הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

סיכום

כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים המסומנים בפלורסנט בתוך רקמות גדולות, באופן אידיאלי, יש לדמות את הדגימות הביולוגיות ללא חתך. 3DISCO הוא הליך ניקוי רקמות פשוט המבוסס על דגירה רציפה עם ממיסים אורגניים. עם הניקוי, האיברים הופכים שקופים ומאפשרים סריקת לייזר מקצה לקצה של הדגימה.

תקציר

ניקוי רקמות והדמיה לאחר מכן של איברים שקופים היא שיטה רבת עוצמה לניתוח תאים ומולקולות עם תווית פלואורסצנטית בתלת מימד, באיברים שלמים. בניגוד לשיטות היסטולוגיות מסורתיות, שבהן הרקמה המעניינת נחתכת להדמיה פלואורסצנטית, הדמיה תלת מימדית של רקמה מנוקה מאפשרת בחינה של תאים ומולקולות מסומנים בדגימה כולה. לשם כך, יש להפוך רקמות אטומות אופטית לשקופות על ידי התאמת המדדים העקשניים בכל הרקמה. לאחר מכן, ניתן לדמות את הרקמה בבת אחת באמצעות מיקרוסקופים סורקי לייזר כדי לקבל תמונה תלת מימדית מלאה ברזולוציה גבוהה של הדגימה. רשימה הולכת וגדלה של פרוטוקולים לניקוי רקמות כולל 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2 ו-SeeDB מספקים דרכים חדשות לחוקרים לדמות את הרקמה המעניינת שלהם בכללותה. ביניהם, 3DISCO היא שיטה הניתנת לשחזור ופשוטה ביותר, שיכולה לנקות סוגים שונים של רקמות וניתן להשתמש בה בטכניקות מיקרוסקופיה שונות. פרוטוקול זה מתאר הליך פשוט זה ומציג את יישומיו השונים. כמו כן, הוא דן במגבלות ובקשיים האפשריים וכיצד להתגבר עליהם.

מבוא

הבדיקה היסטולוגית של רקמות ביולוגיות היא גישה בסיסית בהבנת טבעו של מולקולות / תאים בהקשר הטבעי שלהם. באופן אידיאלי, הדמיה ברזולוציה גבוהה של כל האיבר היא אינפורמטיבי ורצוי ביותר. מכיוון שהאור יש לו עומק חדירה מוגבל, בשל פיזור ^1, איברים קבועים צריכים להיות מחולקים על מנת לבצע הדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה. לפיכך, רוב מחקרי היסטולוגיה מבוצעים על סעיפי רקמות כמה שמייצגים רק חלק קטן מהאיבר. בחלק מהמחקרים, למשל, אלה במטרה לאתר את קשרים עצביים במוח או בחוט השדרה, כל חלקי הרקמות מאברי המטרה נאספים וצלמו לשחזור 3D. עם זאת, יש חתך רקמות וההדמיה הבאה של קטעים בודדים מגבלות שונות. אלה כוללים זמן להיות רב ומובילים לשחזור 3D לא מושלם של הרקמה, עקב עיוותים מכאניות וקשהies ביישור של התמונות שהתקבלו.

לאחרונה, איברים שקופים ללא פגע סליקה וההדמיה פותחו כפתרון משמעותי לזה חסרון ^2,3. עם הקרחת, כל האיבר הוא שניתנו שקוף המאפשרים את אור ההדמיה לנסוע מקצה לקצה (איור 1) כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של איבר unsectioned באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר כגון מיקרוסקופ או פוטון אור גיליון רב ( איור 2). קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולי סליקת רקמה חדשים כדי להיות מסוגל תמונת רקמת עניין שלהם למטרות שונות. אלה כוללים ממס אורגני ^{2-5, 6,7} המים ואלקטרופורזה ⁸ פרוטוקולי סליקה מבוסס. ביניהם, הדמיה 3 ממדים של ממס פינתה איברים או 3DISCO הוא פרוטוקול ישים בקלות על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל מערכת עצבים מרכזית איברים (CNS), איברים חיסוניים וגידולים מוצקים. בadditיון, ניתן לשלב אותו עם שיטות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופ אור גיליון הקרינה (LSFM), פוטון רב ומיקרוסקופי סריקת לייזר confocal. 3DISCO מבוסס על ניקוי עם חומרים כימיים זמינים ולא יקרים כגון tetrahydrofuran (THF) ואתר dibenzyl (DBE) ^4. כל הפרוטוקול יכול לקחת קצר ככל 3-4 שעות. לפיכך, 3DISCO היא טכניקה חזקה ומהירה בהשוואה לשיטות מסורתיות היסטולוגית שעשויים להימשך שבועות עד חודשים כדי להשלים ^9.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות IACUC (הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש) על עכברים ~ ישנים 3-5 חודשים. המחבר מצהיר שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

