הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

15.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51339

⸱

10 באפריל 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, 2EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, 3EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, 4Department of Neurology, CHRU-Lille

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

תקציר

ג'ל אלקטרופורזה דו ממדים (2DE) היא כלי רב עוצמה כדי לגלות שינויי proteome פוטנציאליות הקשורים לתנאים פיסיולוגיים או פתולוגי שונים. בעיקרון, טכניקה זו מבוססת על הפרדת החלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית בשלב ראשון, ושנית על פי המשקלים המולקולריים שלהם על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide SDS (SDS-PAGE). בדוח זה מדגם פרוטוקול הכנה מותאם לכמות קטנה של רקמה שלאחר המוות ומוח עכבר אנושי מתואר. שיטה זו מאפשרת לבצע שתי אלקטרופורזה דו ממדי הבדל הקרינה ג'ל (2D-DIGE) וimmunoblotting 2DE המיני. השילוב של גישות אלו מאפשר לאדם למצוא לא רק חלבונים חדשים ו / או שינויים בחלבון בזכות הביטוי שלהם לתאימות שלה עם זיהוי ספקטרומטריית מסה, אלא גם תובנה חדשה אימות סמנים. לפיכך, מיני 2DE מצמידים את ההיתרים מערביים סופג לזהות ולאמת את הודעה-Translational שינויים, פירוק חלבונים ומספק השוואה איכותית בין תנאים ו / או טיפולים שונים. בזאת, אנו מספקים שיטה ללמוד רכיבים של אגרגטים חלבון שנמצאו בספירה ודימנציה גופיפי לוי כגון פפטיד עמילואיד בטא ואלפא סינוקלאין. השיטה שלנו ובכך ניתן להתאים לניתוח proteome וחלבונים מסיסים לחלץ מדגמי רקמת המוח ועכברים אנושיים מדי. במקביל, היא עשויה לספק מידע שימושי לחקר מסלולים מולקולריים ותאיים המעורבים במחלות ניווניות כמו גם סמנים ביולוגיים רומן פוטנציאליים ומטרות טיפוליות.

מבוא

הפרעות נפשיות ונוירולוגיות מייצגות 13% מהנטל העולמי של מחלה, אתגרים חדשים כמו מנגנונים pathophysiological, גורמי סיכון וסמנים ביולוגיים prodromal חייבים להיחקר 1. בקנה אחד עם מטרה זו, מחקרי פרוטאומיקה של המוח האנושי הפכו הכרחיים כדי לחשוף את המסלולים מולקולריים מעורבים בתהליכים כמו זיכרון, התנהגות, רגשות ופלסטיות עצבית למשל, לא רק לפיסיולוגי, אלא גם למצבים פתולוגיים. לכן, השימוש במודלים של בעלי חיים ובאופן ספציפי יותר עכברים הטרנסגניים, מביא מגוון רחב של אפשרויות על מנת לחקות את אטיולוגיה של מחלות המוח ניווניות 2.

פרוטאומיקה גישות זמינות כיום על מנת להשיג את נקודות המבט חדשים בתחום מדעי המוח. אלקטרופורזה דו ממדי ג'ל (2DE) היא שיטה פשוטה ורבה עוצמה סבירה, המאפשרת להשוות את proteome של מגוון רחב של דוגמאות. יתר על כן, הוא גםשיטה רבת עוצמה לבודד את חלבון מתערובת מורכבת על מנת לזהות ולנתח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה. טכניקה זו בעצם מורכבת בשני שלבים רצופים: 1) הפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית (PI) על ידי isoelectrofocusing (IEF). לייתר דיוק, פוטנציאל חשמלי מוחל על פני רצועות acrylamide immobiline בין שיפוע pH ולאחר מכן החלבונים יעברו ולהתמקד בפיי נחוש בפונקציה של מטען נטו הגלובלי שלהם. 2) חלבוני Isoelectrically ממוקדים הם מפוגלים ומטען שלילי על ידי התוספת של נתרן גופרתי dodecyl (SDS), ובכך חלבונים במבנה הראשון שלהם מופרדים בהתאם למשקל המולקולרי לכאורה שלהם (MW) על ידי-SDS 3. שני מאפיינים ייחודיים אלה מאפשרים לנו להתמודד עם ערך כפול ללכת רחוק יותר במחקר של proteome. מצד אחד גישה זו מציעה את האפשרות לבצע ניתוח כמוני באמצעות צבעים מינימאליים שיטת 2D-DIGE, ומצד שני qualitativניתוח דואר על ידי מיני 2DE מצמידים מערבי סופג.

