הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב

11.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51346

⸱

10 במרץ 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Microbiology, Joan C. Edwards School of Medicine, Marshall University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon ספן מיני himar1 ליצירת ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה למסך, לבודד ולזהות רגולטורים אלגינט רומן בPAO1 מתח Pseudomonas aeruginosa אב הטיפוס.

תקציר

Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק גראם שלילי, סביבתי עם יכולות מטבוליות צדדי. פ aeruginosa הוא פתוגן חיידקים אופורטוניסטי הקובע דלקות ריאה כרוניות בחולי סיסטיק פיברוזיס (CF). ייצור יתר של פוליסכריד קופסית נקרא אלגינט, הידוע גם mucoidy, מקדם את הקמתה של biofilms רירני שהם עמידים יותר מאשר תאי פלנקטון לכימותרפיה אנטיביוטיקה והגנה מארחת. בנוסף, ההמרה מnonmucoid לפנוטיפ רירני היא סמן קליני לתחילתה של דלקת כרונית בCF. ייצור יתר אלגינט על ידי פ ' aeruginosa הוא תהליך endergonic מיסי אנרגיה בתאים כבד. לכן, ייצור אלגינט מוסדר מאוד בפ aeruginosa. כדי להבין טוב יותר רגולציה אלגינט, אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis transposon מיני himar1 לזיהוי רגולטור אלגינט רומןים בPAO1 זן אב טיפוס. ההליך מורכב משני שלבים בסיסיים. ראשית, העברנו את transposon מיני himar1 (pFAC) מהמארח א coli SM10/λpir לנמען P. aeruginosa PAO1 באמצעות נטיית biparental ליצור ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה, אשר נבחרו על צלחות אגר בידוד Pseudomonas בתוספת gentamycin. שנית, אנו הוקרנו ובודדנו את מושבות רירני למפה אתר ההחדרה באמצעות PCR ההפוך באמצעות פריימרים DNA מצביעים החוצה מקלטת gentamycin ורצפי DNA. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו שני רגולטורים רומן אלגינט, mucE (PA4033) וkinB (PA5484), בPAO1 מתח עם mucA פראי מסוג קידוד הגורם אנטי סיגמא MucA לרגולטור אלגינט מאסטר AlgU (AlgT, σ 22) . פרוטוקול mutagenesis תפוקה גבוהה זה יכול להיות שונה לזיהוי גנים הקשורים לאלימות אחרים הגורם לשינוי בקולומורפולוגיה ניו יורק.

מבוא

היכולת של האופורטוניסטי, הפתוגן גראם השלילי Pseudomonas aeruginosa לoverproduce אלגינט היא גורם מרכזי ביכולתה להקים biofilm. ייצור יתר של אלגינט הוא הפנוטיפ המכונה לעתים קרובות כmucoidy. הבידוד של מושבות רירני מספוטה של אנשים לוקים בסיסטיק פיברוזיס (CF) הוא מעיד על זיהום כרוני, והיא קשור באופן ישיר עם ירידה כללית בבריאותו של החולה 1. נכון לעכשיו, הוא הבין כי הרגולציה וייצור של אלגינט בפ aeruginosa מתרחש בעיקר בשני operons. הראשון הוא אופרון biosynthetic אלגינט, המכיל 12 גנים (algD - alg8 - alg44 - algK - alge - algG - algX - algL - algI - algJ - algF - אצה) שאחראים לסינתזה והיצוא של פולימר אלגינט פני periplasm לenvironme תאיNT 2-5. אופרון השני הוא אשכול גנים החל עם גורם סיגמא האלטרנטיבי algU / T וממשיך בmucA, mucB, וmucD. AlgU / T הוא רגולטור חיובי, בעוד mucAB-D מסווגים כרגולטורים שליליים של ייצור אלגינט 6-8. בנוסף, רגולטורים תעתיק, כגון AlgB, AlgQ, AlgR, וRpoN, כמו גם לאחר תעתיק ושינוי שלאחר translational על ידי שליטת catabolite דיכוי, פעילות קינאז (KinB) וproteolysis intramembrane, יש גם הוכחו להיות מעורבים באלגינט הרגולציה 9-14.