1. בעלי החיים זלוף והכנת רקמה

עיתוי: 30-60 דקות לכל עכבר + לפרסם קיבעון-(כמה שעות עד לילה).

1. לשקול את בעלי החיים ולהרדים באמצעות קטמין (80-200 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (7-20 מ"ג / קילוגרם) או Avertin 2.5% (0.5 משקל גוף ml/25 g-IP).
2. המתן מספר דקות להרדמה ייכנס לתוקף מלא.
3. לצבוט את הבוהן והזנב של בעלי החיים על מנת לוודא כי בעל החיים הוא בהרדמה מלאה.
4. Perfuse החיה הראשון ב RT עם 0.1 M פוספט חוצץ (PB) או 0.1 M פוספט הצפת מלוח (PBS) עבור 5-10 דקות עד הדם נמחק לחלוטין מהרקמות.
5. לעבור זלוף לפתרון מקבע: PFA 4% ב 0.1 M PB (או 0.1 M PBS) ולהמשיך זלוףעם PFA 4% עבור 30-40 דק 'במהירות של 3 מיליליטר / דקה.
6. לנתח את האיבר / s של עניין בזהירות מבלי לפגוע, למשל, להימנע מניקוב ולסחוט את הרקמות שנמצא בגזורה.
7. הסר את הרקמה נוספת המקיפה את האיברים (רקמת חיבור, קרומי המוח או עניין הדורה) בצלחת פטרי מלאה PBS.
8. פוסט לתקן את האיברים PFA 4% במשך כמה שעות או הלילה ב 4 º C. הימנע הודעה קיבעון ארוך בגלל PFA עלול להרוות את האות או להגדיל את שעות נוספות autofluorecense ¹⁰ במיוחד עבור ערוץ ה-GFP (אשר מהווה בעיה פחותה בערוצים אדומים אדומים וכה).
9. שטוף את האיברים 2-3x עם PBS ב RT ממש לפני שמתחיל את הליך הסליקה.

2. סליקת רקמות

עיתוי: 2-3 שעות לאיברים קטנים ו1-4 ימים לאיברים גדולים.

הערות: ניאון התיוג של הרקמות על ידי ביטוי transgene, transfection הנגיפי, התחקות צבע או אנטיתיוג הגוף אמור להסתיים לפני ניקוי. כל צעדי סליקת הרקמה מבוצעים ב RT. פתרונות הסליקה THF, DBE, באב (בנזיל אלכוהול חלק 1 ותכשיר 2 חלק) וdichloromethane הם רעילים ושאיפה יש להימנע (ניסויי התנהגות במנדף מאוורר כראוי) ומגע ישיר עם עור (כפפות nitrile שימוש).