ניתוח כמותי של 2D-DIGE מעניק ביטוי חלבון משתנה בכל רחבי proteome המדגם. בקצרה, דגימות מסומנות עם שלוש cyanines (Cy2, Cy3 וCy5) פולטת בשלושה אורכי גל שונים (כחול, ירוק ואדום). צבעים מינימאליים פלואוריד אלה המכילים קבוצת succinimidyl אסתר N-הידרוקסי מגיבים עם קבוצת ε-אמינו של שאריות lysines של חלבונים וכתוצאה מכך אגרות חוב אמיד קוולנטיים 4. שאריות ליזין מסומנות רק בין 1-3% ובכך מונע בנוסף תוויות מרובות לכל חלבון ושינויים גדולים תשלום נטו 5, 6. Cy3 וCy5 משמשים לעתים קרובות כדי לתייג את שני מדגמים בלתי תלויים ואילו Cy2 תגי תמהיל שלהן משקל שווה בדגימות כדי להשוות. שני היתרונות העיקריים הם כי כל הדגימות שכותרתו הן מעורבות וIEF ו- SDS מתבצעים בג'ל אחד בפעם אחת לכל שלב, תוך הימנעות מהשתנות היתר בקרב ניסויים בשל ג'לי השוואה. יתר על כן, הוא מציג סף זיהוי גבוה של כ 1 femtomole של חלבון 7. ג'לים נסרקים ותוכנת 2D משווה את תמונות 2D ג'ל הקרינה, שבו Cy2 משמשת כתקן המאפשר זיהוי של הבדלים סטטיסטיים בין הכתמים לזיהוי האחורי שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה פנימי. תוכנת ניתוח 2D באמצעות התקן הפנימי משיגה זיהוי מהיר של פחות מ -10% מהבדלים בין דגימות עם יותר מ 95% של ביטחון סטטיסטי 8.

ניתוח איכותני על ידי מיני 2DE הוא צעד חיוני לאפיון חלבונים. העיקרון הוא אותו כפי שתואר לעיל עבור PI והפרדת MW, אבל במקרה הזה חלבונים מועברים מג'ל polyacrylamide קטן קרום וimmunoblotting מתבצע לאחר מכן. בעוד ג'ל אלקטרופורזה ממד אחד מספקת שינויים בביטוי חלבונים לאחד או כמה אפיטופים חלבון בתפקוד של הנוגדן, information של מיני 2DE מעניק עם שני פרמטרים נוספים. ראשית, isovariants חלבון השינוי בתפקוד של פיי, המצביע על כך שלאחר translational שינויים עשויים להתרחש. שנית, זיהוי ספקטרומטריית מסה עשויה להצביע על zymogens הסביר ומוצרים קטבולי של חלבונים. לכן, שינויים שנצפו על ידי 2D-DIGE צפויים מעיד על המנגנונים העומדים בבסיס שינויים בפרופיל proteome הגלובלי. מערכים של immunoblots בין כמה דוגמאות מאותה epitope החלבון / s על ידי מיני 2DE עשויים לשקף שינויי חומציות לשפוך אור לתוך וריאציות לאחר translational מעט נצפו או אפילו לא על ידי immunoblotting monodimensional 9, 10. יתר על כן, ניתוח זה מודיע על אתרי מחשוף הפוטנציאליים בשל הידע של הצרכן וMW של השאריות מטבולי 11,12.

השילוב של שתי טכניקות אלה מספק ניתוח פרוטאומיקה משלים. מצד אחד 2D-DIGE מקנה typדואר של הבדלים המאפשרים בידוד מדויק של פוליפפטידים הביטוי שלו הוא שונה. הבדלים אלה כוללים למעשה להופעה או ההיעלמות של נקודה או עלייה / ירידה של עוצמת נתון אחד על ידי ניתוח תוכנה של ג'לי הניאון. עם זאת, התצפיות הללו על ידי עצמם הן סבירה כדי להסביר את טיבו של השינוי שנצפה. מסיבות אלה, ברגע שפוליפפטיד בודד וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה, השימוש במיני 2DE מאפשר לאשר 1 בדיוק) את זהותו של החלבון מבודד ו2) טבעו של ההבדל: השינוי ברמת isovariant / איזופורם של ביטוי, שלאחר translational שינויים ותהליכי מחשוף למשל. עם זאת, יש צורך לפתח את מאגר תמוגה מתחיל שניהם בקנה אחד עם 2D-DIGE ועם מיני 2DE על מנת להגביל תפוצות הפוטנציאליות הנובעות מהשימוש בפרוטוקולי חילוץ כי הם מאוד שונים.

במאמר הנוכחי, אנחנו דהשתואר בפרוטוקול מותאם להכנה, החילוץ וביצועים של 2D-DIGE וטכניקות מיני 2DE לחלבונים במוח מגיעים מהרקמה אנושית ועכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. Homogenization והפקת חלבון סה"כ מרקמת המוח אנושית ומאוסה

  1. המגון רקמת מוח. Homogenize רקמת המוח 10% (w / v) ב8 M אוריאה, 2 M thiourea ו1% w / v חיץ SDS (UTS) באמצעות זכוכית הקדר (עבור דגימות אנושיות) או homogenizer טפלון (עבור דגימות עכברים). Sonicate ב60 הרץ 30 פולסים עם גנרטור אולטרסאונד החלת 0.5 שניות להתפרקות מוחלטת רקמת 13, 14.
    1. קביעת ריכוז חלבון עם assay ברדפורד, באמצעות ארגון ה-BSA כסטנדרט. זה UTS חילוץ חיץ הוא תואם לחלוטין עם הממד SDS-PAGE אחד כל עוד lysates אינו מעל מחומם כדי למנוע carbamylation 15.
    2. להוסיף 1% (w / v) של Amberlite דגירה עם ערבוב עדין ב10 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר מכן לסנן על 0.22 מיקרומטר מסנני מזרק ולבסוף מוסיף SDS לפתרון האוריאה / thiourea. צעד זה מפחית את כמות חומצת שתן וחומצת isocyanic, אשר נמצאות בequilibrium עם אוריאה בפתרון ולהקל על השפלתה.
  2. משקעים חלבון כלורופורם / מתנול. משקע בין 100-150 מיקרוגרם של חלבון ל11 סנטימטר רצועות IPG ​​ו1-1.5 מ"ג ל18 אלה סנטימטר (באופן עצמאי בטווח pH נבחר לבצע IEF).
    1. לבצע את כל הצעדים על קרח או על 4 ° C. כלורופורם מגניב ומתנול על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני שמתחיל את ההליך המשקעים.
    2. הוסף שלושה כרכים של מתנול ונפח אחד של כלורופורם לכרך אחד של lysate UTS. לנער באופן ידני את התערובת ולהוסיף שלושה כרכים של מים קרים. וורטקס בדקות 1 ו גלולה את החלבונים על ידי צנטריפוגה ב12,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C.
    3. בטל supernatant באמצעות פיפטה פסטר ולהוסיף שלושה כרכים של MeOH הקר. מערבולת שוב וצנטריפוגות ב XG 12,000 במהלך 30 דקות ב 4 ° C. לבסוף להשליך supernatant ויבש גלולה תחת N 2.
  3. הכנה של חלבונים לניתוח 2D.Resuspend את הכדור מיובש חלבון 2D-החיץ (8 M אוריאה, 2 M thiourea השלים עם בחורים 4%). שטוף את הפתרון עם Amberlite כפי שצוין לעיל ומנסה לשמור על חלקם של 500 מיקרוגרם חלבון לכל 200 μl של חיץ 2D עבור 2D-DIGE. הערה: חיץ 2D ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס או נשמר על 4 מעלות צלזיוס במהלך שבוע אחד (כדי למנוע השפלה אוריאה).
    1. Sonicate ולאחסן דגימות ב-80 ° C עד ביצוע הצעד הבא. ראוי לציון, פרוטוקול זה יכול לשמש לאחר solubilization חומצה פורמית של חלבון אגרגטים 10. בקצרה, יתאדה חומצה פורמית תחת N 2 ו resuspend את הכדור כפי שתואר.