וקטור transposon מיני himar1 המכונה pFAC נוצר במקור במעבדה של ד"ר Mekalanos בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד 15. פלסמיד pFAC מורכב מאלמנט transposable המוקף שתי חזרות הפוכות של 27 bps וקלטת gentamycin התנגדות באמצע (aacC1: 534 נ"ב), גן מקודד hyperactive transposase ספן 16, וβ-lactamase גן קידוד (בלה) (איור 1). מידע רצף עבור אלמנט transposable של pFAC זמין במספר הצטרפות GenBank: 13 DQ366300. בpFAC, יש אתר שיבוט מרובה (MCS) מאחורי גן aacC1 המשמש לזיהוי של אתר ההכנסה כרומוזומליות באמצעות PCR ההפוך. אחד יתרונות גדולים בשימוש בtransposon מיני himar1 אין גורמי מארח ספציפיים נדרשים לטרנספוזיציה (mutagenesis). בנוסף, יש שפע גבוה של החדרת אתרי dinucleotide ת"א נמצאים בכל הגנום של פ aeruginosa. לדוגמא, אתרי החדרת dinucleotide ת"א מתרחש 94,404 ו100,229 פעמים בPAO1 (6,264,404 bps, מספר הצטרפות GenBank NC_002516.2) וPA14 (6,537,648 bps; מספר גישת GenBank NC_008463) הגנום, בהתאמה. בגלל השפע של dinucleotide ת"א בגנום, מיני himar1 Transposon יכול לגרום לצפיפות גבוהה וmutagenesis האקראי, שהוא מתאים במיוחד לניתוח של גנים ארסיות והגנים שקבועים בתקנות. באופן תיאורטי, transposon מיני himar1 יכול להכניס לתוך כל גן חיוני בתוך הגנום של פ aeruginosa. זה מספק כ 18 אתרי החדרה ת"א לכל מסגרת קריאה פתוחה בגנום PAO1.

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon מיני himar1 לזהות רגולטורים רומן של mucoidy בפ aeruginosa. באופן ספציפי יותר, אנו biparentally מצומדת וקטור pFAC מכיל transposon מיני himar1 מE. coli SM10/λpir לPAO1 מתח prototrophic nonmucoid. לאחר transposon משולב בגנום, מתח הנמען הוא תרבית על אגר בידוד Pseudomonas טריקלוזן (PIA) המכיל אשר מעכב את הצמיחה של E. coli. לפיכך, ספרייה של מוטציות של פ ניתן לבחור aeruginosa על ידי הגידול בצלחת PIA בתוספת gentamycin ואת הנוכחות של פנוטיפ רירני. שים לב, לעומת מוטציה אינטגרציה בתיווך transposon יהיה אמיתי הפנוטיפ עמיד וcarbenicillin רגיש gentamycin. במחקר זה, כ -80,000 מוטציות החדרת PAO1 היו מבודדות באמצעות ארבעה פעלים נפרדים. אנחנו מכן הוקרנו מבודדים רירני, וקבענו את האתר של הכנסה על ידי עיכול אנזים הגבלה, קשירה והפוכה ה-PCR. ביצענו ניתוח כתם דרום באמצעות קלטת התנגדות gentamycin כמו בדיקה כדי לראות את המספר של החדרה לגנום. אנחנו קבענו כי יותר מ 90% ממוטציות שהושגו לנטיית שימוש בפרוטוקול זה היה עותק אחד בלבד של himar1 בגנום ומוצגים הפנוטיפ עמיד וcarbenicillin רגיש gentamycin. כולל של 32 מבודדים רירני זוהו, 22 שלהם מופו ללוקוסים של פ שונים aeruginosa PAO1כרומוזום. שיעור זה של הכנסה מספק כיסוי הולם לזהות כמה רגולטורים רומן של ייצור יתר אלגינט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנה של זני חיידקים וBiparental נטיה

  1. לחסן E. coli SM10/λpir/pFAC ב 5 מיליליטר של מרק לוריא (LB) בתוספת 15 מיקרוגרם / מיליליטר של gentamycin ומקום בחממה רועדת הלילה בשעה 37 ° C.
  2. לחסן פ PAO1 aeruginosa המתח ב 5 מיליליטר של LB, ומקום בחממה רועדת הלילה בשעה 42 ° C.
  3. מדוד OD 600 של תרבויות לילה ולערבב כמויות שווה של PAO1 וא coli pFAC כך שהנפח הסופי הוא בין 1-1.4 מיליליטר.
  4. תערובת צנטריפוגה ב 6,000 XG במשך 5 דקות.
  5. בינתיים, ייבוש צלחות LB לנטייה: להשאיר צלחות פתוחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  6. הסר את כל אבל 50 μl של supernatant מתערובת תא.
  7. Resuspend התא גלולה ב μl 50 הנותר של supernatant וטפטף על צלחת LB יבשה בטיפה אחת קומפקטית.
  8. למקם את הצלחת בזהירות במנדף לייבוש (impoהערה RTANT: אל תתנו לתאים משתרעים על פני הצלחת, זה יהיה להקטין באופן משמעותי את היעילות של נטיה).
  9. ברגע שרביב הוא יבש, להפוך את צלחת LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות.
  10. בעוד תערובת התא היא דוגרת, להכין צלחות פיא (150 OD x 15 מ"מ) גדולות עם 300 מיקרוגרם / מיליליטר של gentamycin. לפני השימוש, הסר את כל לחות שיורית על ידי הצבת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות.
  11. לאחר הדגירה של תערובת התא היא מלאה, לאסוף את התאים באמצעות לולאת חיסון סטרילי ובצינור microcentrifuge המכיל 1 מיליליטר LB ומערבולת, או פיפטה, לערבב ביסודיות.
  12. מורחים את התאים באופן שווה על גבי צלחות PIA הגדולות מכילות 300 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin. (חשוב: לצעד זה, עדיף להוסיף כמויות הולך וגדל של תערובת התאים להפריד צלחות (למשל פלייט 1: 10 μl, 2 פלייט: 50 μl, צלחת 3: 100 μl, צלחת 4: 500 μl, וכו ') .
  13. דגירה הלילה בשעה 37° C.