1. הכן 50% (כרך / כרך), 70%, ודילולי THF 80% במים מזוקקים בבקבוקי זכוכית נפרדים כדלקמן: לTHF 50%, למשל, לערבב 25 THF מיליליטר ו25 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק זכוכית עם נפח של גדול מ50 מיליליטר.
2. מערבבים בעדינות על ידי פתרונות רועדים את הבקבוק לדקות 1-2.
3. תווית בקבוק הזכוכית בצורה ברורה.
4. מאובטח לסגור את הבקבוקים ולשמור על פתרונות העבודה בארון חשוך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אל תשתמשו בפתרוני עבודה באותו זמן רב יותר מאשר 1-2 שבועות. לכן, להורות על פתרונות הסליקה כמו הנפח הקטן ביותר העומד לרשות להיות ריאגנטים המניה טריים שימוש מסוגל.
5. למלא את צלוחיות זכוכית (למשל, מיליליטר 2-3) עם פתרון הסליקה הראשון, 50% THF, ולהעביר את האיברים מPBS לתוך צלוחיות זכוכית להתחיל סליקה.
6. מאובטח לסגור את צלוחיות זכוכית עם המכסים שלהם ולהשתמש מסובב (למשל, stirrer גלגל) לערבוב.
7. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות ולשמור על צלוחיות זכוכית בחושך. התחל המסובב לעורר דגימות בצלוחיות הזכוכית לזמן המצוין (טבלת 1) במהירות קבועה (~ 30V סל"ד).
8. הסר את פתרון הסליקה ולהוסיף את הבאה בפרוטוקול כאשר הזמן בטבלה 1 הושלם.
9. לאסוף את פסולת הסליקה לתוך מכולות פסולת זכוכית שנשמרות במכסת מנוע.
   חזור על שלב קודם עבור כל פתרון סליקה בפרוטוקול ועד הסוף. השתמש פיפטה פסטר חדשה כאשר פתרון סליקה חדש נוסף (למשל, שינוי מTHF לDBE).
10. בשלב הסליקה הסופי עם באב או DBE, ניתן להאריך פעמים הדגירה או shortened עד הדגימות להיות שקופות לחלוטין באור הנראה (או צהבהבים / שקופה אם זה הוא רקמה גדולה מאוד כמו מוח).
11. שמור את האיברים פינו בפתרון הסליקה הסופי בכל העת, כולל צעדי ההדמיה.

3. הכנת איברים הותרו להדמיה

עיתוי: 5-15 דקות.

הערה: תמונת האיברים פינו בהקדם סליקה מלאה מושגת. לשם כך, בצע את השלבים הבאים כדי להכין את הדגימות במיקרוסקופ אור גיליון (למשל, Ultramicroscopy) או הדמיה מיקרוסקופיה confocal / רב פוטון.

הערה: איברים כחכחו יהיו רופפים כוח פלואורסצנטי שלהם לאורך זמן (במיוחד חלבוני ניאון למשל, GFP, תיוג נוגדן הוא עמיד יותר ואולי אפילו לתת תוצאות טובות יותר עם ​​incubations יותר). עבור הדמיה, ניתן להשתמש בם כל עוד טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי שונות כמו טיפול נאות של האיברים בקליאהפתרון טבעת מושגת.

1. למיקרוסקופ אור גיליון
   1. מקום או הר המדגם כראוי.
   2. תקן את האיבר פונו על ידי סיבוב הבורג של בעל מדגם ⁴ באופן ידני.
   3. טובלים את הדגימה לחדר ההדמיה (רצוי מזכוכית) של מיקרוסקופ thelight גיליון כי הוא מלא באב או DBE, מה שיהיה בשימוש בצעד הסליקה הסופי.
2. למיקרוסקופיה פוטון / confocal הרב
   1. הר את המדגם על שקופיות הדמיה (או חדר הדמיה) עם פתרון ההדמיה הסופי כדי להיות מסוגל תמונה עם פוטון רב או confocal, אשר משתמשים בשמן או מטרות מים שקועים בדרך כלל.
   2. השתמש בדבק דנטלי כדי להפוך את גבול מסביב לרקמות.
   3. למלא את הבריכה עם באב או DBE ממש לפני מלט שיניים מקבל נוקשה באופן מלא.
      הערה: מלט השיניים מתמצק במהירות; לתרגל כמה פעמים כדי להכיר אותו לפני שאתה מנסה את הדגימות בפועל.
   4. מייד למקוםהמדגם פינה באמצע הבריכה ולכסות אותו עם כיסוי זכוכית.
   5. לחץ על מכסה הזכוכית עד שהוא אטום לחלוטין על ידי מלט שיניים ונוגע על פני השטח של האיבר מסומן, אשר יאפשר להגיע לעומק המרבי הדמיה על ידי מיקרוסקופית רב פוטון / confocal.
      הערות: הדבר מבטיח כי אין פתרון סליקה יישפך במהלך ההדמיה. הימנע מטבילת עדשת ההדמיה ישירות לתוך פתרון סליקה, אשר יכולה לפגוע בעדשה, אלא אם כן הוא עמיד בפני באב / DBE או שיש כיסוי מגן.

איברים 4. הדמיה כחכחו

עיתוי: 15-45 דקות.

1. לאסוף Z-סריקה מכסה את הרקמה כולה פינתה (אם העדשה בשימוש מאפשרת) ברזולוציה הטובה ביותר שיכול לספק המיקרוסקופ.
2. קרב על האזורים של עניין כדי לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהות יותר.

5. בחינה של נתונים עם תוכנת עמירה

1. טען את תמונת סרייהשל תוכנת עמירה עם מודול ResolveRT.
2. הזן את גדלי voxel הנכונים בחלון "תמונה קראו פרמטר" ולחץ על אישור.
3. בחר "Multi פלנר תצוגה" תת היישום. לאחר מכן השתמשתי במחוון "עובי" כדי לבחור את הסף האופטימלי לערכים האפורים, התאמת ערכי 2D and 3D.
4. דמיין את המדגם על ידי גלישה בפרוסות באורינטציות 2D שונות ובאמצעות מודול יבול פינה בתצוגת 3D.
   הערה: ניתן למצוא מדריך לפתרון בעיות מפורט בפרוטוקול באל Ertürk et ^4.

תוצאות

הנוירונים מקוטבים מאוד תאים עם מורפולוגיה ארוכה מאוד. הפונקציה שלהם תלויה בקשרים שהם יוצרים בין אחד לשני ועם רקמות אחרות. לפיכך, מיפוי המבנה הארגוני של נוירונים הוא מאוד חשוב על מנת להבין איך הם מתפקדים בבריאות ובחוליים. עם זאת, התחקות קשרים עצביים עצומים כאלה ברחבי connectomics כל העצבים בשם מערכת לאחרונה ¹¹ - עדיין נשארת אחד האתגרים הקשים ביותר במדעי המוח. לשם כך, גם באיחוד האירופי ^{12 ו13} ארה"ב יזמו פרויקטים גדולים למפה המוח האנושי.

בעוד 3DISCO יכול להיות מועסק על איברים שונים, זה כבר שימושי במיוחד כדי לעקוב אחר קשרים עצביים ארוכים בחוט השדרה והמוח. לדוגמא, באמצעות סריקות Ultramicroscopy של מגזרי חוט השדרה פינו גדולים, ניתן בעקבות קשרי אקסון מעל סנטימטרים בחוט השדרה של המכרסמים (איור 2). באופן דומה, המוח כולו פינה העכבר (איור 3 א) וההיפוקמפוס (3 ב איור) ניתן הדמיה לעקוב קשרים עצביים במוח.

כאשר פוטון מיקרוסקופיה confocal או רב משמשת באיברים מסומן, ההדמיה ברזולוציה ניתן לשפר באופן משמעותי, במיוחד בZ-ממד. לדוגמא, הדמיה פוטון רב של מיתרי השדרה פינו מעכברי ה-GFP-M קו (איור 4 א) משיגה תמונה חלקה לאורך כל העומק (~ 1.5-2 מ"מ) של חוט השדרה. microcopy confocal על חוט השדרה פינה מספק רזולוציה משופרת באופן דומה (4 ב דמויות וג). הדמיה מיקרוסקופית פוטונים רב של מוח פינה מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד כדי להמחיש פרטים קטנים של מבנים עצביים כוללים קוצים הדנדריטים (איור 5). הדגימות ל3DISCO יכולות להיות מתויגות בדרכים שונות, כולל ביטוי transgene, virtransfection אל, התחקות צבע וסימון נוגדן. לדוגמא, ניתן לתייג את כל כלי הדם במוח (6 א דמויות וב) וחוט השדרה (6 ג דמויות וד) באמצעות קליעים נותבים ניאון קטינים מצומדת ^4, אשר יכול לשמש כדי לחקור דם למוח, המחסום (BBB ) בבריאות ובחוליים.

מיקרוגליה והאסטרוציטים שניהם מעורבים מאוד בפתולוגיה של ניוון מוחיים כולל המחלות אלצהיימר ופציעות טראומטיות ^14,15. שימוש 3DISCO, ניתן ללמוד בצפיפות וההפצה בחוט השדרה (איור 7) או במוח שלהם.

יכולות גם להיות צילמו רקמות שאינן עצביות. לדוגמא, תאי קלרה הריאות מכרסמים כל ניתן immunolabeled עם נוגדנים וצלמו ללא חתך ברמת תא בודדת (איור 8). באופן דומה, אפשר לנקות ותאי תמונה למשלתאי אלפא ברקמת לבלב unsectioned (איור 9).