2. 2D-DIGE

  1. דוגמאות לבדוק את האיכות. דגימות מינון שוב בשיטה ברדפורד. לדלל 15 מיקרוגרם של חלבונים במאגר LDS מדגם, חום על 37 מעלות צלזיוס 15 ולטעון על גבי ג'לים polyacrylamide 4-12%.
  2. מכתים Coomassie. כתם ג'ל polyacrylamide עם 0.1% (w / v) CoomassieBlue-G-250, 50% EtOH ו10% (v / v) פתרון חומצה אצטית במשך שעה לפחות 1. בואו רקע destain הלילה ב -7% חומצה אצטית ו10% (v / v) פתרון אתנול.
  3. תיוג טרום electrophoretic של דגימות. קודם לביצוע תיוג לצבוע cyanine, לאמת את ה-pH של המדגם, שאמורה להיות בסיסיים או אפילו ניטראלי מאז החלפת N-hydroxysuccinimide היא יעילה יותר ב-pH הבסיסי וניתנה להיות אופטימלי ב-pH 8.6.
    1. תווית מינימאלית שתי דוגמאות של מחקר עם צבעי ניאון Cy3 או Cy5 עם יחס של 50 מיקרוגרם protein/400 צבע pmol ולשמור עבור שעה 1 ב 4 ° C בחושך כדי להקל על קבוצת אסתר תגובתי NHS של cyanines עם אמין unprotonated קבוצות של lysines.
    2. להפחית וריאציות מדגם ביצוע תיוג צולב עם צבעי Cy3 וCy5, הימנעות צימוד מועדף של מדגם אחד לcyanine מסוים. שים לב שהתיוג המינימלי cyanine צבען יכול להיות מותאם לכמות קטנה של חלבונים עם שמירה על היחס של 1 מיקרוגרם יחסי ציבורotein ל8 cyanine לצבוע pmol. אם כן, מערכת המיני 2DE יכולה לשמש במקום מערכת ג'ל 2D הגדולה. זה יאפשר ניתוח 2D-DIGE לכמות קטנה של רקמת המוח.
    3. תווית בריכה של שני הדגימות עם אותה הכמות של חלבון (50 מיקרוגרם בסך הכל) עם פלורסנט לצבוע Cy2 ומשמש כסטנדרט פנימי. השתמש באותם תנאים כפי שצוין קודם לכן.
    4. השלם μl סך נפח 350 עם חיץ 2D המכיל 1.1% מגיב Destreak, .1.2% של חיץ IPG ועקבות כחול bromophenol 150 מיקרוגרם הכולל של חלבונים שכותרתו (50 מיקרוגרם של Cy2, 50 מיקרוגרם של Cy3 ו50 מיקרוגרם של Cy2). לבצע שלב זה בארבעה באמצעות ארבע רצועות עצמאיות. יתר על כן, להכין שתי רצועות נוספות שאינו מסומנות (אחד עבור כל דגימה) עם 350-450 מיקרוגרם של חלבון לג'לי preparative.
    5. השאר את שש הרצועות טעונות מכוסות בלילה שמן מינרלים להחזרת נוזלים פסיביים.
  4. Isoelectrofocusing. לבצע את IEF ב206; ג לpH 3-11NL, 18 סנטימטר להפשיט את הפרוטוקול הוא: הגדרה נוכחית המרבית היא 50 μA / רצועה במהלך 8 שלבים: 1) 150 V צעד במשך שעה 1, 2) 200 V צעד במשך שעה 5, 3) 500 V שיפוע עבור 2 שעות,, 5) 2,000 שיפוע לשעה 2, 6) 4,000 שיפוע לשעה 2, 7) 8,000 שלב 4) שיפוע 1,000 V עבור שעה 2 V V V שיפוע עבור שעה 2 ו -8) עבור סכום כולל של 24,000 V · hr . לאחר IEF, לשגר את עודף שמן מינרלים באמצעות נייר כרומטוגרפיה ולאחסן את הרצועות ב-20 ° C עד הממד השני.