2. זיהוי ובידוד של מושבות רירני

  1. הסר את הצלחות מן החממה ולבחון למושבות רירני.
  2. לבודד מושבה רירני יחידה ופס לבידוד על צלחות קטנות (100 OD x 10 מ"מ) עם PIA ו300 / מיליליטר מיקרוגרם של gentamycin.
  3. דגירה הלילה בשעה 37 ° C.
  4. חזור על שלב 2.2 על תרבות הלילה הקודמת.
  5. חזור על שלבים 2.2-2.4 עוד פעמיים כדי לקבוע את היציבות של בודד רירני.
  6. לאחר שלב בודד סופי, לחסן 4.5 מיליליטר של LB עם מושבה רירני יחידה ודגירה שבייקרה לילה בשעה 37 ° C.
  7. למחרת, תווית 3 microcentrifuge צינורות עבור כל מוטציה רירני.
  8. הכן שני 1.25 aliquots מיליליטר של תרבות הלילה ל -2 צינורות להפקת DNA גנומי וזיהוי של אתר הכנסת transposon (ראה פרוטוקול 3).
  9. בנוסף, בארכיון בכל מוטציה רירני ידי pipetting 1 מיליליטר תרבות הלילה לתוך appropriatcryovial איליי שכותרת המכילה נפח שווה של 10% חלב דל שומן. חנות ב -86 ° C.

3. הגבלת gDNA עיכול וקשירה

  1. לחלץ gDNA ממוטצית רירני באמצעות כל שיטה מועדפת (לדוגמא. פנול, כלורופורם, טור ספין, וכו ').
  2. קבע את הריכוז של gDNA, לעכל כולל של 2 מיקרוגרם עם 1 μl של endonuclease ההגבלה סאלי, 0.5 μl של אלבומין בסרום שור, 5 μl של חיץ אנזים סאלי (100 mM NaCl, 50 מ"מ טריס-HCl, 10 מ"מ MgCl 2 , 1 מ"מ Dithiothrietol (DTT), pH 7.9 בטמפרטורת חדר), והנפח המתאים של DH 2 O להשיג בנפח כולל של 50 μl.
  3. לעכל דנ"א לילה בשעה 37 ° C. (חשוב:. בהתאם ליעילות של אנזים ההגבלה, ייתכן שיהיה צורך להוסיף μl 1 נוסף כדי לעכל הלילה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות זאת בנוסף לתקציר בלילה.)
  4. לטהר את DIGEה-DNA STED באמצעות כל שיטה מועדפת (לדוגמא טיהור agarose ג'ל, עמודות ספין) וelute עם 25 μl של חיץ.
  5. ולקשור את ה-DNA מתעכל על ידי ערבוב 11 μl של DNA מטוהר עם ריכוז המועדף על ~ 10-20 ng / μl, 1.5 μl של קשירת חוצץ (330 pH מ"מ טריס-אצטט 7.5, 660 אצטט mM אשלגן, מגנזיום 100 אצטט מ"מ, 5 מ"מ DTT), 1.5 μl של 100 מ"מ ATP ואנזים דנ"א μl 1.
  6. דגירה את התערובת ל15 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן להשבית את האנזים על ידי דוגרים ל15 דקות ב 70 ° C. (הערה: דוגרים את התערובת בטמפרטורת חדר למשך זמן ארוך יותר עשוי להגדיל את ההצלחה של קשירה).

