מאמר שיטה

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

11.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51302

⸱

10 ביוני 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

microrheology מעקב חלקיק יכול להיות בשימוש למי שאינו הרסני לכמת ומרחבית מפת שינויים בתכונות מכאניות מטריצה ​​תאית במודלי גידול 3D.

תקציר

Microenvironment המכני הוכח לפעול כרגולטור חיוני של גידול בצמיחת התנהגות ואיתות, אשר עצמו שופץ והותאם כחלק מסדרה של יחסי גומלין מורכבים, דו כיוונית mechanosensitive. בעוד שהפיתוח של מודלים 3D גידול ביולוגי רלוונטיים הקל מחקרים מכניסטית על ההשפעה של rheology מטריצה ​​על צמיחת גידול, הבעיה ההפוכה של שינויי מיפוי בסביבה מכאנית הנגרמת על ידי גידולים נותרת מאתגרת. כאן, אנו מתארים את יישום microrheology מעקב חלקיקים (PTM) בשילוב עם מודלים 3D של סרטן לבלב כחלק מגישה חזקה וברת קיימא עבור אורכי ניטור שינויים פיזיים בmicroenvironment הגידול, באתרם. המתודולוגיה שתוארה כאן משלבת מערכת של הכנה במבחנה המודלים 3D המשובץ במטריצה ​​תאית מודל פיגום (ECM) של סוג קולגן אני עם בדיקות שכותרתו fluorescently מפוזרות באופן אחיד לפוsition ומדידות microrheology תלוי זמן לאורך כל הדגימה. במבחנה גידולים הם מצופים ונחקרו בתנאים מקבילים באמצעות צלחות הדמיה multiwell. ציור על שיטות מבוססות, קטעי וידאו של תנועות חללית נותב הופכים באמצעות היחס כלליים סטוקס איינשטיין (GSER) לדווח מודולוס מורכב התדירות תלויה הגזירה viscoelastic, G (ω) *. מכיוון שגישה זו היא מבוסס הדמיה, אפיון מכאני ממופה גם הוא על שדות המרחבית מועבר אור גדולים לדווח בו זמנית שינויים איכותיים בגודל גידול 3D ופנוטיפ. נציג תוצאות מראים מנוגד תגובה מכאנית בתת אזורים הקשורים בשפלה מקומית-Induced פלישת מטריקס, כמו גם כיול מערכת, אימות נתונים מוצגים. תוצאות בלתי רצויות מטעויות ניסיוניות נפוצות ופתרון בעיות בנושאים אלה גם מוצגות. פורמט ציפוי תרבות 96 היטב 3D מיושם בפרוטוקול זה הוא גonducive למתאם של מדידות microrheology עם מבחני מיון טיפוליים או הדמיה מולקולרית כדי לקבל תובנות חדשות על השפעה של טיפולים או גירויים ביוכימיים בmicroenvironment המכני.

מבוא

זה ברור מגוף הולך וגדל של ראיות בספרות שתאי הסרטן, כמו בתאי האפיתל של יונקים שאינם ממאירים, הם רגישים מאוד לתכונות מכאניות וbiophysical של מטריקס סביב תאי (ECM) ורכיבי המיקרו אחרים 1-9. מחקרים מכניסטית אלגנטיים סיפקו תובנות לתוך התפקיד של קשיחות תאית כשותף איתות mechanosensitive מורכב המווסת את ההתנהגות ממארת צמיחה והמורפוגנזה 2,3,10,11. עבודה זו כבר בהנחייתם בפרט על ידי הפיתוח של 3D במודלי גידול מבחנה שלשחזר ביולוגי ארכיטקטורת רקמה רלוונטית וניתן לגדל בחומרי פיגום עם מכניקה מתכונן וצלמו ידי מיקרוסקופיה אופטית 12-19. עם זאת, הצד השני של הדו שיח הזה בין mechanoregulatory גידול והמיקרו, שדרכו תאי הסרטן בתורו לשנות את rheology של סביבתם האחר, נותר במידה מסוימתקשה יותר ללמוד. לדוגמא, במהלך תהליכי פלישה, תאים בפריפריה של גידול עשויים לעבור אפיתל למעבר mesenchymal (EMT) ולהגדיל את הביטוי של metalloproteases המטריצה ​​(MMPs) שגורמים להשפלה מקומית של 20-22 ECM, אשר בתורו משפיע mechanosensitive צמיחת התנהגות של תאים סרטניים הפרוקסימלי אחרים. באמצעות מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים, תאים סרטניים לחייג הרף הקשיחות המקומית של הסביבה שלהם למעלה ולמטה כדי להתאים את התהליכים שונים בזמנים שונים. המתודולוגיה שתוארה כאן היא מונעת על ידי הצורך בכלים אנליטיים הלדווח על שינויים מקומיים בנוקשות והציות של ECM בצמיחה, שיכול להיות משולב עם מודלים גידול 3D וקורלציה אורכים עם שינויים ביוכימיים ופנוטיפי ללא הפסקת התרבות.

בחיפוש טכניקה מתאימה ליישום בהקשר זה, microrheology חלקיקי המעקב (PTM) מתגלה כמועמד חזק.בשיטה זו, הייתה חלוצה במקור על ידי מייסון וייץ 23,24, משתמש בתנועה של בדיקות מעקב מוטבעות בנוזל מורכב לדווח מודולוס התדירות תלויה מורכב הגזירה viscoelastic, G * (ω) בקני מידת אורך מיקרון. גישה כללית זו פותחה עם וריאציות מרובות מתאימות ליישומים שונים בעניין, קולואידים, ביופיסיקה-מרוכז רכה ופיסיקה פולימר 25-31. יש PTM יתרונות מסוימים ביחס לשיטות אחרות, שכן מונה המציין viscoelasticity המקומי מסופק על ידי וידאו הדמיה שאינה הרסנית של בדיקות מעקב ביוכימית פעילה המשולבות בעת הכנת התרבות ולהישאר במקום לאורך תקופות ממושכות של צמיחה. זאת בניגוד למדידות תקן זהב עם rheometer oscillatory גזירה בתפזורת, שבהכרח דורש הפסקת התרבות ומדווח rheology מקרוסקופית התפזורת של המדגם ולא מדידות נקודה בתוך microenvir גידול 3D המורכבonment. ואכן מספר מחקרים הדגימו את התועלת של פרשנות מדידות של תנועות חללית נותב או סביב תאים סרטניים או שאינו סרטניים למדוד עיוותים הקשורים לתא הגירה 32, לחץ מכאני הנגרם על ידי אליפטית הרחבת 33, rheology תאיים 34,35, ו למפה לחצים מכאניים וזנים ברקמות מהונדסות 36, ויחס בין גודל הנקבובית ומהירות פלישת 37. טכניקות אחרות מתאימות לmicrorheology, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן ליישם, אבל בעיקר לחיטוט נקודות במדגם השטח וגם עלולות להוות בעיות עקרות התרבות שתסבכנה מדידות אורך 38.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מקיף הכולל שיטות לצמיחה של הספרואידים גידול 3D מתאימים להעברה לECM עם בדיקות ניאון משובצות לשיטות וידאו חלקיקי מעקב וניתוח לאופן מהימן מיפוי מרחבישינויים בmicrorheology לאורך זמן בתרבות. ביישום הנוכחי, מודלים 3D גידול גדלים בפורמט multiwell עם נוף לכיוון שילוב של מדידות microrheology עם מבחני אחרים מסורתיים (למשל, cytotoxicity) שהפורמט הזה הוא תורם ל. באיור נציג זה של במבחנה הספרואידים זה אנו המתודולוגיה תרבות 3D באמצעות PANC-1 תאים, שורת תאי סרטן לבלב הוקמה הידועה כדי ליצור הספרואידים 39, אבל כל המדידות שתוארו במסמך זה הן החלים רחב ללמוד בגידולים מוצקים תוך שימוש במגוון של שורות תאים מתאים לתרבות 3D. מכיוון שהוא מבוססת הדמיה בשיטה זו המיסוד הוא אידיאלי לשיתוף רישום של נתונים microrheology ברזולוציה גבוהה עם שדות מועברים האור גדולים של דעה כי לדווח על שינויים בצמיחת תאים, הגירה ופנוטיפ. יישום PTM משולב עם מיקרוסקופ אור להעביר בדרך זו מניחה מיצוב לשחזור של Wh הבמה מיקרוסקופich הוא בדרך כלל זמין במיקרוסקופים ביולוגיים epifluorescence widefield המסחרי ממונעים. הפרוטוקול שפותח בהמשך יכול להיות מיושם עם כל מיקרוסקופ ביולוגי הקרינה אוטומטית מצויד באופן סביר. זוהי שיטה עתירת נתונים מיסודו, שדורשת רכישה של ג'יגה בייט של נתונים במיקרוסקופ וידאו דיגיטליים לעיבוד מקוון.