איור 1. סליקת רקמת 3DISCO הופכת רקמות unsectioned שקופות להדמית רקמות עמוקה. (ב) רקמות חוט השדרה בערפול (א) ופינו כפי שניתן לראות באור הנראה. על הסליקה, מיקרוסקופית סריקת לייזר רקמות עמוקות הופך לאפשרי. (ג) רקמות חוט השדרה בערפול ופינו היו הדמיה על ידי מיקרוסקופ 2 פוטונים. סולם ברים ב, b = 0.5 מ"מ ובc = 100 מיקרומטר.

איור 2. ההדמיה 3DISCO של חוט השדרה לעקוב סיומות אקסון. חוט השדרה גזור מן השורה Thy-1 מהונדס GFP עכבר (GFP-M) מחולק לחתיכות קטנות יותר (~4 מ"מ). לאחר ביצוע פרוטוקול סליקה לרקמות קטנות (טבלה 1) מיתרי השדרה השקופים היו דמיינו באמצעות Ultramicroscopy. שחזורי 3D של קטע עמוד השדרה ~ 4 מ"מ אופקי (א), העטרה (ב) והשקפת sagittal (ג). (ד) נציג לייחס אקסונים (אדום) מוצגים בתצוגה שקופה בגווני אפור. (ה) צפה בהגדלה גבוהה של האזור שצוין ב( ד). סולם ברים בA, B, C, D = 0.5 מ"מ ובדואר = 20 מיקרומטר.

איור 3. ההדמיה 3DISCO של מוח וההיפוקמפוס פינה. דוגמאות של מוח והיפוקמפוס של עכברי ה-GFP-M פינה הם צילמו עם אולטרה. פריטים חזותיים 3D של המוח כולו () וההיפוקמפוס (ב) הוכחת netwo העצביRKS ברקמות שקופות הדמיה. סולם ברים ב= 2 מ"מ ובb = 20 מיקרומטר.

איור 4. סליקת רקמות משפרת את הרזולוציה המתקבלת על ידי פוטונים רב ומיקרוסקופיה confocal. מגזרי חוט השדרה שקופים מעכברי ה-GFP-M צילמו ידי פוטונים רב (א) או confocal (ב, ג). שים לב שהניקוי באופן משמעותי משפר את הרזולוציה ועומק הדמיה חושף את המבנה העדין של אקסונים ודנדריטים. סולם ברים ב= 100 מיקרומטר ובb, c = 20 מיקרומטר.

איור 5. ההדמיה 3DISCO של קוצים הדנדריטים. רקמת מוח שקופה מעכברי ה-GFP-M צילמו ידי פוטונים רב. פריטים חזותיים 3D של אזור קליפת המוח הסרוקים מוצגים בverפרספקטיבות tical (א) ואופקיות (ב). (ג) ~ 50 מיקרומטר הקרנה מהרמות שצוינו ב( a, b). הגדלה (ד) גבוהה באזור מצויינים ב( ג) הממחיש את הפרטים הקטנים של המבנים עצביים כוללים קוצים הדנדריטים (ראשי חץ). סולם ברים ב= 50 מיקרומטר, בb, c = 25 מיקרומטר, בד = 5 מיקרומטר.

איור 6. 3DISCO של כלי דם. כדי לתייג את כלי דם בכל האיברים, צבע לקטינים-FITC שימש במהלך זלוף (לפני הסליקה) כמתואר ^16. ראוי לציין להזכיר כי מצאנו כי הזרקה לוריד זנב של נותב נותנת אות טובה יותר זלוף לב של נותב. לאחר איסוף המוח הקבוע וחוט שדרה, הם פונו ואנימאגד ידי Ultramicroscopy. 3D להדמיה של כלי הדם במוח עכבר כולו בHeatmap (א) ואפורה בקנה מידה (א). (ב) להדמיה 3D של כלי הדם של קטע עכבר חוט השדרה בHeatmap (ג) ואפורה בקנה מידה (ד). Heatmaps נוצרו בהתבסס על עוצמת צביעה לקטינים; כחול: בעצימות נמוכות (ברקע) ואדום: בעוצמה גבוהה (כלי דם). סולם ברים ב= 2 מ"מ, מ"מ b = 1, וג, ד = 250 מיקרומטר.

איור 7. 3DISCO של תאי גליה ברקמת מערכת העצבים המרכזית מסומנת. מיתרי השדרה של עכברים הטרנסגניים להביע GFP במיקרוגליה TgH (CX3CR1-EGFP) או האסטרוציטים TGN (hGFAP-ECFP) פונו וצלמו על ידי מיקרוסקופ פוטון רב. 3D טיוח של מיקרוגליה מוצג כהדמית משטח נפח (א) ותצוגה שקופה ( (ג) היטל אופטי (~ 50 מיקרומטר) מוצג כדי להראות את הפרטים של מיקרוגליה בחוט השדרה. 3D טיוח של האסטרוציטים מוצג כהדמית משטח נפח (א) ותצוגה שקופה (ב). (ו) השלכה אופטית (~ 50 מיקרומטר) מוצגת כדי להראות את הפרטים של האסטרוציטים בחוט השדרה. סולם ברים בA, B, D, E = 100 מיקרומטר ובC, F = 50 מיקרומטר.

איור 8. 3DISCO של אונת ריאה כל הר עם מכתים נוגדן של תאי קלרה. למכתים נוגדן כל ההר של אונות ריאה, היו perfused נקבות עכברי BALB / C 10 בן השבוע דרך החדר ממני עם PBS כדי להסיר דם מהריאות. ריאות היו מנופחות לאחר מכן עם PFA 4% וקבועים O / N ב RT במקבע לפחות שלוש פעמים את היקף הדואר רקמות. למחרת, הריאות היו שטופה בקצרה בPBS והאונה הימנית הייתה לשים 5 מיליליטר של 1% טריטון X-100 בPBS עבור permeabilization ל48 שעות או עד שהרקמה צנחה. כל stainings בוצעו ב0.2% טריטון X-100 בPBS המכיל 5% FBS ו BSA 2% ושטיפות היו ב0.2% טריטון X-100 ב-PBS. צביעה עם אנטי CC10 הייתה ל72 שעות ב 4 ° C ואחריו שוטף נרחב למשך כ 6 שעות. ניאון תיוג של הנוגדן הראשוני הושג עם נוגדנים משני נגד עיזים-Alexa פלואוריד-594 לילה ב 4 ° C ואחריו שוטף נרחב עבור שעות 6 עד הלילה. למחרת, פונו אונות מוכתמות דרך 50%, 70%, וTHF 80% ל30 דקות כל אחד ואחריו שלושה שוטף 30 דקות בTHF 100%, ואחריו 20 דקות בDCM, ואחריו 30 דקות בDBE. סולם ברים ובb = 1 מ"מ ובc = 100 מיקרומטר.

דמות 9. 3DISCO של לבלב. לאחר טפטוף של עכברים כפי שתואר לעיל בפרוטוקול, הלבלב היה גזור ופינה עם הפרוטוקול הקצר. הקרינה נובעת מרקומבינציה ROSA26 LSL tdTomato הנגרמת על ידי טיפול בטמוקסיפן של עכברים שנשאו transgene BAC 200 kb פורש לוקוס גלוקגון עכבר אנדוגני עם CreERT2 מוכנס לתוך ATG של גלוקגון. ראשי החץ לסמן חלק מתאי אלפא כותרת הניאון באיון. סולם ברים ב= מ"מ, B ו-C 1 ובד = 500 מיקרומטר.

טבלת 1. פרוטוקולי סליקת רקמות לרקמות שונות. דוגמאות לפרוטוקולי סליקת רקמה לרקמות שונות. שים לב כי זמן הסליקה לכל שלב ניתן לקצר או להאריך לפי צורך כדי לשפר את ביצועי הסליקה. המשקל המשוער של רקמות קטנות הוא ~ 20-100 מ"ג והמוח הוא ~ 300-500 מ"ג.ttps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

דיון

שיטות ניקוי רקמות מטרתם להפחית את הפיזור של ההדמיה אור על ידי מדדי השבירה של שכבות רקמה שונות המתאימות באיברים מסומן. כתוצאה מכך, אור ההדמיה יכול לחדור עמוק לתוך רקמות ולגרות את התאים / מולקולות שכותרתו. הרעיון הישן הזה של רקמת ניקוי ¹⁷ זכה לתשומת לב הולך וגדל לאחר היישום הראשון המתוחכם של הטכניקה על מוח עכבר בשלמות על ידי Dodt ועמיתים ^2. מאז, יש רשימה הולכת וגדלה במהירות של שיטות סליקה חדשות כולל 3DISCO, SCA / דואר, ClearT2, בהירות וSeeDB ^3,4,7,18-20. בעיקרו של הדבר, כל מה שהם שואפים להפוך את האיברים שקופים להדמית רקמות עמוקה על ידי שמירה על תווית הניאון. ביניהם, 3DISCO בולט כאחת השיטות פשוטות ולשעתק ביותר. זה לעומת מהיר יחסית לשיטות אחרות סליקה שהוזכרו לעיל (1-5 ימים לעומת 2-3 שבועות למוחות בוגרים, בהתאמה) ^21. זה כבר היה הצלחהמיושם באופן מלא לאיברים שונים כגון המוח, חוט השדרה, בלוטות לימפה, טחול, ריאות, גידולים מוצקים, לבלב, ובלוטות החלב ^3,4,9. בנוסף, מספר פרסומים על ידי קבוצות מחקר עצמאיות שכבר השתמשו בשיטה זו כדי להשיג תוצאות ההדמיה ^22,23. עם זאת, נהלי סליקת רקמות שונים יכולים להיות יתרון עבור תנאים שונים. לדוגמא, בעוד SCA / דואר וSeeDB חלים הטובים ביותר על רקמות עוברי ^6,7, הם שיטות סליקה על בסיס מים, שיכול להיות קל יותר לטפל במהלך הדמיה. לעומת זאת, בהירות היא שיטת סליקה מסובכת ויקרה. אבל זה יכול להיות יתרון בהקשר של תיוג נוגדן, בעיקר ברקמות גדולות כגון מוח ^8.

השלב הקריטי ביותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מהדמית 3DISCO הוא תיוג רקמות, שנעשה לפני סליקת הרקמות. זה חיוני כדי להתחיל עם אות הניאון החזקה ביותר האפשרית. זה יכול bדואר שהושג בדרכים שונות, כולל ביטוי מהונדס של חלבוני ניאון, התחקות על ידי צבעים סינטטיים, transfection הנגיפי או תיוג נוגדן. יש לזכור כי כל הליך סליקה יפחית את אות הניאון של הרקמות. לפיכך, אם אות הניאון היא לא מספיק חזקה בהתחלה - כלומר הוא לא ניתן לגילוי בקלות לפני הסליקה ההדמיה של הרקמות פינו יספק תוצאות עניות.

ישנן מספר מגבלות סליקת שיטות שמחכות לשיפורים. מגבלה קריטית היא שמאז ריאגנטים סליקה לשנות את המבנה של האיברים התפזרו, הם לא יכולים לשמש ברקמה חי. לפיכך, יש לבצע ניסויים כגון עם mEos2 photoactivatable ²⁴ לפני תיקון והסליקה. על הסליקה, הדמיה ברזולוציה סופר של אות הניאון מחלבונים בהירים וphotostable הופכת לאפשרית. בנוסף, בגלל פרוטוקול הסליקה פוחתאינטנסיביות של חלבוני הניאון, לא ניתן לאחסן האיברים פינו לתקופות ממושכות. חשוב לציין כי חלק מהאיברים הם יותר קשים להיות מסומנות. במיוחד, אם האיברים גזורים לשמור על כמויות גבוהות של תאי דם (למשל, טחול, כבד), שהם קשים יחסית כדי לנקות ותמונה. זה גם יחסית קשה יותר להשגת סליקה מלאה לרקמות גדולות, כגון מוח מכרסם מבוגר. רקמות כגון ייתכן שתצטרכנה פעמים דגירה ארוכות יותר, אשר יכולה, מצד שני, להפחית את אות הניאון. בנוסף, פיתוח של שיטות מיקרוסקופית שיכול איברים גדולים ושקופים תמונה בבת אחת ברזולוציה גבוהה הוא צורך מחכה שיפנו אליו. מגבלה נוספת חשובה של הטכניקה היא תיוג רקמות. בעוד אות ניאון חזקה באמצעות ביטוי גנטי או וירוס היא אידיאלית, לא בכל תא או מולקולה יכול להיות מתויג גנטי או באופן ויראלי. מצד השני, תיוג נוגדן של רקמות עבות הוא לא הליך פשוט או אפילו לא פוssible ברוב המקרים. זה אולי צריך פרוטוקולי permeabilization מיוחדים וזמני דגירה ארוכה (מספר ימים עד מספר שבועות) ^3. כמו כן, חשוב לזכור כי הרקמות להתכווץ ~ 20% בכל ממד (נמדד לרקמת חוט השדרה) לאחר ניקוי בעיקר עקב התייבשות וdelipidation. הצטמקות זו מתרחשת ratiometrically וצריכה להיות מתוקנת בצעדי כימות. כפי שנצפה בתוצאות שהוצגו, המבנים שכותרתו fluorescently נותרו על כנן, המהווה את אינדיקציה לתקינות חלבון ברקמות מסומנות. בגלל האופי ההידרופובי של הרקמה פינתה הסופית, זה לא יכול להיות מוכתם נוסף עם נוגדנים או מוטבע בפתרונות מים המכילים למשל, Focusclear-המשמש בגליצרול CLARITY-או 80%. לבסוף, זה אתגר לנתח גדלים מכריעות של נתוני הדמיה. לדוגמא, כאשר המוח עכברי כולו נסרק ברזולוציה סלולרית, זה יהיה קשה מאוד להתחקות אחר ולכמת str הרצויuctures (למשל, עצבי או רשתות גליה) ולהשוות על מדגמים שונים באופן אוטומטי. לסיכום, בעוד שחוקרים שואפים לגלות שיטות סליקה חדשות, האתגרים השונים לעיל (קושי בניקוי רקמות מגוונות, הדמיה ברזולוציה גבוהה של אזורים גדולים יותר, וניתוח נתונים מסובך) יש לשפר במקביל.

לסיכום, טכניקות ניקוי רקמות שפותחו לאחרונה, כולל 3DISCO, אלגנטיות להוכיח כי 3D הדמיה ברזולוציה גבוהה של איברים שלמים עכשיו זה אפשרי. שימוש בשיטות אלה, מדענים יכולים להשיג מידע האנטומי של תאים ומולקולות באיבר שלם. מחקרי אלה חלוצי 3D הדמיה על איברים שקופים לעורר מספר גדל והולך של חוקרים לפענח אנטומי מורכבות וארגונים מולקולריים של רקמות / איברים בהית ומחלות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
		Thy-1 GFP (GFP-M)	ניתן להשיג מג'קסון.
ניתן להשיג עכבר			ממעבדת ליטמן באוניברסיטת ניו יורק.
ניתן להשיג עכבר			מג'קסון.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Na2HPO4	Mallinckrodt	7917-16
NaH2PO4	Mallinckrodt	7892-04
2-2-2 Tribromoethanol	Sigma	T48402
2-Methyl-2-butanol	Sigma	152463	בשימוש להכנת תמיסת אברטין.
מלח	בראון
טטרהידרופוראן	סיגמא	186562-12X100 מ"ל
דיכלורומתאן	סיגמא	270997-12X100 מ"ל
דיבנזיל אתר	סיגמא	108014-1KG
בנזיל אלכוהול	סיגמא	305197-100 מ"ל
בנזיל בנזואט	סיגמא	B6630-250 מ"ל
לקטין FITC	Sigma	L0401-1MG
אנטי-CC10	סנטה קרוז	SC-9772	0.3888888889
504001 תרופות		Heparin	משמש בזילוף.
בקבוקוני זכוכית	VWR	548-0554
מלקחיים	FST	11251-10
מיני מסובב	VWR	100498-878
רדיד אלומיניום	פישרברנד	01-213-104
בקבוקי אחסון מדיה 100 מ"ל	בקבוקי מדיה קימקס	EW-34523-00
משאבת זלוף אבולוציה מיניפולסית עם ראש משאבת זרימה בינונית MF4*	Gilson, Inc	שקופית מיקרוסקופיה F110701 ו-F117606
	VWR	48311-703
FastWell	Grace Bio-Labs	FW20
תלוש כיסוי	קורנינג	2940-245
צלחת פטרי זכוכית	קורנינג פיירקס	3160-101
מלט שיניים	Lang Dental	1223PNK
בדיקת מי חמצן רצועות	Sigma	37206
Amira עם RT לפתור מודול מיקרוסקופיה		הדמיה Visage	ניתוח תמונות
Imaris	Bitplane הדמיה	תוכנה
ImageJ	NIH	freeware