4. PCR ההפוך (iPCR) ורצף ניתוח

  1. בצע iPCR על מוצר קשירה באמצעות הפעולות הבאות קדימה לאחור פריימרים וthermocycling תנאים:
    קדימה פריימר (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
    -ההפוך פריימר (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
    Thermocycler קונדיtions:
    1. C ° 94 דקות 1.
    2. C ° 94 דקות 1.
    3. C ° 58 למשך 2 דקות.
    4. C ° 72 למשך 2 דקות.
    5. C ° 72 במשך 8 דקות.
    6. אחיזת C ° 10.
    חזור על השלבים 2-4 ל34 מחזורים.
    (הערה: ניתן לאחסן מוצרי Amplified iPCR ב 4 ° C.)
  2. בצע ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה iPCR מוצלחת.
  3. לבצע רצף על מוצר iPCR באמצעות פריימרים Gm3OUT וGm5OUT. אתר ההכנסה ואת הכיוון של himar1 ממופים החוצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שמודגם באיור 1, וקטור transposon ספן מיני himar1, pFAC, מכיל שתי חזרות הפוכות 27 נ"ב עם אתרי החדרת ת"א איגוף קלטת התנגדות gentamycin aacC1, עם האמרגן שלה σ 70 תלוי, ואתר מרובה שיבוט (MCS). בנוסף, וקטור pFAC מכיל גנים המקודדים את transposase הפעיל מאוד himar1, β-lactamase (בלה), ואופרון העברת טרה. אתרי החדרת ת"א לאפשר אינטגרציה יעילה לתוך הגנום של פ זני aeruginosa. דיוק בזי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חשוב לציין כי בשיטה זו ניתן להשתמש במינים Pseudomonas אחרים עם השינויים הבאים: דגירה פ fluorescens ו פ putida ב30 מעלות צלזיוס, ופ stutzeri על 42 מעלות צלזיוס; פ stuzeri צריך להיות מתורבת על צלחות LB בתוספת 150 מיקרוגרם / מ"ל של gentamycin; על צעד 1.11, פ תאי stutzeri צריכים להיות מועברים לתוך 500 μl של LB במקום 1 מיליליטר. בנוסף, יש שני שלבים קריטיים לפרוטוקול זה. ראשית, מתח הנמען צריך להיות מתורבת בטמפרטורה המתא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר Hongwei ד יו הוא קצין המדע הראשי ומייסדים של Progenesis טכנולוגיות, LLC.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית לאווירונאוטיקה וחלל מנהל מערב וירג'יניה שטח גרנט Consortium (נאס"א WVSGC), קרן סיסטיק פיברוזיס (CFF-YU11G0) ו-NIH P20RR016477 וP20GM103434 לרשת רעיון המערב וירג'יניה ביו רפואית מצוינות מחקר. אנו מודים Vonya מ 'אייזינגר לסיוע הטכני בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Luria BrothDifco240230באמצעות Fisher Scientific
Pseudomonas בידוד אגרDifco292710באמצעות פישר סיינטיפיק
צלחות קטנות (100 OD x 10 מ"מ)פישר סיינטיפיק08-757-13
צלחות גדולות (150 OD x 15 מ"מ)פישר סיינטיפיק08-757-14
גליצרולפישר סיינטיפיקBP229-4
חממת טלטול ספסלניו ברונסוויק סיינטיפיקאינובה 4080שייק ב-200 סל"ד
חממת ארוןVWR1540
ספסל מיקרוצנטריפוגהסורוול75-003-287באמצעות פישר סיינטיפיק
SmartSpec Plus ספקטרופוטומטרBio-Rad170-2525או שיטה/ספק מועדף
לולאות חיסון חד פעמיותפישר סיינטיפיק22-363-597
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהפישר סיינטיפיק05-408-129
2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגנייםקורנינג430659באמצעות פישר סיינטיפיק
15 מ"ל שפופרותפישר סיינטיפיק05-539-12
חלב רזהדיפקוDF0032-17-3באמצעות פישר סיינטיפיק
DNeasy דם ורקמות (250) Qiagen69506או שיטה מועדפת/ספק
QIAquick PCR Purification Kit (250)Qiagen28106או שיטה מועדפת/ספק
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) Qiagen27106או שיטה מועדפת/ספק
FastLink II ערכת קשירת DNAEpicentre TechnologiesLK6201Hבאמצעות Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath LabnetNC0205808באמצעות Fisher Scientific
Sal1, הגבלה אנדונוקלאזניו אינגלנד BioLabsR0138L
EasyStart Micro 50Molecular BioProducts6020באמצעות Fisher Scientific
Taq DNA PolymeraseNew England BioLabsM0267L
iCycler, ThermocyclerBio-Rad170-8740
LE agaroseGenemate3120-500באמצעות Fisher Scientific
Gentamycin SulfateFisher ScientificBP918-1
2.0 מ"ל בקבוקונים קריוגנייםCorning430659באמצעות Fisher Scientific

מקורות

  1. Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
  2. Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
  3. Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
  4. Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
  5. Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
  6. Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
  7. Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
  8. Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
  9. Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
  10. Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
  11. Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
  12. Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
  13. Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
  14. Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
  15. Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
  16. Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Mini himar1PCRDNA
זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.