  5. IPG רצועות איזון. לאזן רצועות ב6 M אוריאה, 2% SDS, 30% גליצרול, 50 מ"מ טריס-HCl pH חיץ 8.6 עם 1% מDTT במהלך 15 דקות ואחרי 4.7% מiodoacetamide באותו החיץ אך ללא DTT.
  6. ממד שני או אלקטרופורזה-SDS. להפוך את ששת ג'לי-SDS 12% (1.5 M טריס-HCl pH 8.6, 12% acrylamide / bisacrylamide, 0.1% (w / v) SDS, 0.072% (w APS / V) ו0.1% (v / v) TEMED ) באותו הזמן באמצעות מערכת 2D גדולה, עם ארבעה לוחות זכוכית נמוכה הקרינה לstriנ.ב. עם דגימות הקרינה ושני לוחות זכוכית אחרים עם 1.5 מ"מ של עובי לג'לי preparative כדי שיחתכו את כתמי החלבון.
    1. טען את שש רצועות IPG ​​בחלק העליון של ג'לים ושוב שכבתי עם 0.5% (w / v) של agarose. מאגר פועל מורכב מ25 מ"מ טריס, גליצין 192 מ"מ ו0.1% (w / v) SDS. לבצע את ההגירה ב2.5 W / ג'ל לילה עם מערכת קירור להגדיר עד 4 ° C 16,17.
  7. רכישת תמונות הקרינה וניתוח. השתמש בסורק טיפון 9400 להשיג תמונות ג'לי הקרינה (12 תמונות לניסוי אחד). סריקת Cy2, תמונות Cy3 וCy5 עבור כל ג'ל ב488/520 ננומטר, 532/580 ננומטר ו630/670 עירור ננומטר / אורכי גל פליטה, בהתאמה. השתמש בתוכנת informatic כדי לנתח את התמונות. הנתונים מייצגים את השינויים של נקודת נפח הקשורים להפצה של האות על פני ארבעה ג'לי בין שני המדגמים שנחקרו.
  8. מכתים Coomassie לג'לים גדול. תקן את ג'לי preparative ב50% (v / v) EtOH ו -3% (v / v) פתרון חומצה זרחתית לפחות 24 שעות. ואז אחרי, לשטוף פעמיים עם מים טהורים במיוחד עבור 20 דקות. בצע צבעוניות ב34% (v / v) MeOH, 17% (w / v) אמוניום סולפט ו -2% חומצה זרחתית ל1 שעות לפני הוספת 0.1% (w / v) Coomassie הכחול G-250. שמור את ג'לי בצבע לפחות 48 שעות וdecolorized במים טהורים במיוחד.
    1. נקודות לזיהוי טרשת נפוצה. ברגע שתמונות הקרינה מנותחות, התוכנה מספקת רשימה של נקודות הביטוי שלו הוא שונה מבחינה סטטיסטית. ידני בלו הכתמים האלה מג'לי preparative. הליך זה דורש תרגול וקצת מיומנות ידנית כדי למנוע זיהום קרטין. ואז אפשר לשמור דגימות במים ב-20 ° C עד שליחה לטרשת נפוצה. זיהוי נקודה הוא תואם לחלוטין עם ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) ואת הרלוונטיות של זהויות חלבון נשפט על פי הסתברות ציון Mowse מבוסס מחושב עם p-value של 0.05 (p <0.05) 18.

