הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים

11.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51310

⸱

10 באוגוסט 2014

 ,  ,  ,  , 
1RG Neuroplasticity, Leibniz Institute for Neurobiology, 2Department of Cell Biology, Utrecht University

במאמר זה

סיכום

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאינדוקציה של הגברה לטווח ארוך באזור CA1 של ההיפוקמפוס והבידוד הבא של שברים מועשרים גרעיניים מאזור tetanized של הפרוסה. גישה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פעילות יבוא חלבון גרעיני תלוי בדגמים סלולריים של למידה וזיכרון.

תקציר

ביטוי לומד פעילות חלבון תלוי, טרנסלוקציה subcellular, או זירחון הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים תאיים הבסיסיים של פלסטיות הסינפטית. הגברה לטווח ארוך (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע"מ) מושרה בפרוסות בהיפוקמפוס חריפות מקובלים מאוד כמודלים תאיים של למידה וזיכרון. ישנם מספר רב של מחקרים המשתמשים בגישות הדמיה תא או אימונוהיסטוכימיה חיות לדמיין דינמיקת חלבון תלויה פעילות. עם זאת שיטות אלו מסתמכות על התאמתו של נוגדנים לimmunocytochemistry או ביטוי יתר של חלבונים מתויגים הקרינה בתאי עצב בודד. Immunoblotting של חלבונים הוא שיטה חלופית המספקת אישור עצמאי של הממצאים. הגורם המגביל הראשון בהכנה של שברים subcellular מפרוסות בהיפוקמפוס tetanized פרט הוא הכמות הנמוכה של חומר. שני, הליך הטיפול הוא קריטי משום שמניפולציות גם מאוד קצרות וקלות של ליטרiving פרוסות עלולה לגרום להפעלה של מפלי איתות מסוימים. כאן אנו מתארים את זרימת עבודה מותאמת על מנת להשיג כמות מספקת של שבריר מועשר הגרעיני של טוהר מספיק מאזור CA1 של פרוסות בהיפוקמפוס חריפות ממוח חולדה. כדוגמא מייצגת אנו מראים כי צורת ERK1 / 2 פוספורילציה של שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב באופן פעיל translocates לגרעין על אינדוקציה של LTP וניתן לאתרם בשבריר מועשר גרעיני מתאי עצב CA1.

מבוא

Synaptic N-methyl-D-aspartate-קולטנים (NMDARs) לשחק תפקיד מכריע בפלסטיות הסינפטית והישרדות תא האיתות ואילו הפעלה של NMDARs extrasynaptic יכולים לגרום ניוון מוחיים ומוות של תאים. שינויים אלה תלויים בביטוי גנים תלויים / פעילות מוסדרת לפיקוח הדוק ולכן דורשים תקשורת מתמדת בין הסינפסות מופעלות או דנדריטים והגרעין 7. MAP קינאזות ERK1 / 2 הם effectors במורד הזרם של NMDARs הסינפטי איתות ומעורבות בביטוי גנים הנגרם על ידי NMDAR-הפעלה, ואילו איתות באמצעות NMDAR extrasynaptic יש השפעה מעכבת על ERK1 / 2 פעילות 8,11 לא או.

ישנם מספר החלבונים שהוכחו הסעות בין דנדריטים דיסטלי והגרעין. רבים מחלבונים אלו מכילים אות לוקליזציה גרעינית ומועברים באופן פעיל לאורך microtubuli בdynein ואופן importin תלוי לגרעין 6,9. Interestingly, כמה מהשליחים אלה מעבר רק לגרעין בתגובה לגירויים הסינפטי ספציפיים. לדוגמא, תחבורה מדרדר של אלמנט המחזורי AMP תגובה מחייב חלבון 2 (CREB2) היא מושרה על ידי בע"מ הכימי אך לא 12 LTP. גירוי הסינפטי NMDAR תלוי מקומי מניע coactivator מוסדר CREB תעתיק (CRTC1) לתוך הגרעין, תהליך טרנסלוקציה, העוסק בפלסטיות בהיפוקמפוס לטווח ארוך 4. זה היה הראה לאחרונה כי שליח החלבון יעקב translocates לגרעין אחרי שניהם, הפעלת NMDAR הסינפטי וextrasynaptic ומסדיר שעתוק הגנים תלויים CREB 5. המקור הסינפטי או extrasynaptic של האות מקודד בשינוי posttranslational של יעקב. פעילות הסינפטית גורמת ERK1 / 2 זירחון התלוי של יעקב בסרין מכריע בעמדה 180 (pJacobS 180) שבו הוא נחוץ לטרנסלוקציה לאחר הגרעין בתרבות בהיפוקמפוס העיקרית. יתר על כן, אניn נוירונים CA1 של pJacobS פרוסות בהיפוקמפוס חריפה 180 translocates לגרעין לאחר LTP טחונות שפר אך לא בע"מ 1,10. pS180 יעקב מוביל לביטוי מוגבר של גנים הקשורים פלסטיות וביטוי גנים זה הזנות חזרה לתפקוד הסינפטי. בניגוד חד, יעקב שtranslocates לגרעין לאחר הפעלת NMDARs extrasynaptic לא phosphorylated בSer180 ועשויה להיות קשורה לחלבון מורכב שונה בגרעין גורמת ל'CREB לכבות "ונסיגה של קשרים סינפטיים 10.

מחקרים שפורסמו ביותר על היבוא הגרעיני של שליח חלבון synapto-גרעיני נעשו בתרבויות עיקריות עצביות ניתק. לכן זה יהיה מעניין לראות אם ניתן לשחזר בממצאים כאלה מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי תנאי שימוש בפרוסות בהיפוקמפוס בי קישוריות ותפקוד עצביים הם הרבה יותר טוב נשמר. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להערכת LTP-deתלוי טרנסלוקציה הגרעינית של שליחי חלבון על ידי immunoblotting. שיטה זו מתאימה גם לניתוח זירחון התלוי פעילות של חלבונים בשבריר גרעיני גולמי. באופן ספציפי, את הפרוטוקול הנוכחי כרוך הכנת פרוסות חריפות בהיפוקמפוס CA1, אינדוקציה, והקלטה של ​​LTP. בשלב הבא, אזור CA1 הוא גזור מיקרוסקופי כדי לבודד את האזור מגורה. שלבנו והותאמנו הפרוטוקול לבידוד גרעיני שסופק על ידי CellLytic גרעיני הפקת ערכה עם שינויים שהוכנסו על ידי זאו ועמיתים 17. הליך אופטימיזציה כולל תמוגה של אזורי CA1 גזורים במאגר hypotonic מאפשרת נפיחות תא ושחרור של גרעינים. תמוגה תא ומורפולוגיה גרעינים ניתן לקבוע על ידי בדיקה מיקרוסקופית. העשרה גרעינית מושגת על ידי צעד צנטריפוגה קצר. Immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד NeuN וNSE2, סמנים ספציפיים של שברים גרעיניים או cytosolic, מצביע על כך שגישה זו יכולה לשמש כמהירהוהפרוטוקול לשחזור לבודד את השברים subcellular אלה וללמוד שינויי posttranslational מאוד יציבים כמו זרחון חלבון. בנוסף, בשיטה זו יש יתרון לדגימות רקמה קטנות הנובעות מאזורי CA1 גזורים של פרוסות בהיפוקמפוס וניתן להשתמש בו בשילוב לאימונוהיסטוכימיה של פרוסות בהיפוקמפוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

