol. 54, 1127-1131 (2005).
  20. Gryadunov, D. A., Mikhailovich, V., et al. Evaluation of hybridisation on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Infect. 11, 531-539 (2005).
  21. Tang, X., Morrix, S. L., Langone, J. J., Bockstahler, L. E. Microarray and allele specific PCR detection of point mutations in Mycobacterium tuberculosis genes associated with drug resistance. J. Microbiol. Methods. 63, 318-330 (2005).
  22. Wade, M. M., Volokhov, D., Peredelchuk, M., Chizhikov, V., Zhang, Y. Accurate mapping of mutations of pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains with a scanning-frame oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 49, 89-97 (2004).
  23. Yue, J., Shi, W., et al. Detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains by using a specialized oligonucleotide microarray. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 48, 47-54 (2004).
  24. Kim, S. Y., Park, Y. K., et al. Evaluation of the CombiChip Mycobacteria Drug-Resistance detection DNA chip for identifying mutations associated with resistance to isoniazid and rifampin in Mycobacterium tuberculosis. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 54, 203-210 (2006).
  25. Brown, T. J., Herrera-Leon, L., Anthony, R. M., Drobniewski, F. A. The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis. J. Microbiol. Methods. 65, 294-300 (2006).
  26. Brossier, F., Veziris, N., Truffot-Pernot, C., Jarlier, V., Sougakoff, W. Performance of the genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44, 3659-3664 (2006).
  27. Padilla, E., Gonzalez, V., et al. Comparative evaluation of the new version of the INNO-LiPA Mycobacteria and GenoType Mycobacterium assays for identification of Mycobacterium species from MB/BacT liquid cultures artificially inoculated with mycobacterial strains. J. Clin. Microbiol. 42, 3083-3088 (2004).
  28. Barnard, M., Gey van Pittius, N. C., et al. The diagnostic performance of the GenoType MTBDRplus Version 2 line probe assay is equivalent to that of the Xpert MTB/RIF assay. J. Clin. Microbiol. 50, 3712-3716 (2012).
  29. Sekiguchi, J. -I., Nakamura, T., et al. Development and evaluation of a line probe assay for rapid identification of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2802-2807 (2007).
  30. Chandler, D. P., Bryant, L., et al. Integrated amplification microarrays for infectious disease diagnostics. Microarrays. 1, 107-124 (2012).
  31. Vincent, V., Rigouts, L., et al. The TDR Tuberculosis Strain Bank: a resource for basic science, tool development and diagnostic services. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 16, 24-31 (2012).
  32. Golova, J. B., Chernov, B. K., et al. Non-volatile copolymer compositions for fabricating gel element microarrays. Anal. Biochem. 421, 526-533 (2012).
  33. Cooney, C. G., Sipes, D., Thakore, N., Holmberg, R., Belgrader, P. A plastic, disposable microfluidic flow cell for coupled on-chip PCR and microarray detection of infectious agents. Biomed. Microdevices. 14, 45-53 (2012).
  34. Lane, S., Evermann, J., Loge, F., Call, D. R. Amplicon secondary structure prevents target hybridization to oligonucleotide microarrays. Biosens. Bioelectron. 20, 728-735 (2004).
  35. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. E., et al. Use of sloppy molecular beacon probes for identification of Mycobacterial species. J. Clin. Microbiol. 47, 1190-1198 (2009).
  36. Boehme, C. C., Nabeta, P., et al. Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRMultiplex PCRMDR TBDNAMicroarrayEcon DX 2100 Imager

מאמרים קשורים