בפרוטוקול הבא, פרוטוקול 1 נוגע להכנה הראשונית של הספרואידים גידול אשר מתואר כאן על ידי שימוש בכיסוי agarose אבל יכול להיות תחליף עם מגוון רחב של שיטות אחרות כגון ירידה תלויה 40, או תרבות סיבובית 41 טכניקות. פרוטוקול 2 מתאר את התהליך של הטבעת הספרואידים בפיגום קולגן אם כי לחלופין, במבחנה גידולי 3D יכולים להיות גדלו באנקפסולציה או הטבעה של תאי resuspended בECM 12,15, ולא הספרואידים אינם חסיד מראש יצרו אחת. הפרוטוקולים הבאים מתארים נהלים לobtaining מדידות microrheology זמן נפתר על ידי הרכישה ועיבוד של נתונים במיקרוסקופ וידאו, בהתאמה. עיבוד נתונים מתואר באמצעות MATLAB, מה שהופך את השימוש בגרות קוד פתוח לPTM הבנוי על אלגוריתמים שתוארו במקור על ידי קרוקר וגריר 42, שיש גם פותחו בהרחבה לפלטפורמות תוכנה שונות (ראה http://www.physics.emory.edu/ ~ שבועות / IDL /).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Spheroids גידול Culturing

  1. מערבבים 10 מיליליטר של מים כיתה תרבית תאים עם 0.1 גרם של agarose כדי להשיג פתרון agarose 1%.
  2. פתרון agarose חום לעיל 70 מעלות צלזיוס (בערך 14 שניות במיקרוגל רגיל או באמצעות צלחת חימום) לפני aliquoting 40 μl של פתרון agarose לתוך באר בצלחת 96 היטב.
  3. דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 ואילו קצירת תאים תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיות.
  4. השתמש hemacytometer כדי לקבוע את הריכוז של תאים בתרחיף.
  5. לדלל השעיה תא ל1,000 תאים / מיליליטר ולהוסיף דילול זה 100 μl הלמכיל גם מיטת agarose נרפאה.
  6. מניחים את המדגם על שייקר לילה בחממה שנקבעה על 37 ° C ו 5% CO 2.
  7. הסר מדגם מייקר ולהוסיף של תקשורת בתרבות תא 100 μl.
  8. דגירה הספרואידים עד לקוטר רצוי. לדוגמא, לאחר 9 ימים, spheroid יהיה כ 450 מיקרומטר קוטר. במהלך תקופה זו, תקשורת צמיחה טרי ניתן להוסיף לבארות, אך יש להימנע משאיפה שכן זה יגרום להסרה של אליפטית.

2. הכנת spheroids גידול 3D המשובץ בECM

  1. הכן את תחנת עבודה עם חומרים הדרושים בתוך הזרימה למינרית.
  2. הכן תערובת מדוללת של 1 מיקרומטר בדיקות נותב-הותאם carboxylate קוטר ניאון על ידי הוספת בדיקות מניית 2 חלקים (מוצקי 2%) ל25 חלקי מים סטריליים.
  3. הסר בקבוק 3.1 מ"ג / מיליליטר קולגן שור מהמקרר ומניח אותו על קרח.
  4. Aliquot 125 μl של קולגן לתוך בקבוקון 2 מיליליטר ריק.
  5. הוסף 50 μl של דילול פתרון בדיקה נותב לבקבוקון המכיל קולגן ובקצרה מערבולת להפיץ בדיקות.
  6. הוספת 235 μl של תקשורת בתרבות התא המתאימה המכילה פנול אדום (שיצהיב) עבור נפח כולל של 410 מ"ל ובקצרה מערבולת לפני הסרת 205 מיליליטר (חצי מהנפח הכולל) ולמקם אותו בבקבוקון מיליליטר 2 חדש. 1 הבקבוקון יכיל אליפטית הגידול והבקבוקון 2 יהיה תערובת שליטה.
  7. להוסיף ~ 2 μl של 1 M NaOH לבקבוקון 1 להביא את הפתרון בחזרה לpH הניטרלי (תקשורת ותרבות המכילה פנול אדום צריכה לחזור לאדום). שים לב שזה יגרום לתערובת כדי להתחיל בריפוי אם היא לא שמרה על קרח. בקצרה מערבולת לערבב, ולאחר מכן לחזור למדף קרח באופן מיידי.
    הערה: אליפטית הוא בקושי נראה לעין בלתי מזוינת, לאחר 9 ימים של התרבות והסרתה מהמיטה agarose היא משימה עדינה. שימוש במיקרוסקופ לנתיחה עשוי להיות מועיל עבור חלק מהמשתמשים. השמירה על שלמות אליפטית במהלך ההעברה היא בעל חשיבות עליונה.
  8. באמצעות פיפטה קצה רחב פה, בעדינות להסיר 40 μl של מדיה מן הבאר מכילה אליפטית הגידול. לשמור על זה 40 μl בעת ביצוע השלב הבא.
  9. בדקו היטב כדי לראות אם אליפטיתהוסר בשלב הקודם. אם זה היה, להוסיף μl 40 מכיל אליפטית לבקבוקון 1. אם לא, מקום 40 μl חזרה אל תוך הבאר וחזור על השלב הקודם.
  10. בעדינות מערבב 1 יאל (לא להסתכן vortexing, זה עלול לגרום נזק לאליפטית) לפני העברת התערובת ב60 מנות μl לשלוש בארות נפרדות מצלחת 96 היטב. בדוק היטב כל אחד עם מיקרוסקופ לאחר הוספת תערובת כדי לקבוע שגם מכיל את אליפטית.
  11. להוסיף ~ 2 μl 1 M NaOH ו40 μl של תקשורת בתרבות תא לבקבוקון 2 מערבולת לפני aliquotting 60 μl של תערובת זו לריקה גם בצלחת 96 היטב ותיוג כביקורת.
  12. מניחים את הצלחת באינקובטור 37 C ° לרפא במשך שעה לפחות 1.

3. לבנות רשת של נקודות לדוגמא וקח את וידאו בכל נקודה

  1. העבר את צלחת המדגם מן החממה לבמה מיקרוסקופ. לאפשר 10 דקות למדגם לequilibrate עם טמפרטורת החדר אם במה מחוממת אינה זמינה.
  2. שים לב לדוגמא עם עדשות אובייקטיביות המופעלים נמוכות כדי לוודא שהוא שלם ומוכן להדמיה. לקבוע את מיקום הגידול בתוך הבאר.
  3. תחליט כמה נקודות מדגם לקחת. בדרך כלל, 20 נקודות דגימה בכל טוב, שהופצו בטבעות קונצנטריות סביב אליפטית תפיק תוצאות מספקת מפורטות.
  4. להזיז את הבמה לכל מיקום רצוי ולהשתמש בתוכנת מיקרוסקופ התממשקות כדי להקליט את קואורדינטות x ו-y (או רשומת קואורדינטות באופן ידני אם ממשק תוכנה אינו זמין).
  5. לעבור את המיקרוסקופ לעדשה גבוהה מופעל על מטרה (בדרך כלל 100X), ובחר את קוביית המסנן המתאימה לגל העירור של בדיקות המעקב. השתמש ברשימה של נקודות שנוצרו בשלב 3.4 כדי לעבור לנקודה הראשונה ברשת.
  6. התאם את המיקוד כדי למצוא את תחתית הבאר, ולאחר מכן להעביר עד למצוא שדה הראייה (FOV) המכיל כמה טראק בפוקוסאה בדיקות.
  7. שים לב להיסטוגרמה האינטנסיביות ולהתאים את עוצמת החשיפה וזמן לתת הטווח הדינמי הגדול ביותר אפשרי, תוך הבטחה כי התמונה אינה הופכת להיות רווי.
  8. השג רצף וידאו בקצב פריימים של 20-30 אלפיות שני לכל מסגרת (כ 800 מסגרות או 16-24 שניות באורך מומלץ לספק סטטיסטיקות מספיקות לחישוב MSD חזק מאוזנת עם צורך מזעור זמן רכישה בכל נקודת רשת מרחבית) ולשמור עם אמנה מתאימה. במהלך ההקלטה, אל תיגעו מיקרוסקופ או שולחן.
  9. חזור על שלבים 3.6-3.9 עבור כל נקודת דגימה ברשת.
  10. חזור על שלבים 3.3-3.10 לכל אחד גם בניסוי.