.1 הכנת אקוטית בהיפוקמפוס פרוסות ממוח חולדה למבוגרים

  1. הרדימי חולדות עם isoflurane. זהירות: בצע את ההליך באמצעות exicator סגור, לא לשאוף isoflurane. ודא כי בעל החיים הוא מורדמים לחלוטין.
  2. לערוף את העכברוש, במהירות לבודד את המוח, ולטבול אותו בprecarbonated (95% O 2/5% 2 תערובת גז CO) קר כקרח הפתרון של הגיי (הרכב במ"מ: 2H 2 O 130 NaCl, 4.9 KCl, 1.5 CaCl 2 · , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6 שעות 2 O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, גלוקוז 5 · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, pH 7.32) ל30 דקות 1,2,10,16.
  3. הסר את המוח הקטן וחלק של קליפת המוח entorhinal. הפרד את ההמיספרות בקליפת המוח עם חתך באמצע sagittal, ואז למקם את כל חצי הכדור על המשטח המדיאלי שלה. לאחר מכן להפוך את50-70 ° חתך (רוחבי 50-70 °) לאורך קצה הגב של אונה כל 13,14.
  4. הדבק כל חצי הכדור עם משטח שזה עתה נקצץ על פלטפורמת החיתוך של מערכת חתך. הפלטפורמה צריכה להיות מכוסה על ידי הפתרון של הגיי קר כקרח precarbogenated.
  5. חותך 350 מיקרומטר 50-70 ° פרוסות רוחביים מקדמיים לאחוריים צד באמצעות vibratome המותאם ללמזער תנודת ציר z. ההיווצרות בהיפוקמפוס, הקורטקס subicular וentorhinal, כמו גם את קליפת המוח שממוקם דורסולטרלי להיפוקמפוס תהיה חלק מהפרוסות המשמשות לניסויים 13,14.
  6. העבר את פרוסות בהיפוקמפוס לU-צורה וחממת סוג שקועה ודגירה של לפחות שעה 2 ב 32 מעלות צלזיוס עם מלאכותי נוזל השדרתי carbogenated (ACSF המכיל במ"מ: 110 NaCl, KCl 2.5, 2.5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1.5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 גלוקוז · H 2O, 27.4 3 NaHCO, pH 7.3) 1,2,10,16.

.2 מיקום של אלקטרודות, Baseline הקלטה, ואינדוקציה של LTP

  1. העבר את הפרוסה בהיפוקמפוס לתא הקלטת הסוג שקוע רכוב תחת מיקרוסקופ. Perfuse (6-7 מ"ל / דקה) עם ACSF carbogenated לפחות 30 דקות ב32 ° C.
  2. הכן microelectrodes נימי זכוכית מלא ACSF (התנגדות קצה היא 3-5 MΩ).
  3. הנח microelectrodes זכוכית מלא ACSF בסיבי CA1 שפר-בטוחות לגירוי ובradiatum שכבת CA1 לfEPSP הקלטת 1,2,10 (איור 2). המרחק בין האלקטרודות צריך להיות על 300 מיקרומטר.
  4. לעורר שדה פוטנציאלים מעוררים Postsynaptic (fEPSPs) על ידי גירוי של סיבי שפר-טחונות עם פולסים biphasic מלבניים הנוכחיים (200 אלפיות שני / קוטביות) בטווח של 3-4 V.
  5. בצע את בדיקת הגירוי המקסימלי על ידי מדידת inpמערכת יחסים וut-פלט להגדיר את כוח הגירוי כ40% מערכי fEPSP-שיפוע מרביים שהושגו ולשמור אותו קבוע לאורך כל הניסוי.
  6. בגין ההקלטה הבסיסית לפחות 15 דקות לאחר בדיקת הגירוי המקסימלי. מדוד את התגובות לגירויים לבדוק בכל דקה לאורך כל הניסוי. לבצע הקלטות תחילת המחקר עם גירוי בתדר נמוך.
  7. רשום את הבסיס לדקות לפחות 30.
  8. לזירוז המאוחר LTP להחיל בתדירות גבוהה 100 tetanization הרץ בהרכב של שלוש רכבות גירוי 1 שניות ב 100 הרץ עם מרווח intertrain 5 דקות. כדי להגדיל את השדה של גירוי בתוך אזור 5 bicuculline מיקרומטר CA1 ניתן לכבס ב2 דקות לפני tetanization ויש לשטוף מייד לאחר tetanization האחרון.

.3 אוסף של פרוסות לאחר האינדוקציה של LTP והקפאת ההצמדה

  1. Stop LTP הקלטת 2 דקות או 30 דקות אחרי שלוש רכבות של גירוי tetanic גרימה המאוחר LTP.
  2. הסר את אלקטרודות ובמהירות להעביר את הפרוסה על גבי פלטפורמת מתכת precold הניחה על קרח יבש. חזור על התהליך עבור פרוסת שליטה נשמרת בחממה בצורת U. זהירות: כפפות שימוש תוך כדי עבודה עם קרח יבש.
  3. אסוף כל פרוסה בצינור 1.5 מ"ל ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.

.4 בידוד של שברים מועשרים גרעיניים מאזור CA1 של ההיפוקמפוס

  1. קח 1.5 צינורות מ"ל אפנדורף עם פרוסות קפואות מ-80 מעלות צלזיוס ולשמור אותם על קרח.
  2. הוסף 0.5 מ"ל של פרוטאז הטרי הקר TBS מאגר המכיל (PI) ומעכבי phosphatase (PS), לתוך הצינור. דגירה של 2-3 דק 'ולהעביר לסטראו. זהירות: כפפות מגן שימוש וחלוק מעבדה תוך כדי עבודה עם PI וPS.
  3. לנתח את אזור pyramidale שכבת CA1 של ההיפוקמפוס באמצעות שתי מחטים. השתמש במחט אחת להחזקת הפרוסה תחת סטראו והמחט השנייה לחיתוך אזור CA1.
  4. לאסוף את CA גזור1 אזורים מ5 פרוסות (לכל קבוצה) לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש המכיל 50 מאגר תמוגה μl (1X חיץ hypotonic תמוגה מכיל מ"מ: 10 HEPES, 1.5 MgCl 2, 10 KCl, pH 7.9, עם PI וPS). שים לב שסכום זה של חומר יהיה מספיק כדי לרוץ 2-3 immunoblots.
  5. Homogenize רקמות שנאספו על ידי pipetting למעלה ולמטה זהירים. השתמש בפיפטה 200 μl. דגירה lysate על קרח למשך 5-7 דקות, כדי לאפשר לתאים להתנפח.
  6. קח 2 μl של lysate, לרדת בשקופית מיקרוסקופית, ולדמיין את הנפיחות של התאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. עם נפיחות תקינה של תאי הגרעינים מופיעים כעגולים מבנים בשלמותה.
  7. לאסוף 20 μl של מדגם לתוך צינור 1.5 מ"ל טרי כמו "שבר homogenate '. הוסף 8 μl של denaturing חיץ מדגם SDS 4x.
  8. צנטריפוגה lysates שנותר ב11,000 סל"ד במשך דקות 1.
  9. לאסוף את supernatant בזהירות מהחלק העליון ("חלק cytosolic '), TRansfer לתוך צינור חדש ולהוסיף 20 μl של חיץ מדגם 4x.
  10. Resuspend גלולה ב60 μl של חיץ hypotonic ולהוסיף 20 μl של חיץ מדגם 4x. חלק זה נקרא "חלק גרעיני מועשר".
  11. Homogenate, cytosolic, ושברים מועשרים גרעיניים יכולים להיות מאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס במשך immunoblotting מאוחר יותר.

.5 Immunoblotting Semiquantitative לחלבוני synapto-גרעיניים

  1. Defreeze הדגימות ולהרתיח אותם במשך 5 דקות ב95 מעלות צלזיוס.
  2. קח 5 μl כל חלק מן ולקבוע את ריכוז החלבון על ידי amido מבחן שחור או מבחן BCA.
  3. לטעון כמות שווה של דגימות חלבון מhomogenate, שברים מועשרים cytoplasmic והגרעיניים על SDS-PAGE. דוגמאות משליטה ופרוסות LTP צריכים להיות ממוקמות באותו ג'ל להשוואה ישירה.
  4. לבצע הליך סופג מערבי סטנדרטי (העברה רטובה מומלצת).
  5. לחקור את הקרומים עם t הוא הנוגדנים של בחירה. בהמשך לכך באותו כתמים (או אותו דגימות להריץ במקביל) יכולים להיות נחקרים עם הסמן cytoplasmic - enolase2 נוירון ספציפי (NSE2) וסמן גרעיני - NeuN ונוגדן -actin כביקורת טעינה.

ניתוח .6 נתונים

  1. יעילות של האינדוקציה LTP יכולה להיות מנותחת על ידי תוכנת Clampfit. השיפוע הממוצע של הקלטות תחילת המחקר היה בהשוואה למדרונות לאחר tetanization באמצעות דו כיוונית ANOVA, p <0.05 נחשבו שונים באופן משמעותי. ערכי מדרון fEPSP תוארו בתרשימים כממוצע ± SEM
  2. לכימות של immunoblots, לסרוק או סרט autoradiographic ולנתח את הצפיפות המשולבת של להקות חלבון על ידי ImageJ או להקות הקרינה עם מערכת Licor. ערכים של להקות immunoreactive צריכים להיות מנורמלים לטעינה מלאה וסופג. לשם השוואה של השליטה וקבוצות LTP עשוי לשמש Mann-Whitney U-מבחן nonparametrical.
שם של החיץ מגיב ריכוז (מ"מ) הסכום תגובות / תיאור
הפתרון (pH: 7.3 ~ 7.4) של הגיי NaCl 130 7.6 גרם סינון סטרילי
1,000 מ"ל KCl 4.9 0.37 גרם
CaCl 2 · 2H 2 O 1.5 0.22 גרם
4 MgSO · 2H 2 O 0.3 .0739 גרם
MgCl 2 · 6 שעות 2 O 11 2.24 גרם
KH 2 PO 4 0.23 .0313 גרם
Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 0.8 .2145 גרם
גלוקוז · H 2 O 5 .9909 גרם
HEPES 25 5.96 גרם
NaHCO 3 22 1.85 גרם
ACSF (pH: 7.3 ~ 7.4) NaCl 110 6.428 גרם סינון סטרילי
1,000 מ"ל KCl 2.5 .1865 גרם
CaCl 2 · 2H 2 O 2.5 0.368 גרם
4 MgSO · 2H 2 O 1.5 0.370 גרם
KH 2 PO 4 1.24 0.169 גרם
גלוקוז · H 2 O 10 1.9817 גרם
NaHCO 3 27.4 2.3 גרם
1x hypotonic חיץ (pH: 7.9) HEPES 10 0.23 גרם
100 מ"ל MgCl 2 · 6 שעות 2 O 1.5 .0304 גרם
KCl 10 .07455 גרם
cellpadding = cellspacing "0" = "0">

טבלה 1 חוצצים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יש לנו הראינו בעבר כי שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב מצטבר בגרעין בעקבות האינדוקציה של LTP אבל לא 1 בע"מ. יתר על כן, טרנסלוקציה של יעקב לאחר גירוי הסינפטי דורשת הפעלה של MAPK ERK1 / 2 וזירחון של יעקב בSer180 (איור 1). פוספורילציה יעקב translocates לגרעין באופן importin תלוי ומדינת פוספורילציה יכולה להישמר על פני תקופות זמן ארוכות על ידי עמותה עם נימה ביניים αinternexin 15 (איור 1). Phospho מדינתו של יעקב היא חשובה לביטוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל לספק הדרכה כיצד להכין חריף בהיפוקמפוס פרוס מחולדות צעירות או מבוגרים, לעורר והשיא LTP, במהירות לנתח אזור מגורה של הפרוסה, ולהכין חלק מועשר גרעיני ללימוד דינמיקת חלבון תלוי פעילות. גישה זו נובעת משילוב של מספר שיטות שונות המשמשות באופן עצמאי אחד מהשני. אנו מותאמים זרימת עבודה ולספק פירוט מספיק למתחילים כדי להגדיר את הניסויים שלהם ללמוד חלוקה מחדש subcellular של חלבונים על אינדוקציה של LTP. כדוגמא אנו מראים כי הצורה המאוחרת של LTP גורמת הצטברות הגרעיני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), מענק DIP (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), המרכז למדעי המוח ההתנהגותיים (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK ו-SB), MM הוא זוכה מלגה ארוכת טווח של הארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית (EMBO) (EMBO ALTF 884-2011) ומארי-קירי IEF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

Reagents
רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Equipment
CED 1401 AD/DA ממירCambridge Electronics Design, UK
a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscope>Leica S4E, גרמניה
VibrotomeLeica VT1000S, גרמניה
ממריץ דופק מבודדA-M מערכות, ארה"בדגם 2100
צנטריפוגהתרמו מדעי
SDS-PAGE מערכתBiorad
CoolerJulabo
מיקרוסקופ שדה בהירNikon Eclipse TS100
חממת תרבית תאיםThermo Electron Corporation
Micromanipulatorלואיגס & נוימן, SM-5, גרמניה
תא ספיגה וספק חשמלHoefer Scientific Instruments, סן פרנסיסקו, קליפורניה
תא הקלטה מסוג שקועבהתאמה אישית
בצורת U וחממה מסוג שקוע בהתאמה
מספריים כירורגיות
אזמל
מרית
פסטר פיפטה
צלחת תרבות פלסטית 
מזרק
<
NaClRothArt.-Nr.3957.1≥ 99.5%, p.a., ACS, ISO
KClRothArt.-Nr.6781.1≥ 99.5%, p.a., ACS, ISO
CaCl2· 2H2OMerck1.02382.0500pro analysis
MgSO4· 2H2OMerck5886.05pro analysis
MgCl2· 6H2OAppliChemCAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946לביולוגיה מולקולרית
KH2PO4Merck12034.025לביולוגיה מולקולרית
Na2HPO4· 2 שעות<תת>2OMerck1.06574.1000טהור במיוחד
· H2ORothArt.-Nr.6887.1לביולוגיה מולקולרית
HEPESRothArt.-Nr.9105.4PUFFERAN, ≥ 99.5%, PA
NaHCO3Merck1.06329.1000פרו אנליזה
קוקטייל מעכב פרוטאז רוש
פוספוסטופרוש
ביקוקוליןטוקריס ביוסיינס
איזופלורןבקסטר
<חזק>נוגדנים
נוגדנים ראשונייםמספר קטלוגישל החברהמינים
pJac-s180ארנב ביוגנים(מדולל 1:100)
עכבר NeuNMiliporeMAB377(מדולל 1:1,000)
NSECell SignalingD20H2ארנב (מדולל 1:1,000)
בטא-אקטיןסיגמאA-5441(מדולל 1:5,000)
נוגדנים משנייםמספר קטלוגישל החברהמינים
IgG HRP מצומדDAKOעז נגד עכבר (1:5,000)
IgG HRP מצומדNEBעז נגד ארנב (1:5,000)
<אישיתקטנותדקה פלסטיק Bunsentd colspan="4"> גלוקוז עכבר

מקורות

  1. Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276(2011).
  2. Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
  3. Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
  4. Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
  5. Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).
  6. Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
  7. Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
  8. Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
  9. Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
  10. Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
  11. Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
  12. Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
  13. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  14. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
  15. Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
  16. Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
  17. Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פרקציה מועשרת גרעיניתאזור CA1השראת LTPאנליזת Western Blotחלבון סינפטו-גרעיניזיהוי Phospho Jacobבופר ליזיס היפוטונידיסקציה של רקמהטרנסלוקציית חלבונים
בידוד של CA1 גרעיני שברים מועשרים מSlices בהיפוקמפוס לחקר פעילות תלויה גרעיני יבוא של חלבונים Messenger synapto-גרעיניים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.