Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים

Summary

כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.

Abstract

קליפת המוח מאופיין במספר רב של שכבות והרבה תאים מסוגים שונים שיחד כרשת אחראים להרבה תפקודים קוגניטיביים גבוהים יותר כולל קבלת החלטות, התנהגות מודרכת חושית או זיכרון. כדי להבין כיצד רשתות עצביות סבוכות כזה לבצע משימות כאלה, בצעד מכריע הוא לקבוע את הפונקציה (או פעילות חשמלית) של סוגי תאים בודדים בתוך הרשת, מעדיף כאשר החיה היא ביצוע משימה קוגניטיבית רלוונטית. בנוסף, הוא חשוב באותה מידה כדי לקבוע את המבנה האנטומי של הרשת והארכיטקטורה מורפולוגי של נוירונים הבודדים כדי לאפשר להנדסה הפוכה הרשת בקליפת המוח. פריצות דרך טכניות הזמינים כיום מאפשרות הקלטת פעילות סלולרית בערים, מתנהגת בעלי חיים עם האפשרות היקר של פוסט הוק זיהוי נוירונים המוקלטים. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג biocytin juxtasomal, הכוללת potenti פעולת הקלטהאל יוצרות עלייה חד בתצורה (-התיקון רופף או) תאי באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית. תצורת הקלטת juxtasomal היא יציבה יחסית והחלים על פני תנאים התנהגותיים, הכולל הרדמה, תרופות הרגעה, קבוע בראש, ואפילו בערים בעלי החיים לנוע בחופשיות. לכן, שיטה זו מאפשרת קישור spiking פוטנציאל פעולת תאים מסוג מסוים בהתנהגות בעלי חיים לשחזור של נוירונים הבודדים וסופו של דבר, microcircuit קליפת המוח כולו. בכתב יד הסרטון הזה, אנו מראים כיצד יכולים להיות מתויגים נוירונים בודדים בתצורת juxtasomal עם biocytin בעכברים מורדם urethane לפוסט הוק זיהוי ושחזור מורפולוגיים.

Introduction

רשתות עצביות מורכבות של סוגי תאים מרובים, מאופיינים בתכונות מורפולוגיות ופיזיולוגיות מאוד ספציפיות ^1-7. כתוצאה מכך, סוגי תאים בודדים לבצע משימות מיוחדות בתוך הרשת (ראה למשל Gentet et al. ⁸ וBurgalossi et al. ^9). אנחנו רק מתחילים להבין פונקציות ספציפיות לסוג תא ברשתות עצביות ועוד ועדיין לא התגלה. לשם כך, במעבדות רבות ביישום גישות ניסיוניות המאפשרות הניתוח של מאפיינים צורניים של אותה האוכלוסייה העצבית שממנו הפרמטרים פיסיולוגיים התקבלו ^1,10-15. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג juxtasomal ^16,17 הכוללת קלטות אלקטרו באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית בתצורה תאית (ובכך פולשני) בשילוב עם electroporation של נוירון שהוקלט עם biocytin.יתרון עיקרי של גישה זו הוא שהטבע לא פולשנית מבטיח כי spiking פוטנציאל פעולה של נוירונים בודדים נרשם מבלי לשנות (למשל dialyzing) התוכן תאיים של התא. ואחריו electroporation, גישת juxtasomal מספקת את האפשרות של הודעה זיהוי תא הוק ושחזור לקשר תפקוד (פיזיולוגיה) למבנה (מורפולוגיה). בדרך כלל, שיקום מורפולוגיים כרוך שחזור של מורפולוגיה הדנדריטים ואקסון אשר יכול להתארך לכימות של צפיפות עמוד השדרה ו / או בוטון או אפילו שחזור של מורפולוגיה עצבית ברזולוציה ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקת הקלטת juxtasomal יכולה לשמש לin vivo הקלטות של תאים מסוגים שונים על פני שכבות בקליפת המוח או באזורים תת קליפת המוח במגוון של מינים, למרות שרוב המחקרים ליישם את הטכניקה במכרסמים קטנים כגון עכברים או חולדות. בהקלטת ותיוג נוירונים המחקר שלנו מתמקדמקליפה החושית העיקרית עכברוש (S1) וכרוך בזיהוי חזותי של נוירונים נרשמו ^18, שחזורים דנדריטים בשילוב עם רישום מדויק במסגרת התייחסות אחידה ללהנדס לאחור רשתות קליפת המוח ^4,19 ושחזור מפורט של אדריכלות אקסון לאפיין סוג התא ספציפי מקומי ותחזית לטווח ארוך מטרות ^20.

בהשוואה לin vivo טכניקות חלופיות הקלטה (תאית או כל תא), הקלטות juxtasomal הן יציבים יחסית, ולכן יכולות להיות מיושמות על פני מדינות התנהגותיות כוללים ^21,22 מורדם, מסוממת ^14, בעלי חיים ²³ אפילו באופן חופשי הנעים קבוע בראש, או ער ⁹ . כאן, אנו מציגים תיוג juxtasomal בS1 של עכברוש הרדים urethane, אם כי אנו מדגישים את תחולתה הכללית של טכניקה זו כדי הכנות רבות של בחירה.

Protocol

1. הכנת בעלי החיים

כל הליכי הניסוי מתבצעים בהתאם לחוק ההולנדי ולאחר הערכה על ידי ועדה אתית מקומית באוניברסיטת VU אוניברסיטת אמסטרדם, הולנד.

1. הרדימי עכברוש Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) עם isoflurane (2-3% בחמצן) ולאחר מכן עם urethane (20% ב0.9% NaCl, 1.6-1.7 גר '/ קילוגרם) על ידי זריקת intraperitoneal. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ניטור נסיגת קמצוץ, רפלקסים עפעף, ותנועות vibrissae.
2. לנהל מנה נוספת של urethane (10% ממינון ראשוני) במקרה של בעלי החיים לא מגיעים לעומק הרדמה מספיק או בכל פעם שפרכוסי vibrissae הם נצפו במהלך הניסוי.
3. מניחים את החיה מורדמת במסגרת stereotaxic מצוידת בכרית חימום, הכנס בדיקה טמפרטורה רקטלית ולשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס על ידי כרית חימום.
4. מקם את ראשו של בעל החיים במסגרת stereotaxic; לקצץ את השיער בחלק העליון של הראש באמצעות מספריים כדי להבהיר את העור גלוי.
5. הזרק 100 ידוקאין μl 1% (ב0.9% NaCl) תת עורי להרדמה מקומית באתר המבצע ולהמתין 3-5 דקות. הסר את העור המכסה את פני השטח של הגולגולת על ידי חיתוך בכיוון הזנב למקורי ולנקות את הרקמה שנותרה.
6. נקה את הגולגולת באופן נרחב עם 0.9% NaCl ומטליות סופגים.
7. לקבוע את הקואורדינטות של היעד באזור באונה השמאלית (לקליפת המוח העיקרי החושית (S1): 2.5 מ"מ האחורי ו5.5 מ"מ לרוחב גבחת). סמן את המיקום על הגולגולת עם עט סמן עור כירורגית.
8. לגרד את העצם בעדינות על ידי מקדח שיניים מהאזור של עניין עד העצם הופך שקוף וכלי דם הם נראים בבירור.
9. הפוך craniotomy x 0.5 מ"מ 0.5 מ"מ על ידי חיתוך חלון בגולגולת דליל עם אזמל (# 11), הימנעות מהפגיעה במאטר הדורהוכלי דם. אופציונאלי: לסמן את הקצוות של פתיחת הגולגולת באמצעות עט סמן עור כירורגית כדי לשפר את הנראות.
10. למרוח שכבה דקה של דבק מגע בגולגולת היבשה ולאחר מכן מלט שיניים לבנות אמבטיה (כלומר תא הקלטת) התוחמת את פתיחת הגולגולת.
11. חתוך את השפם בצד הנגדי ל5 מ"מ בדיוק מזקיק השערה. אופציונאלי: להדגיש את השפם הגזוז עם מסקרה השחור.

2. Juxtasomal הקלטות וסימון Biocytin

1. הפוך טפטפות תיקון זכוכית ורוסיליקט עם קוטר קצה פנימי של 1 ~ מיקרומטר להשיג אלקטרודות עם 3-5 התנגדות MΩ. הערה: מורפולוגיה פיפטה האידיאלית להקלטת juxtasomal היא להתחדד הדרגתי דק, זווית קונוס נמוכה, ו~ 1 מיקרומטר קצה (איור 1).
2. תלוי בעומק ההקלטה (לגבי שטח pial), הממדים להתחדד של האלקטרודה ההקלטה צריכים להיות מותאמים. חשוב באופן קריטי הוא לא כיהוא להתחדד קוטר צריך להיות פחות מ 75 מיקרומטר בנקודת הכניסה במוח כדי למנוע נזק או לחץ מכאניים לאזור ההקלטה. זה מצביע על כך להקלטות בקליפת המוח שטחיות, להתחדד של 300-500 מיקרומטר עם קוטר חיצוני של מקסימאלי 75 מיקרומטר נדרש (איור 1 א) ואילו הקלטות משכבות בקליפת המוח עמוקות יחסית דורשות להתחדד ארוך יותר של 1,500-1,800 מיקרומטר, שוב עם חיצוני מקסימאלי קוטר של 75 מיקרומטר (ב1,800 מיקרומטר מהקצה האלקטרודה).
3. טען את פיפטה התיקון עם צלצול עכברים נורמלי (NRR) בתוספת biocytin 2% (ראה טבלת מס '1 לפתרונות וחומרים כימיים) והר פיפטה את התיקון על במה ראש הקבוע לmicromanipulator.
4. להגדיר את הזווית של בעל אלקטרודה ל34 ° ביחס למישור הסגיטלי למקד את עמודת D2 של S1 העכברוש באופן ספציפי.
5. חבר את שלב הראש למגבר בגשר במצב (כלומר, מהדק הנוכחי).
6. מקם את התיקוןפיפטה בסמיכות לפתיחת הגולגולת. מלא את האמבטיה עם 0.9% NaCl ולקבוע את ההתנגדות האלקטרודה שאמורה להיות בין 3-5 MΩ, שהוערך על ידי החלת דופק מרובע עם הזרקה נוכחית חיובית (Na 1, 200 msec / כיבוי).
7. להקים overpressure של 100-150 mbar ולקדם את פיפטה את התיקון ב1 מיקרומטר צעדים תוך יישום הנוכחי חיובי כמו פולסים מרובעים (Na 1, 200 msec / כיבוי). לפקח על שינוי ההתנגדות החזקה על הקמת קשר עם מאטר הדורה. בשלב זה, לקבוע את הקואורדינטות של micromanipulator 'אפס' כדי לאפשר עומק מדידות מדויקות.
8. להתקדם בצעד 1 במצב מיקרומטר עד פיפטה את התיקון חודרת מאטר הדורה שצוינה על ידי ירידה פתאומית בהתנגדות האלקטרודה. הסר את הלחץ החזק של טפטפת.
9. לחפש את יחידות בודדות, תוך קידום ב1 מיקרומטר צעדים. לפקח על התנגדות האלקטרודה ברציפות על ידי יישום 200 msec / כיבוי קטניות. עלייה בtypic התנגדות האלקטרודהברית מצביעה על קרבתו של נוירון בודד. לקדם את האלקטרודה עד פוטנציאל פעולה חיובית (AP) צורות גל של ~ 2 mV נרשמים (2A דמויות ו2B).
10. אופציונאלי: הקלט את דפוס spiking הספונטני של תא העצב ולקבוע להתחדד על ידי, למשל, caudally להסיט שפם פרטני ל200 אלפית שניים בזווית של ° 3.3 באמצעות מכשיר פיזואלקטריים ¹⁸ עורר זיף.
11. לקדם את האלקטרודה עד ההתנגדות היא 25-35 MΩ ויש לי קוצים אמפליטודות של 3-8 mV להשיג תנאים אופטימליים של מילוי juxtasomal. התחל מילוי juxtasomal ידי החלת פולסים מרובעים של חיובי הנוכחי (Na 1, 200 msec / כיבוי). להגדיל לאט ובהדרגה הנוכחית על ידי צעדים של 0.1 Na תוך ניטור צורת גל AP ותדירות (2A דמויות ו2B).
12. לפקח על פתיחת הקרום כעלייה ברורה בתדירות AP במהלך השלב על דופק הבלוק (איור 2C ). גל העלייה החדה במהלך מילוי תערוכות רוחב גדל ו( 2C דמויות ו2D) מופחתים לאחר hyperpolarization. פרמטרים נוספים כוללים רעש מוגבר או שינוי DC שלילי קטן (1-5 mV).
13. להגדיל או להקטין את הזרם (1 Na) בעת המילוי לשמור על עירוי biocytin יציב. להפחית או להפסיק את הפעימות הנוכחיות על עלייה פתאומית של תדירות AP, כדי למנוע הרעלה על ידי זרם עודף של יונים תאיים, כגון יוני נתרן. הערה: כל נוירון יגיב בצורה שונה להזרקה הנוכחית וjuxtasomal פרמטרים תיוג צריכים להיות מותאמים בהתאם לתנאי הקלטה בודדים.
14. לעקוב מקרוב אחר האות לאחר הפסקת ההזרקה הנוכחית. גל העלייה החדה לאחר פגישת מילוי בדרך כלל הרחיב ומראה מופחתים מאוד לאחר hyperpolarization. לחכות להתאוששות של העצב, שהוא לכאורה כאשר גל ספייק חוזר למאפייניו המקוריים (כלומר נוכחות שלנורמלי, איור לאחר hyperpolarization 2).
15. חזור biocytin מילוי מפגשים לאחר התאוששות של הנוירון מלא כדי להגדיל את עומס biocytin לאיכות צביעה משופרת.
16. לחזור בי פיפטה את התיקון בצעדים של 1 מיקרומטר עד משרעת ספייק יורד כדי להפחית את כל לחץ מכאני לתא. לחכות שעה לפחות 1 לbiocytin לנטרל intracellularly תוך מעקב הדוק על טמפרטורת הגוף של החיה ונושמת.

3. מרוסס בעלי החיים והסרת המוח

1. הכן את התקנת זלוף, לשטוף, ולטעון מראש צינורות עם 0.9% NaCl.
2. מקם את החיה על מגש כירורגית ובטוח עם קלטת תיוג סטנדרטית. ודא עומק מספק של ההרדמה; קמצוץ רגל ורפלקסים עפעף צריך להיות נעדרים.
3. הפוך המדיאלי לרוחב חתך (5-6 סנטימטר) בדופן הבטן מתחת לצלעות ולהמשיך בכיוון אחורי-קדמי על מנת לחשוף את עצם החזה.משוך את עצם החזה anteriorly ולהפריד בזהירות את הכבד מהסרעפת.
4. לעשות חתך קטן בסרעפת, לחתוך דרך הצלעות התחתונות ולהמשיך את החתך לאורך כל אורכו של חלל הבטן כדי לחשוף את הלב.
5. הסר את קרום הלב.
6. הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ועושה חתך בעלייה הימנית. תנקב עם 0.9% NaCl (~ 8 מיליליטר / דקה) עד הדהייה של הכבד היא מוחלטת.
7. לעבור העירוי לparaformaldehyde 4% (PFA) עד נוקשות של כפה קדמית ולסת תחתונה היא נראית לעין.
8. לערוף את העכברוש באמצעות מספריים
9. הסר את שרירי צוואר שנותרו ולחשוף את הגולגולת לחלוטין.
10. מקם את המספריים בגזע המוח בצד הגבי ולחתוך את העצם בזהירות לאורך תפר sagittal, שמירה על מיקום הגב.
11. הסר את העצמות משני צידי תפר sagittal לחשוף את המוח באמצעות מלקחיים. מוציא בזהירות את הדורה כדי למנוע דamage.
12. בזהירות להכניס מרית קהה לצד הגחוני של המוח ולהסיר את המוח בעדינות.
13. פוסט לתקן את כל לילה המוח בPFA ב 4 ° C. לעבור למוח 0.05 M חיץ פוספט (PB) ולאחסן ב 4 ° C.

4. חותך את המוח בסעיפי משיק

1. קח את המוח של 0.05 M PB ולשים אותו על נייר סינון מול קדמי. השתמש בסכין גילוח חד לחתוך את המוח הקטן לאורך מטוס העטרה ולהפריד את האונות על ידי חיתוך לאורך המישור הסגיטלי האמצע.
2. החל דבק מגע על פלטפורמת ההרכבה ולעלות את ההמיספרה השמאלית במישור הסגיטלי שלה עם קדמי פונה ימינה. אבטח את פלטפורמת ההרכבה בזווית של ° 45 על vibratome ולהטביע את המוח ב0.05 M PB.
3. Secure סכין גילוח על vibratome ולוודא כי המגע הראשון עם משטח המוח הוא באמצע המטוס הקדמי, אחורי של האונה. חותכים 24 100 מיקרומטרחלקים ולאסוף אותם בצלחת 24 גם מכילה 0.05 M PB.

5. נהלים היסטולוגית

1. בצע פרוטוקולים היסטולוגית לצביעת ציטוכרום אוקסידאז ²⁴ ו- ביוטין-peroxidase avidin השיטה על פי שיטות שתוארו קודם לכן ^25. אופציונאלי: לדמיין biocytin באמצעות conjugates avidin הניאון / streptavidin-Alexa. זה בנוסף מאפשר כפול מכתים עם טכניקות מעקב מדרדר או אנטרוגרדית.
2. חלקים לשטוף דקות 5 X 5 עם 0.05 M PB ולהכין tetrahydrochloride 3,-3'-diaminobenzidine (DAB) המכיל פתרון לצביעת ציטוכרום אוקסידאז לדמיין חביות בשכבה 4 (L4) של S1 (ראה טבלה 2 לפתרונות ו ריאגנטים). דגירה סעיפי 6-12 מפיא בפתרון שחומם מראש למשך 30-45 דקות ב37 ° C.
3. יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל6 x 5 דקות ולהרוות את פעילות peroxidase אנדוגני על ידי דוגרים כל הסעיפים ב3% H ₂ O ₂ ב0.05 M PB ל20 דקות בטמפרטורת חדר (RT).
4. יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות. דגירה סעיפים בABC-פתרון (ראה טבלה 3 עבור פתרונות וחומרים כימיים) הלילה ב 4 ° C.
5. יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות ולהכין DAB-הפתרון כדי להמחיש את הנוירון מלא biocytin (ראה טבלה 4 לפתרונות וחומרים כימיים). דגירה סעיפים בפתרון מסונן ל45-60 דקות ב RT.
6. יש לשטוף את החלקים עם 0.05 M PB ל5 x 10 דקות. חלקי הר בשקופיות מיקרוסקופ ולהחליק לכסות עם Mowiol (ראה טבלה 5 לפתרונות וחומרים כימיים).
7. לקבוע את איכות תיוג באמצעות מיקרוסקופ אור.

Results

ידע מפורט על מבנה 3D של נוירונים בודדים הוא חיוני להבהרת עקרונות ארגוניים של רשתות עצביות. השיטה שלנו כרוכה בצינור כדי להשיג תיוג biocytin באיכות גבוהה מהכנת in vivo, ובכך לאפשר סיווג post hoc עצבי ושחזור מפורט של הדנדריטים ואדריכלות אקסון של נוירונים בודדים ברזולוציה גבוהה. תלוי באיכות של תיוג juxtasomal, הנוירונים הם התאוששו עם DAB-עוצמות שונות הנעות בין קלוש לאותות DAB אינטנסיביים בעמדות שמאוד מדויק מתאימות למיקום ההקלטה ^19.26. במעבדה שלנו, הנסיין מ...

Discussion

שיטת juxtasomal מאפשרת הקלטה בspiking פוטנציאל פעולת vivo מיחידות בודדות על פני תנאים התנהגותיים (בהרדמה, ער או באופן חופשי לנוע קבוע בראש) עם האפשרות של נוירון שנרשם לפוסט סיווג סוג תא הוק ו / או שחזור 3D תיוג-biocytin. היתרון העיקרי הוא להשיג פרמטרים פיסיולוגיים בתצורה תאית (ובכך לא פולשנית), ובכל זאת להיות מסוגלת לתייג נוירון intracellularly עם biocytin ^16,17,32. בנוסף לbiocytin תיוג, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי להזריק נוירונים עם ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מערכת בקרה SM-6	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 מגבר	Neuralynx
Axoclamp-2B Axon	Instruments
Osada דגם EXL-M40	Osada, Inc.
מכשיר פיזואלקטרי	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, אוסטין, טקסס, ארה"ב		תוכנת רכישה LabView
Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, אוניברסיטת קולומביה, ניו יורק
ספוגיות Sugi	Kettenbach	30601
ציטוכרום C מלב סוסים	Sigma	C2506
קטלאז מכבד בקר	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain סטנדרטי ABC-kit	וקטור	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Urethane	Sigma	U2500
Isoflurane	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaine	Sigma	L5647
סימפלקס צמנט שיניים מהיר	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocytin	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
בסיס Trizma	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
גליצרול בדרגה אנליטית	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	fluka	63072