חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Francisco-Jose Fernandez-Gomez; Fanny Jumeau; Maxime Derisbourg; Sylvie Burnouf; Hélène Tran; Sabiha Eddarkaoui; Hélène Obriot; Virginie Dutoit-Lefevre; Vincent Deramecourt; Valérie Mitchell; Didier Lefranc; Malika Hamdane; David Blum; Luc Buée; Valérie Buée-Scherrer; Nicolas Sergeant

doi:10.3791/51339

Method Article

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

DOI:

10.3791/51339

⸱

April 10th, 2014

Francisco-Jose Fernandez-Gomez¹ , Fanny Jumeau¹^,² , Maxime Derisbourg¹ , Sylvie Burnouf¹ , Hélène Tran¹ , Sabiha Eddarkaoui¹ , Hélène Obriot¹ , Virginie Dutoit-Lefevre³ , Vincent Deramecourt⁴ , Valérie Mitchell² , Didier Lefranc³ , Malika Hamdane¹ , David Blum¹ , Luc Buée¹ , Valérie Buée-Scherrer¹ , Nicolas Sergeant¹

¹Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, ²EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, ³EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, ⁴Department of Neurology, CHRU-Lille

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'ל אלקטרופורזה דו ממדים (2DE) היא כלי רב עוצמה כדי לגלות שינויי proteome פוטנציאליות הקשורים לתנאים פיסיולוגיים או פתולוגי שונים. בעיקרון, טכניקה זו מבוססת על הפרדת החלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית בשלב ראשון, ושנית על פי המשקלים המולקולריים שלהם על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide SDS (SDS-PAGE). בדוח זה מדגם פרוטוקול הכנה מותאם לכמות קטנה של רקמה שלאחר המוות ומוח עכבר אנושי מתואר. שיטה זו מאפשרת לבצע שתי אלקטרופורזה דו ממדי הבדל הקרינה ג'ל (2D-DIGE) וimmunoblotting 2DE המיני. השילוב של גישות אלו מאפשר לאדם למצוא לא רק חלבונים חדשים ו / או שינויים בחלבון בזכות הביטוי שלהם לתאימות שלה עם זיהוי ספקטרומטריית מסה, אלא גם תובנה חדשה אימות סמנים. לפיכך, מיני 2DE מצמידים את ההיתרים מערביים סופג לזהות ולאמת את הודעה-Translational שינויים, פירוק חלבונים ומספק השוואה איכותית בין תנאים ו / או טיפולים שונים. בזאת, אנו מספקים שיטה ללמוד רכיבים של אגרגטים חלבון שנמצאו בספירה ודימנציה גופיפי לוי כגון פפטיד עמילואיד בטא ואלפא סינוקלאין. השיטה שלנו ובכך ניתן להתאים לניתוח proteome וחלבונים מסיסים לחלץ מדגמי רקמת המוח ועכברים אנושיים מדי. במקביל, היא עשויה לספק מידע שימושי לחקר מסלולים מולקולריים ותאיים המעורבים במחלות ניווניות כמו גם סמנים ביולוגיים רומן פוטנציאליים ומטרות טיפוליות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות נפשיות ונוירולוגיות מייצגות 13% מהנטל העולמי של מחלה, אתגרים חדשים כמו מנגנונים pathophysiological, גורמי סיכון וסמנים ביולוגיים prodromal חייבים להיחקר ^1. בקנה אחד עם מטרה זו, מחקרי פרוטאומיקה של המוח האנושי הפכו הכרחיים כדי לחשוף את המסלולים מולקולריים מעורבים בתהליכים כמו זיכרון, התנהגות, רגשות ופלסטיות עצבית למשל, לא רק לפיסיולוגי, אלא גם למצבים פתולוגיים. לכן, השימוש במודלים של בעלי חיים ובאופן ספציפי יותר עכברים הטרנסגניים, מביא מגוון רחב של אפשרויות על מנת לחקות את אטיולוגיה של מחלות המוח ניווניות ^2.