    3. Assay מיני 2DE האיכותי

    1. Resuspend של מדגם חלבון במאגר 2D המרבי 100 מיקרוגרם עד נפח סופי של μl 200 לרצועת IPG ​​11 סנטימטר. במקרה של מערכת ביטוי יתר או חלבון מטוהר, הסכום ההתחלתי יכול להיות הוריד ל20 מיקרוגרם.
    2. הוספת 1.1% (v / v) Destreak מגיב, 0.55% (v / v) חיץ IPG ועקבות כחול bromophenol לנפח סופי של μl 200. ואז, מערבולת, לעשות מהר ספין ולטעון לתוך רצועת IPG ​​להחזרת נוזלים פסיביות (להביא את הרצועה לעובי המקורי שלו) לילה מכוסה בשמן מינרלים. הערה: חלקם של חיץ IPG הוא זהה עבור כל המרווח של pH הרצוי (pH 3-11, 4-7, 7-11, וכו '), אבל ההרכב שלה משתנה בפונקציה של טווח ה-pH שנבחר.
    3. Isoelectrofocalisation. בצע IEF ב20 ° C. משך התכנית תלוי במרווח ה-pH שנבחר. ראויים לציון, פרמטרים כגון electroendosmosis עלול להפריע לפרופיל IEF, ובמקרים אלה,אופטימיזציה בזמן electrofocalisation נדרש 19. שים לב: זה לא בהכרח IEF יותר שמספק תוצאות טובות יותר, אבל לקצר את הזמן של IEF יכול גם לשפר את הרזולוציה. לאחר IEF, ניתן לאחסן את רצועות IPG ​​ב -20 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
    4. IPG רצועות איזון. לאזן את הרצועות במאגר המכיל 25 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 20 מ"מ DTT, גליצרול 10%, 5% SDS, 0.05% כחולים bromophenol. לעשות שלושה איזון מתרחץ במשך 15 דקות עם שינוי פתרון החיץ בין כל אמבטיה.
    5. SDS-PAGE. שכבת רצועת IPG ​​על ג'ל טרומי (+1 כן, רצועת IPG ​​11 סנטימטר IPG) עם אחוז polyacrylamide נבחר בהתאם לMW של החלבון של עניין. לאחר מכן, למחוק את הג'ל על גבי קרום ניטרוצלולוזה / PVDF ב100 mV במהלך 33 דקות.
    6. דגירה הלילה עם הנוגדן הנדרש ולדמיין על ידי פעילות peroxidase. לבצע יישור של immunoblots באמצעות פוליפפטידים שאינם קשורים מתגלים על ידי הנוגדנים משני. להגיע חצי quantitative ניתוח על ידי צפיפות של הנפח ועצימות לעקבות / כתמים עם תוכנת ImageJ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטאומיקה על רקמת המוח נותרת מאתגרת שכן אין חיץ אידיאלי קיים כדי להתאושש מחלבונים 100%, במיוחד קרום הקשורים או חלבוני שלד תא. הסט הראשון של ניסויים שהתמקדו בחיפוש אחר מאגר תמוגה מתאים תואם את שתי גישות ואשר מאפשרת לשחזר את פנל גדול של חלבון. לפיכך, שלושה מאגרי תמוגה היו assayed כדי לקבוע את המתאים ביותר. ראשית, הוא שימש חיץ ביולוגיה מולקולרי ביוכימיים והנפוץ טריס-HCl 20 ב10 מ"מ עם 1% (w / v) (איור 1 א) SDS. יתר על כן, יש טריס-HCl יישום חזק כחיץ אל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גילוי פתולוגיות שינויי ביטוי של חלבונים, חיפוש אחר סמנים ביולוגיים והאפנון של מסלולים אפשריים למטרות תרופתיים הם בין המטרות של neuroproteomics גישות 30. בין הכלים מתעוררים, שדה 2DE מוסיף expectative מבטיח. ובכל זאת, יש להגיע להסכמה על מנת למזער ולהגדיל את שונות שחזור בניסויים. בשורתו של רעיון זה פרוטוקול סטנדרטי לבצע 2D-DIGE (איור 2) וimmunoblotting 2DE הבא (איור 3) לאדם ועכברי רקמת המוח תואם באופן מלא עם immunoblotting החד ממדית מתואר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש סופרים שאין ניגוד העניינים להכריז.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת ליל 2, MEDIALZ, LabEx (מעבדה מצוינות תכנית, להשקיע לעתיד) וDISTALZ (פיתוח של אסטרטגיות חדשניות לגישה תחומית למחלת אלצהיימר). FJ.FG הוא כיום מלגת נמען של ANR (צרפתית הסוכנות לאומית למחקר / NeuroSplice דה טאו Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), אבל עבודה זו הייתה גם תחת התמיכה של מענק מJCCM (ספרד).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 ננומול 1 * 5 ננומטר GEHealtcare25-8010-65
Immobiline DryStripGE Healtcareהתייחסות בפונקציה של מרווח/גודל ה-pH
מאגר IPG, pH X-XGE Healtcareהתייחסות בפונקציה של מרווח ה-pH הרצוי
AMBERLITE IRN-150L שרף מיטה מעורב 1 GE Healtcare551797N
נוזל כיסוי רצועה יבשה אימובילין 1 * 1 ליטרGE Healtcare17-1335-01
קופסת ערכה IPG 1 * 1 KITGE Healtcare28-9334-92קופסת פלסטיק לביצוע ההתייבשות הפסיבית 
מסנן MILLEX GSMilliporeSLGS033SB
Criterion XT ג'לים טרומיים 13.3 x 8.7 ס"מ (רוחב x אורך)Bio-Radהתייחסות בתפקוד ה-MW להפרדת
יחידת מיקוד איזואלקטרית IPGphor IIIGE Healtcare11-0033-64
Ettan DALTsix מערכת אלקטרופורזה גדולהGE Healtcare80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 מ"מ חברת ג'לP2D1.5

מקורות

  1. Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
  2. De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
  3. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
  4. Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
  5. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
  6. Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
  7. Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
  8. Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
  9. Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
  10. Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843(2009).
  11. Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
  12. Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
  13. Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
  14. Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
  15. McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
  16. Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
  17. Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
  18. Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57(2010).
  19. Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
  20. Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
  21. Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
  22. Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
  23. Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
  24. Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
  25. Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
  26. Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
  27. Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
  28. Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
  29. Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
  30. Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
  31. Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
  32. Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
  33. Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
  34. Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
  35. Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
  36. Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
  37. Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
  38. Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
  39. Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
  40. Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
  41. Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
  42. Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
  43. Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

2D DIGESDS PAGEWestern Blotting
חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.