4. לנתח וידאו נתונים כדי לחשב מאפייני Rheological בכל נקודה לדוגמא

  1. העתק את כל נתוני וידאו לתיקיית ניתוח (אולי במחשב אחר).
  2. נתוני יבוא תמונה לתוך MATLAB או תוכנות ניתוח אחרות.
    איןTE: תיעוד נרחב לגבי הסט של רוטינות מעקב אחר חלקיקי MATLAB אימצו כאן הוא זמין בhttp://people.umass.edu/kilfoil. השימוש בפונקציה קוראת מותאם אישית לאוטומציה עיבוד של מספר קבצים בעמדות שונות מומלצת.
  3. לכייל את התוכנה על ידי ניתוח מספר פריימים של וידאו כדי לקבוע כראוי פרמטרים בחירה ודחייה (גודל, bandpass, וכו ') לזיהוי עמדות מרכז בדיקה. רקע נרחב לצעדים חיוניים אלה מתואר על ידי קרוקר וגריר.
  4. השתמש בתוכנה כדי לקבוע באופן אוטומטי כל עמדת בדיקה לכל מסגרות הווידאו ולאחר מכן לקשר את העמדות הללו למסלולים.
  5. השתמש בנתוני המסלול כדי לחשב את התזוזה הממוצעת בריבוע (MSD) כפונקציה של זמן השהיה, להיות בטוח כדי להחיל את גורם כיול המרחבי המתאים (מיקרומטר לפיקסל) לעדשה הספציפית האובייקטיבית, כל binning פיקסל, וכו '(שבוצע בדרך כללבmeta-data).
  6. חישוב * G (באמצעות ביחס סטוקס איינשטיין הכללי לקחו בחשבון את גבולות תחולתה של GSER למדגם מסוים 24,28,43. לחלופין, משתמשים עשויים לרצות לפרש מאפייני ECM ישירות מMSD פשוט על ידי ההשוואה דרוג חוק החשמל, מישור ערכים, מדדים של הטרוגניות או פרמטרים אחרים.
  7. חזור על שלבים 4.2 דרך 4.6 עבור כל שדה ראייה בניסוי.
  8. שיתוף לרשום נתוני מיקום מצעד 3.4 עם modulii viscoelastic בתדר מסוים של עניין. בהתאם ליצרן של המיקרוסקופ בשימוש, ניתן להקל שלב זה על ידי שגרה מותאמת אישית אשר קוראת metadata מיקרוסקופ או עמדה ניתן נספרו הנתונים באופן ידני.
  9. השתמש בפונקציות אינטרפולציה 3D כדי ליצור מפת rheology המרחבי של ECM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לוודא את תוקפו של G * מדידות (ω) בעמדות מקומיות בתוך microenvironment גידול מודל מורכב, שני ניסויי אימות ראשוניים בוצעו. ראשית, אנו ביקשנו לאמת את המדידות שלנו נגד "תקן הזהב" של rheometry הגזירה תנודתית בתפזורת. הכנו דגימות זהות של מטריצת הקולגן (ללא תאים) בריכוז של 1.0 קולגן מ"ג / מיליליטר. דגימות אלו נבדקו עם rheometer תפזורת (ת"א מכשירי AR-G2, באמצעות 40 מ"מ גיאומטריה צלחת מקבילה) ועל ידי PTM (באמצעות אותם פרמטרים כמו בכל פרוטוקול ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה אנו מציגים אסטרטגיה חזקה וישימה באופן נרחב לאורכי מעקב אחר שינויים מקומיים בקשיחות ECM במודלי גידול 3D. אנחנו מדמיינים שמתודולוגיה זו יכולה להיות מאומצת על ידי ביולוגים בסרטן וBiophysicists מתעניינים בהתנהגות mechanosensitive מעורבת בשיפוץ מטריקס במהלך גידול ותהליכי פלישה. כימות מדויק של קינטיקה השפלה המטריצה ​​יכול להיות בעל ערך במיוחד לאלה שלומדים את הפעילות של metalloproteases מטריקס, מונואמין lysyl או מיני יוכימיים רלוונטיים אחרים במודלי 3D גידול שקשור ישירות לשיפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו בתודה להכיר שיתוף הקוד הפתוח של קוד מעקב של חלקיק MATLAB הניתן על ידי מריה Kilfoil (http://people.umass.edu/kilfoil/), יחד עם הקוד קודם לכן IDL ותיעוד מקיף הניתן על ידי ג 'ון ג קרוקר ואריק שבועות ר '. עבודה זו התאפשרה על ידי מימון מהמכון הלאומי לסרטן (NCI / NIH), K99CA155045 וR00CA155045 (PI: JPC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגן בקר מסוג 1BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה354231
PANC-1תרבית תאים מסוג אמריקאי, Manassas, VACRL1469או סוג תא מתאים אחר
Fluorescent MicrospheresLife Technologies, Carlsbad, CA906906
MatrigelBD Biosciences, Bedford, MA354230
AgaroseFisher Bioreagents, Waltham, MAC12H18O9
NaOHFisher Bioreagents, Waltham, MANC0480985
לוחות הדמיה 96 בארותCorning Inc., Corning, NY3904
DMEMHyclone, Waltham, MASH30243.01או מדיה מתאימה לתרבית תאים
Zeiss AxioObsever MicroscopeZeiss, Oberkochen, גרמניהכולל מצלמה מהירה ותוכנת הדמיה
MATLAB תוכנתThe Mathworks, Natick, MA

מקורות

  1. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer metastasis reviews. 28, 113-127 (2009).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  4. Bershadsky, A. D., Balaban, N. Q., Geiger, B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annual review of cell and developmental biology. 19, 677-695 (2003).
  5. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, 179-183 (2011).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Prog Biophys Mol Biol. 97, 163-179 (2008).
  7. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochem Biophys. 47, 300-320 (2007).
  8. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116, 2377-2388 (2003).
  9. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
  10. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9, 108-122 (2009).
  11. Assoian, R. K., Klein, E. A. Growth control by intracellular tension and extracellular stiffness. Trends Cell Biol. 18, 347-352 (2008).
  12. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4, 359-365 (2007).
  13. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature reviews. Cancer. 5, 675-688 (2005).
  14. Ulrich, T. A., Jain, A., Tanner, K., MacKay, J. L., Kumar, S. Probing cellular mechanobiology in three-dimensional culture with collagen-agarose matrices. Biomaterials. 31, 1875-1884 (2010).
  15. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix encapsulation of cancer cells. J. Vis. Exp. (34), e1692(2009).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  17. Celli, J. P., Rizvi, I., Evans, C. L., Abu-Yousif, A. O., Hasan, T. Quantitative imaging reveals heterogeneous growth dynamics and treatment-dependent residual tumor distributions in a three-dimensional ovarian cancer model. J Biomed Opt. 15, 051603-051610 (2010).
  18. Rizvi, I., et al. Synergistic Enhancement of Carboplatin Efficacy with Photodynamic Therapy in a Three-Dimensional Model for Micrometastatic Ovarian Cancer. Cancer Res. 70, 9319-9328 (2010).
  19. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089(2010).
  20. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell Cycle. 8, (2009).
  21. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Mason, T. G., Weitz, D. A. Optical Measurements of Frequency-Dependent Linear Viscoelastic Moduli of Complex Fluids. Physical Review Letters. 74, 1250(1995).
  24. Mason, T. G., Ganesan, K., van Zanten, J. H., Wirtz, D., Kuo, S. C. Particle Tracking Microrheology of Complex Fluids. Physical Review Letters. 79, 3282-3285 (1997).
  25. Crocker, J. C., et al. Two-Point Microrheology of Inhomogeneous Soft Materials. Physical Review Letters. 85, 888(2000).
  26. Valentine, M. T., et al. Investigating the microenvironments of inhomogeneous soft materials with multiple particle tracking. Physical Review E. 64, 061506(2001).
  27. Helfer, E., et al. Microrheology of Biopolymer-Membrane Complexes. Physical Review Letters. 85, 457(2000).
  28. Levine, A. J., Lubensky, T. C. One- and Two-Particle Microrheology. Physical Review Letters. 85, 1774(2000).
  29. Jonas, M., Huang, H., Kamm, R. D., So, P. T. Fast fluorescence laser tracking microrheometry, II: quantitative studies of cytoskeletal mechanotransduction. Biophys J. 95, 895-909 (2008).
  30. Celli, J., et al. Viscoelastic properties and dynamics of porcine gastric mucin. Biomacromolecules. 6, 1329-1333 (2005).
  31. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Phys Rev Lett. 102, 188303(2009).
  32. Bloom, R. J., George, J. P., Celedon, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Mapping local matrix remodeling induced by a migrating tumor cell using three-dimensional multiple-particle tracking. Biophys J. 95, 4077-4088 (2008).