פרוטאומיקה גישות זמינות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Homogenization והפקת חלבון סה"כ מרקמת המוח אנושית ומאוסה

המגון רקמת מוח. Homogenize רקמת המוח 10% (w / v) ב8 M אוריאה, 2 M thiourea ו1% w / v חיץ SDS (UTS) באמצעות זכוכית הקדר (עבור דגימות אנושיות) או homogenizer טפלון (עבור דגימות עכברים). Sonicate ב60 הרץ 30 פולסים עם גנרטור אולטרסאונד החלת 0.5 שניות להתפרקות מוחלטת רקמת ^{13, 14.}
1. קביעת ריכוז חלבון עם assay ברדפורד, באמצעות ארגון ה-BSA כסטנדרט. זה UTS חילוץ חיץ הוא תואם לחלוטין עם הממד S....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטאומיקה על רקמת המוח נותרת מאתגרת שכן אין חיץ אידיאלי קיים כדי להתאושש מחלבונים 100%, במיוחד קרום הקשורים או חלבוני שלד תא. הסט הראשון של ניסויים שהתמקדו בחיפוש אחר מאגר תמוגה מתאים תואם את שתי גישות ואשר מאפשרת לשחזר את פנל גדול של חלבון. לפיכך, שלושה מאגרי תמוגה היו assayed כדי לקבוע את המתאים ביותר. ראשית, הוא שימש חיץ ביולוגיה מולקולרי ביוכימיים והנפוץ טריס-HCl ²⁰ ב10 מ"מ עם 1% (w / v) (איור 1 א) SDS. יתר על כן, יש טריס-HCl יישום חזק כחיץ אלקטרופ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גילוי פתולוגיות שינויי ביטוי של חלבונים, חיפוש אחר סמנים ביולוגיים והאפנון של מסלולים אפשריים למטרות תרופתיים הם בין המטרות של neuroproteomics גישות ^30. בין הכלים מתעוררים, שדה 2DE מוסיף expectative מבטיח. ובכל זאת, יש להגיע להסכמה על מנת למזער ולהגדיל את שונות שחזור בניסויים. בשורתו של רעיון זה פרוטוקול סטנדרטי לבצע 2D-DIGE (איור 2) וimmunoblotting 2DE הבא (איור 3) לאדם ועכברי רקמת המוח תואם באופן מלא עם immunoblotting החד ממדית מתואר .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש סופרים שאין ניגוד העניינים להכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת ליל 2, MEDIALZ, LabEx (מעבדה מצוינות תכנית, להשקיע לעתיד) וDISTALZ (פיתוח של אסטרטגיות חדשניות לגישה תחומית למחלת אלצהיימר). FJ.FG הוא כיום מלגת נמען של ANR (צרפתית הסוכנות לאומית למחקר / NeuroSplice דה טאו Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), אבל עבודה זו הייתה גם תחת התמיכה של מענק מJCCM (ספרד).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 ננומול 1 * 5 ננומטר GE	Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		התייחסות בפונקציה של מרווח/גודל ה-pH
מאגר IPG, pH X-X	GE Healtcare		התייחסות בפונקציה של מרווח ה-pH הרצוי
AMBERLITE IRN-150L שרף מיטה מעורב 1	GE Healtcare	551797N
נוזל כיסוי רצועה יבשה אימובילין 1 * 1 ליטר	GE Healtcare	17-1335-01
קופסת ערכה IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	קופסת פלסטיק לביצוע ההתייבשות הפסיבית
מסנן MILLEX GS	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT ג'לים טרומיים 13.3 x 8.7 ס"מ (רוחב x אורך)	Bio-Rad		התייחסות בתפקוד ה-MW להפרדת
יחידת מיקוד איזואלקטרית IPGphor III	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix מערכת אלקטרופורזה גדולה	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 מ"מ	חברת ג'ל	P2D1.5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
O'Farrell, P. H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting