כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
קליפת המוח מאופיין במספר רב של שכבות והרבה תאים מסוגים שונים שיחד כרשת אחראים להרבה תפקודים קוגניטיביים גבוהים יותר כולל קבלת החלטות, התנהגות מודרכת חושית או זיכרון. כדי להבין כיצד רשתות עצביות סבוכות כזה לבצע משימות כאלה, בצעד מכריע הוא לקבוע את הפונקציה (או פעילות חשמלית) של סוגי תאים בודדים בתוך הרשת, מעדיף כאשר החיה היא ביצוע משימה קוגניטיבית רלוונטית. בנוסף, הוא חשוב באותה מידה כדי לקבוע את המבנה האנטומי של הרשת והארכיטקטורה מורפולוגי של נוירונים הבודדים כדי לאפשר להנדסה הפוכה הרשת בקליפת המוח. פריצות דרך טכניות הזמינים כיום מאפשרות הקלטת פעילות סלולרית בערים, מתנהגת בעלי חיים עם האפשרות היקר של פוסט הוק זיהוי נוירונים המוקלטים. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג biocytin juxtasomal, הכוללת potenti פעולת הקלטהאל יוצרות עלייה חד בתצורה (-התיקון רופף או) תאי באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית. תצורת הקלטת juxtasomal היא יציבה יחסית והחלים על פני תנאים התנהגותיים, הכולל הרדמה, תרופות הרגעה, קבוע בראש, ואפילו בערים בעלי החיים לנוע בחופשיות. לכן, שיטה זו מאפשרת קישור spiking פוטנציאל פעולת תאים מסוג מסוים בהתנהגות בעלי חיים לשחזור של נוירונים הבודדים וסופו של דבר, microcircuit קליפת המוח כולו. בכתב יד הסרטון הזה, אנו מראים כיצד יכולים להיות מתויגים נוירונים בודדים בתצורת juxtasomal עם biocytin בעכברים מורדם urethane לפוסט הוק זיהוי ושחזור מורפולוגיים.
מבוא
רשתות עצביות מורכבות של סוגי תאים מרובים, מאופיינים בתכונות מורפולוגיות ופיזיולוגיות מאוד ספציפיות 1-7. כתוצאה מכך, סוגי תאים בודדים לבצע משימות מיוחדות בתוך הרשת (ראה למשל Gentet et al. 8 וBurgalossi et al. 9). אנחנו רק מתחילים להבין פונקציות ספציפיות לסוג תא ברשתות עצביות ועוד ועדיין לא התגלה. לשם כך, במעבדות רבות ביישום גישות ניסיוניות המאפשרות הניתוח של מאפיינים צורניים של אותה האוכלוסייה העצבית שממנו הפרמטרים פיסיולוגיים התקבלו 1,10-15. הנה, אנחנו מדגימים את טכניקת תיוג juxtasomal 16,17 הכוללת קלטות אלקטרו באמצעות טפטפות תיקון קונבנציונלית בתצורה תאית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת בעלי החיים
כל הליכי הניסוי מתבצעים בהתאם לחוק ההולנדי ולאחר הערכה על ידי ועדה אתית מקומית באוניברסיטת VU אוניברסיטת אמסטרדם, הולנד.
- הרדימי עכברוש Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) עם isoflurane (2-3% בחמצן) ולאחר מכן עם urethane (20% ב0.9% NaCl, 1.6-1.7 גר '/ קילוגרם) על ידי זריקת intraperitoneal. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ניטור נסיגת קמצוץ, רפלקסים עפעף, ותנועות vibrissae.
- לנהל מנה נוספת של urethane (10% ממינון ראשו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ידע מפורט על מבנה 3D של נוירונים בודדים הוא חיוני להבהרת עקרונות ארגוניים של רשתות עצביות. השיטה שלנו כרוכה בצינור כדי להשיג תיוג biocytin באיכות גבוהה מהכנת in vivo, ובכך לאפשר סיווג post hoc עצבי ושחזור מפורט של הדנדריטים ואדריכלות אקסון של נוירונים בודדים ברזולוציה גבוהה. תלוי באיכות של תיוג juxtasomal, הנוירונים הם התאוששו עם DAB-עוצמות שונות הנעות בין קלוש לאותות DAB אינטנסיביים בעמדות שמאוד מדויק מתאימות למיקום ההקלטה 19.26. במעבדה שלנו, הנסיין מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת juxtasomal מאפשרת הקלטה בspiking פוטנציאל פעולת vivo מיחידות בודדות על פני תנאים התנהגותיים (בהרדמה, ער או באופן חופשי לנוע קבוע בראש) עם האפשרות של נוירון שנרשם לפוסט סיווג סוג תא הוק ו / או שחזור 3D תיוג-biocytin. היתרון העיקרי הוא להשיג פרמטרים פיסיולוגיים בתצורה תאית (ובכך לא פולשנית), ובכל זאת להיות מסוגלת לתייג נוירון intracellularly עם biocytin 16,17,32. בנוסף לbiocytin תיוג, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי להזריק נוירונים עם .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לי authros אין לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לפרופ. Huibert Mansvelder וברט Sakmann לתמיכה נרחבת, ד"ר מרסל Oberlaender לדיונים פוריים ומתן מעקב עצבי, וברנדן Lodder לקבלת סיוע טכני. הנתונים נרכשו באמצעות ntrode השישי לLabView, סיפק בנדיבות על ידי ר 'ברונו (קולומביה Univ., ניו יורק, ארה"ב). מחקר זה נתמך על ידי אגודת מקס פלאנק והמרכז ברנשטיין לחישובית Neuroscience, טובינגן (ממומן על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), מרכז לNeurogenomics ומחקר קוגניטיבי (CNCR) , מדעי המוח הקמפוס אמסטרדם (NCA), מימון לCPJdK (NWO-alw # 822.02.013 ו# p3-C3 ENC-רשת) וVU באוניברסיטת אמסטרדם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מערכת בקרה SM-6 | Luigs Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 מגבר | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B Axon | Instruments | ||
| Osada דגם EXL-M40 | Osada, Inc. | ||
| מכשיר פיזואלקטרי | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| LabView | National Instruments, אוסטין, טקסס, ארה"ב | תוכנת רכישה LabView | |
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, אוניברסיטת קולומביה, ניו יורק | ||
| ספוגיות Sugi | Kettenbach | 30601 | |
| ציטוכרום C מלב סוסים | Sigma | C2506 | |
| קטלאז מכבד בקר | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain סטנדרטי ABC-kit | וקטור | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| סימפלקס צמנט שיניים מהיר | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| בסיס Trizma | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| גליצרול בדרגה אנליטית | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | fluka | 63072 |
מקורות
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