  33. Gordon, V. D., et al. Measuring the mechanical stress induced by an expanding multicellular tumor system: a case study. Exp Cell Res. 289, 58-66 (2003).
  34. Li, Y., Schnekenburger, J., Duits, M. H. Intracellular particle tracking as a tool for tumor cell characterization. J Biomed Opt. 14, 064005(2009).
  35. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical Mapping of Live Cells by Multiple-Particle-Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 83, 3162-3176 (2002).
  36. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of Mechanical Strains and Stresses around Quiescent Engineered Three-Dimensional Epithelial Tissues. Biophysical Journal. 103, 152-162 (2012).
  37. Yang, Y. L., Motte, S., Kaufman, L. J. Pore size variable type I collagen gels and their interaction with glioma cells. Biomaterials. 31, 5678-5688 (2010).
  38. Ludwig, T., Kirmse, R., Poole, K., Schwarz, U. S. Probing cellular microenvironments and tissue remodeling by atomic force microscopy. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 456, 29-49 (2008).
  39. Sipos, B., et al. A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 442, 444-452 (2003).
  40. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  41. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
  42. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  43. Savin, T., Doyle, P. S. Static and Dynamic Errors in Particle Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 88, 623-638 (2005).
  44. Evans, C. L., et al. Killing hypoxic cell populations in a 3D tumor model with EtNBS-PDT. PLoS ONE. 6, e23434(2011).
  45. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  46. Celli, J. P., et al. Helicobacter pylori moves through mucus by reducing mucin viscoelasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14321-14326 (2009).
  47. Bansil, R., Celli, J. P., Hardcastle, J. M., Turner, B. S. The Influence of Mucus Microstructure and Rheology in Helicobacter pylori Infection. Frontiers in immunology. 4, 310(2013).
  48. Furst, E. M. Applications of laser tweezers in complex fluid rheology. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 10, 79-86 (2005).
  49. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic Tweezers: Micromanipulation and Force Measurement at the Molecular Level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
  50. Dembo, M., Wang, Y. -L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76, 2307-2316 (1999).
  51. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: a new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS ONE. 6, e17833(2011).
  52. Celli, J. P., Petrovic, L., Massdodi, I., Rizvi, I., Hasan, T. Overcoming therapeutic resistance in pancreatic cancer is not a simple mix of PDT and chemotherapy: Evaluation of PDT-chemotherapy combinations in 3D tumor models. Proc SPIE. , 85680R-85680R (2013).
  53. Glidden, M. D., et al. Image-Based Quantification of Benzoporphyrin Derivative Uptake, Localization, and Photobleaching in 3D Tumor Models, for Optimization of PDT Parameters. Theranostics. 2, 827-839 (2012).
  54. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Scientific reports. 4, 3751-3710 (2014).
  55. Celli, J. P. Stromal interactions as regulators of tumor growth and therapeutic response: A potential target for photodynamic therapy. Israel journal of chemistry. 52, 757-766 (2012).
  56. Garber, K. Stromal depletion goes on trial in pancreatic cancer. J Natl Cancer Inst. 102, 448-450 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים