הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

16.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51391

⸱

2 באפריל 2014

1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

במאמר זה

סיכום

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

תקציר

התגובה החיסונית המארח לפתוגנים היא תהליך ביולוגי מורכב. רוב במחקרי vivo מועסק קלסי לאפיין אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן לנצל את זריקות intraperitoneal של חיידקים בחרו או דפוסי הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs) בעכברים. בעוד טכניקות אלה הניבו נתונים עצומים הקשורים pathobiology מחלות זיהומיות, מודלים זריקת intraperitoneal הם לא תמיד מתאימים ללימודי אינטראקציה המאכסן לפתוגן בריאות. ניצול מודל דלקת ריאות חריף בעכברים, ניתן לבצע ניתוח ברזולוציה גבוה של מארח תגובה חיסונית מולדת ניצול lipopolysaccharide (LPS). כאן, אנו מתארים את השיטות לניהול LPS באמצעות ממשל intratracheal הלוע התחתון לא נזקק לניתוח, לעקוב אחר פרמטרים קליניים הקשורים להיווצרות מחלה, ולנצל את נוזל שטיפת רונכואלוואולרית כדי להעריך את התגובה החיסונית המארחת. הטכניקות המתוארותחלים נרחב ללימוד התגובה החיסונית המולדת המארח למגוון רחב של PAMPs ופתוגנים. כמו כן, עם שינויים קלים, יכולות להיות מיושמות גם בטכניקות אלה במחקרים להערכת דלקת בדרכי הנשימה ואלרגיות ביישומים תרופתיים.

מבוא

דלקות ריאה הקשורים למיני חיידקים פתוגניים הם גורמים שכיחים לתחלואה ותמותה בעולם. קביעת המנגנונים המניעים את התגובה החיסונית המארחת לפתוגנים אלה יהיו לקדם את הפיתוח של אסטרטגיות חדשניות למניעה וסוכנים טיפוליים שיהיה להחליש את ההשפעה של זיהומים אלה. המטרה הכללית של הפרוטוקול המתואר כאן היא לספק את המשתמש עם שיטה גמישה כדי להעריך את התגובה החיסונית המולדת המארח לזיהום הפתוגן באמצעות דפוס הפתוגן הקשורים מולקולרי (PAMP) כתחליף לחיידקים חיים. רוב המחקרים הקודמים להערכת התגובה החיסונית המולדת לחיידקי המארח התמקדו בדגמי הצפק בשל הקלות היחסית של ביצוע. בעוד מודלים אלה הם שימושיים מאוד והביאו להתקדמות משמעותית בתחום של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ודלקת מערכתית, הנתונים המופקים ממודלים אלה לא תמיד מתאימים ללימודים involving מערכת הנשימה. הנה, מודל ריאות של דלקת ריאות חריפה מוצע כהרחבה מעשית ורלוונטית קליני של המודלים הזרקה (IP) intraperitoneal הקלאסיים. הטכניקה המוצעת מאפשרת להערכה המקומית של תגובת החיסון המולדת במערכת מודל ספציפית איברים.

השיטות שתוארו כאן נועדו לספק טכניקה פשוטה וחזקה כדי לאפשר למשתמשים להעריך את התגובה החיסונית המארחת לLPS, שהוא PAMP משותף. השיטות מבוססות על intratracheal החדרה (את זה) של LPS, אשר גורם לתגובה חיסונית מולדת חזקה לריאות של עכברים ומחקה רבים מהתכונות pathophysiological נצפו בחולים אנושיים הסובלים מזיהומים בדרכי הנשימה ופציעת ריאות חריפות 1. יתרון עיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת למשתמש להעריך את התגובה החיסונית המארחת בלי גורמי בלבול וחששות בטיחות הקשורים לביצוע במחקרי vivoשימוש בחיידקים חיים. כמו כן, יש מסלול ממשלו הלוע התחתון של חשיפה שתוארה בפרוטוקול זה יתרונות משמעותיים על פני טכניקות אחרות מנוצלים בדרך כלל, כוללים אפי (ב) ממשל ומנהלו כירורגית. לדוגמא, ממשלו הלוע התחתון מאפשר dosaging מדויק יחסית ותצהיר ריאות בהשוואה בממשל, אשר בדרך כלל סובל מהשתנות מוגברת של תצהיר ריאות עקב האובדן של סוכנים בחלל האף והסינוסים 2-4. מסלול הממשל עוקף חללים אלו ומאפשר גישה ישירה לקנה הנשימה ודרכי הנשימה. כמו כן, גישתה כירורגית היא שיטת ממשל באופן משמעותי יותר חולנית ודורשת הכשרה מקיפה להורים. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים גם תיאור טכניקות הנפוצות וסמנים פונדקאיות המשמשים להערכת התקדמות דלקת ומסתיים בפרוטוקול המתאר את הטכניקות המתאימות להכנת luNGS להערכות histopathology. פרוטוקולים אלה התמקדו במזעור מספר העכברים הנדרשים לכל מחקר על ידי למקסם את הנתונים המופקים מבעלי חיים הבודדים.

הפרוטוקולים שתוארו הם גמישים ביותר וניתן לשנות בקלות להעריך PAMPs מגוון רחב ודפוסי נזקים הקשורים מולקולריים (damps). יתר על כן, עם כמה שינויים נוספים, יכולים להיות מיושמים גם בפרוטוקולים אלה למחקרים להערכת התקדמות מחלה בדרכי הנשימה אלרגיות או אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן עם חיידקים חיים, וירוסים או פטריות 5-10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים נערכו באישור הוועדה המוסדי לטיפול ושימוש (IACUC) לוירג'יניה טק ובהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה.

1. חיסון Intratracheal (את זה) של LPS באמצעות מנהל מלוע תחתון

  1. ודא שכל חיה היא ייחודי מזוהות או באמצעות אגרוף באוזן, תג אוזן, או שיטה אחרת שאושרה מוסדי.
  2. רשום את משקל הגוף הבסיסי ואת טמפרטורת גוף לכל חיה.
  3. הכן את מניית העבודה של LPS. כל עכבר יקבל מינון 50 μl של 1 מ"ג / קילוגרם LPS בפוספט 1x סליין (PBS). בעלי חיים שטופלו מוק יקבלו מינון 50 μl של 1x PBS.
  4. הכן את החדר מתאים לניהול isoflurane בשיטת הטיפה הבאה. הנחיות מוסדיות להשתנות בנוגע לשימוש בisoflurane וחומרי הרדמה אחרים ולפני initiating כל מחקרים, אנשים צריכים ליצור קשר עם המחלקה של המוסד שלהם של טיפול בבעלי חיים / רווחה על מנת להבטיח את כל ההנחיות הם נפגשו כראוי. אם isoflurane שיטת הטיפה הוא לא אופציה, חומרי הרדמה אחרים הם חלופות מקובלות.
    1. בארון בטיחות מתאים, להחיל כ 3 מיליליטר של isoflurane למגבת מקופל סופגת נייר ומניחים בתחתית כוס 500 מיליליטר.
    2. מניחים חתיכה קטנה של נייר אלומיניום על גבי מגבת נייר ולכסות את הכוס עם מכסה שקוף.
  5. הכן את הכלים וחומרים כימיים שישמשו בחיסון זה. מקם את הגומייה שתבטיח את החיות על ראש דוכן אינטובציה. הליך זה ידרוש זוג מלקחיים ישרים, זוג מלקחיים זווית או עקומים, ופיפטה p200 עם טיפים.
  6. טען 50 μl של LPS לקצה פיפטה והמקום במיקום נגיש בקלות לצד דוכן אינטובציה.
  7. להרדים את העכברעל ידי הנחת את החיה לתוך תא isoflurane ומכסה תא עם המכסה השקוף. שים לב לדפוסי הנשימה של בעל החיים, אשר יהיו מהיר ושטחי, כאשר במקום הראשון בחדר. בעלי החיים יהיו בהרדמה מספיק כאשר שיעורי נשימה להתקרב שניות 1 נשימה / 2, אשר בדרך כלל מגיעה בתוך 30 שניות של הנחת בתא. העכבר צריך להיות מורדם כאמור בפרוטוקול שאושר על בעלי החיים באמצעות isoflurane שיטת טיפה.
  8. הסר את העכבר הרדים מהאולם ולהשעות את החיה על אינטובציה לעמוד על ידי השיניים החותכות הקדמיות שלה. להבטיח כי בעל החיים הוא מאופק באופן מאובטח והפה והלשון נגישים.
  9. בעדינות לאבטח את הלשון עם המלקחיים הישרים. לתפוס את הלשון עם המלקחיים זווית ובעדינות לשלוף אותו מהפה ועד התנגדות קלה מורגשת. פעולה זו די בכך כדי לחסום את מכסה הקנה ולהשיג גישה לקנה הנשימה.
  10. תוך כדי להחזיק את הלשון בעמדה מורחבת, לנהל את מינון 50 μl של LPS לחלק האחורי של הגרון ולכסות מייד נחיריו של בעל החיים באצבע בכפפות. LPS יהיה גלוי בחלק האחורי של הגרון ועד לעכבר שואף.
  11. תמשיך לכסות את הנחיריים והחזק את הלשון הוארכה 5-10 נשימות נוספות.
  12. הסר את העכבר מדוכן אינטובציה ולמקם את בעלי החיים בחזרה לכלוב חדש עד שהוא מתאושש מההרדמה.
  13. לפקח סמנים פונדקאיות קשורים עם התקדמות מחלה. משקל גוף וטמפרטורת גוף צריך להיות במעקב כל שעות 4-8 לתקופת המחקר. כמו כן, להעריך את המאפיינים התנהגותיים ותסמינים קליניים הקשורים לתחלואה מוגברת.
  14. כדי להעריך את התקדמות מחלה, עכברי קציר בזמן נקודות ספציפיות בעקבות חשיפת LPS. זמן נקודות אופייניות לקציר בעקבות חשיפת LPS כוללות 0, 6, 12, 18, 24, ו48 שעות. כדי להעריך את ההחלמה והישרדות, להעריך את העכברים ל7 דהי"ש שלאחר חיסון.

2. אוסף נוזל סרום ושטיפה ברונכואלוואולרית (בלף)

  1. להקריב את העכבר באמצעות שיטה שאושרה מוסדי.
  2. מניחים את החיה על הגב שלו ולאבטח אותו ללוח נתיחה לאחר מוות, באופן אידיאלי 0.5 ב( 1.27 סנטימטר) בגובה.
  3. להרטיב את כל העכבר עם 70% אתנול.
  4. באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מחט 27 G, לנהל לנקב לב לפני ביצוע חתכים. זה צריך להיות אפשרי לסגת 500-800 μl של דם מלא מעכבר אחת.
  5. הסר את המחט מהמזרק ולהעביר את כל הדם לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר prelabeled. לאוסף סרום, לאפשר את כל הדם כדי להקריש לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר. בנוסף לאוסף בסרום, הליך זה יכול גם להיות שונה על ידי שילוב נוגד קרישה בצינור והמזרק, לפני איסוף הדם כולו, ללמוד במחזור תאים חיסוניים.
  6. הפוך חתך אופקיחוצה את אורכו של חלל הצפק וחתך אנכי מחלל הצפק ללסת התחתונה של העכבר.
  7. בעזרת מלקחיים, לתפוס את שני צידי החתך ומשוך בעדינות את העור מחללי הצפק וחזה הבסיסיים.
  8. לעשות חתך גדול לאורכו של חלל הצפק מאיבר המין לעצם החזה, לטפל כדי למנוע חיתוך הסרעפת. בעדינות להעביר את המעיים בחלל הצפק כדי לאפשר גישה לאחת מהכליות.
  9. חותכים את וריד הכליה מוביל לכליה כדי לשמש כנקודת ניקוז לזלוף.
  10. ניק הסרעפת באמצעות מספריים, לטפל כדי למנוע את הריאות ולב, על מנת לחשוף את הצד השמאלי של הלב.
  11. ידני ינקב הלב באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט 27 G ופתרון 1x PBS. הימנע מהפעלת כוח מופרז במהלך זלוף, כדי להבטיח כי מי מלח לא בכפייה לתוך הריאות. הדם שנותר צריך לנקז מן חתך וריד שער.
  12. לחתוך בזהירות את בית החזה לאורך עצם החזה באמצעות מספריים קהים / קהים, לטפל כדי למנוע חיתוך הלב וריאות. טעות חיתוך הריאות במהלך הליך זה יהיה להפחית באופן משמעותי את כמות בלף נאספה ויגרום לחוסר יכולת לנפח כראוי הריאות עם מקבע.
  13. בעדינות לבודד את הלב וריאות מבית החזה באמצעות מלקחיים. לחתוך בזהירות כל חלק של בית החזה באמצעות מספריים קהים / קהים קרובים לשדרה ככל האפשר ובאופן מלא להסיר את שני החלקים.
  14. הפרד את בלוטות הרוק באמצעות מלקחיים או להסיר אותם באמצעות מספריים, כדי לחשוף את קנה הנשימה.
  15. לחתוך בזהירות את השרירים שכיסוי קנה הנשימה באמצעות מספריים. זה חיוני כי קנה הנשימה לא תקוצץ במהלך תהליך זה.
  16. בעזרת מספריים, להפריד את עצם הבריח שמעל קנה הנשימה.
  17. בעדינות לתפוס את התימוס באמצעות מלקחיים ולהרים את הרקמה מן הלב. הסר את התימוס באמצעות מספריים, תוך הקפדה על להימנע מחיתוך הלב או ריאות.
  18. לעשות חתך אופקי קטן בקנה הנשימה 1-2 טבעות מתחת לגרון באמצעות מספריים בזווית (זווית 45-90 º, חד / חדה). החתך צריך להיות גדול מספיק כדי לאבטח את הצינורית בתוקף.
  19. הכנס את הצינורית כך שהקצה מחודד מרחיב 2-3 טבעות קנה הנשימה מתחת לחתך ולאבטח את הצינורית במקום באמצעות תפר משי. ודא שהתפר עובר בין קנה הנשימה והוושט, והוא משך בחוזקה בצינורית.
  20. ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם 1 מיליליטר של הנקס שנאגרו מלוח פתרון (HBSS) ועדינות להכניס luer לתוך הצינורית.
  21. שימוש בהילוך איטי, אבל קבוע, להזריק ~ 900 μl לתוך קנה הנשימה, מנפח את הריאות, ולסגת באופן מיידי HBSS. הנח את בלף התאושש בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
  22. חזור על שטיפה זה 2 פעמים נוספות כדי לאסוף כ 3 מיליליטר של בלף לניתוח בעתיד. אחסן את בלף על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.

ass = "jove_title"> 3. Histopathology הכנה

  1. הכנס מזרק 10 מיליליטר לעמדת האינפלציה הריאות. הרכב את הצינור לluer, luer לברזלים, והברזלים למזרק. להבטיח את ברזלים הוא במצב הסגור. מזרק 10 מיליליטר ישמש כזרימה הכבידה מאגר. המאגר צריך להיות מחובר לאינפלציה יעמוד ב4.75 מעל החיה וחלקו העליון של המאגר צריך להרחיב 10.5 במעל לבעלי החיים.
  2. מלא את המזרק עם פתרון ניטראלי שנאגרו פורמלין. ודא שהמזרק מלא לחלוטין עם המקבע.
  3. הנח מגבת סופגת מתחת לקצה הפתוח של הצינור ולפתוח את השסתום כדי לאפשר מקבע כדי למלא את צינורות. ברגע שמקבע מתחיל לזרום מהצינור, סגור מייד את השסתום ולמלא את המזרק לחלק העליון עם מקבע. חשוב שהמזרק יתמלא לחלוטין כדי לספק את הכמות המתאימה של לחץ לאינפלציה ריאות.
  4. בעדינות לעבור חתיכת חוט התפר שנייה תחת קנה הנשימה, כ 1-2 טבעות קנה הנשימה מתחת לקצה של הצינורית.
  5. לקשור קשר רופף יחיד בתפר; עם זאת, אל תמשכו חזק קשר.
  6. הכנס את צינורות מאינפלצית העכבר לעמוד לצינורית.
  7. פתח את השסתום ולאפשר לריאות כדי למלא על ידי אינפלציה הכבידה.
  8. ברגע שהריאות מגיעות לרמת האינפלציה המרבית שלהם, למשוך את התפר הדוק ולקשור קשר שני.
  9. סגור את ברזלים ולהסיר את הצינור מהצינורית.
  10. להסיר בעדינות את הצינורית מקנה הנשימה על ידי אחיזה בתפר עם זוג המלקחיים ומחזיק את הצינורית עם אצבעות. בתקיפות למשוך את התפר כלפי מטה לכיוון חלל בית החזה ואת הצינורית חזרה לכיוון אפו של העכבר.
  11. בעדינות לתפוס את קנה הנשימה או תפרים עם מלקחיים ולהרים את קנה הנשימה מחלל הצוואר.
  12. לנתק את הזנב קנה הנשימה לתפר קשר באמצעות מספריים קהים.
  13. ברגע שtracheהוא חופשי מהרקמות הבסיסיות, מתחיל למשוך את קנה הנשימה מהעכבר. רם בעדינות את הריאות מחוץ לחלל בית החזה.
  14. בזהירות לחתוך את רקמת החיבור מחזיקה את הריאות בחלל בית החזה. תמשיך למשוך את קנה הנשימה מגופו של העכבר ולהפעיל כוח כלפי מעלה יציב תוך צמצום הקשרים הבסיסיים. תשמור על עצמך כדי להימנע מחיתוך הריאות. שים לב כי בלב יש להשאיר מצורף לריאות באמצעות שיטה זו.
  15. ברגע שהריאות הוסרו, למקם אותם ב10 מיליליטר של פורמלין שנאגרו.
  16. הסר את הקטע של זנב עכבר לגנוטיפ.
  17. השלך את גופת העכבר פועלים בהתאם להנחיות מוסדיות המתאימות.

4. הערכת ציטוקין

  1. צנטריפוגה הדם כולו, שנאסף במסגרת שלב 2.5, ב12,000 XG במשך 5 דקות כדי לבודד את הסרום. העבר את הסרום לצינור prelabeled 1.5 מיליליטר microcentrifuge ולאחסן ב -80 ° C.
  2. להעריך את Seruרמות ציטוקינים מ 'על ידי ELISA או אחר assay הדומה. לדלל את הסרום 1:05-1:20 בחיץ דילול מתאים, בהתאם לassay, בעקבות מייצר הוראות. דילולים אלה צריכים להיקבע באופן אמפירי לפני הפעלת כמות גדולה של הדגימות.
  3. בשל ההיקף הנמוך של סרום שנאסף, מקטין את המדגם הועמס על צלחת ELISA בחצי הנפח. לדוגמא, רוב ELISAs המסחרי לנצל 100 כרכי μl של סטנדרטים ודגימות. כדי לחסוך בדגימות, עומס 50 μl של תקנים וסרום בדילול מלא בכל טוב.
  4. צנטריפוגה בלף בצנטריפוגה שולחן בקירור ב XG 200 למשך 5 דקות. מעביר את supernatant התא ללא לשני prelabeled 1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות ולאחסן ב -80 ° C.
  5. להעריך ציטוקינים בלף ידי ELISA או אחר assay הדומה ללא דילול.
  6. סרום חנות שאינו בשימוש ובלף ב -80 ° C.

5. ההפרש מכתים וBAL התאי הערכה

  1. בעקבות צנטריפוגה בלף והסרת HBSS מלאה, lyse תאי הדם האדומים pelleted באמצעות מלוח hypotonic. Resuspend התאים 900 μl של מים מזוקקים. מייד להוסיף של 10x PBS 100 μl.
  2. בנפרד lyse מדגם זה. אם דגימות מכילות כמויות מופרזות של תאי דם אדומים, ניתן pelleted התאים בצנטריפוגה בראש הטבלה ב XG 400 למשך 5 דקות ופרוטוקול תמוגה תא הדם האדום יכול להיות חוזר ונשנה.
  3. לקבוע התאי בלף כולל בהשעית מיליליטר 1 באמצעות hemacytometer תחת 10X או 20 הגדלה X עם מכתים Trypan הכחול. להעריך ויציג נתונים אלו כתאים / מיליליטר.
  4. הכן את החומרים לcytospin ומכתים ההפרש. תווית שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטיות באמצעות עיפרון או עט עמיד ממס. אבטח את השקופיות לסוגר cytospin ומשפך. את מכלול השקופיות ברוטור cytospin.
  5. Cytospin 150 μl של בלף בדקות 5 100 XG. אם צפיפות התאים היא גדולה מדי ליעילותלהעריך את המורפולוגיה של תאים, לצמצם את ההיקף הסתחרר כלפי מטה על השקופיות. אפשר השקופיות לאוויר לילה יבש.
  6. ההפרש להכתים את השקופיות הבאות הפרוטוקולים מייצר. אפשר השקופיות לאוויר לילה יבש. Coverslip השקופיות באמצעות Permount ולהעריך את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ מצויד אובייקטיבי 20X ו40X.
  7. קציר התאים שנותרו לניתוח שלאחר מכן, כמו FACS, מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה confocal, מיצוי RNA להערכת ביטוי גנים, ו / או מיצוי חלבון עבור כתם מערבי.

6. הערכת histopathology

  1. הכן את הריאות להערכת histopathology. לאחר 24-48 שעות של קיבעון פורמלין, ventrally לכוון את הריאות מנופחות כולו ומשובץ בפרפין. חותכים את הבלוקים כתוצאה לחשוף את דרכי הנשימה הניצוח הראשיות.
  2. כדי לשפר את דיוק ניקוד, מקם את הריאות באותה התנוחה ולקצץ כל בלוק להניב ההדמיה האורך המרבית של tהוא intrapulmonary נתיב אוויר צירי עיקרי. מנקודה זו, לקצץ 5 מיקרון סעיפים סידוריים ואת כתם עם hematoxylin ו eosin (H & E). ניתן לחתוך קטעים נוספים ומוכנים לכלאה באתרו תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים.
  3. להעריך histopathology באמצעות שיטת ניקוד חצי כמותית המבוססת על הפרמטרים הבאים דלקתיים, אשר קלעו בין 0 (היעדר) ו -3 (חמור): חדירה לתא חד גרעיני וpolymorphonuclear; Airway היפרפלזיה של תאי האפיתל ופציעה; extravasation; perivascular ואיזוק peribroncheolar; והאחוזים מהריאות מעורבות בדלקת. histopathology הריאות צריך להיבדק על ידי פתולוג מנוסה.
  4. ממוצע כל ציוני הפרמטר ליצור כולל ציון histopathology או להשתמש בעשרות בודדים לכמת היבטים ספציפיים של התקדמות מחלה. לנהל את כל הניקוד באופן כפול סמיות, עם ביקורות של סימאו לשני גנוטיפ וטיפול. שיטת ניקוד זו כבר previously תאר 6,7,10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דופן התא של חיידקי גרם שלילי מורכבים מLPS, שהוא נרחב ביותר בסביבה. שאיפה של LPS באוכלוסיות אנושיות רגישות מחריפה תגובתיות דרכי הנשימה ומסוגלת להפעיל response11 חיסונית חזק. LPS גם PAMP נפוץ בשימוש במודלים של עכבר כדי לעורר תגובה חיסונית מולדת חזקה. בפרוטוקול מתואר כאן, העכברים קיבלו מינון זה של LPS מבודד מE. coli (סרוטיפ 0111: B4) באמצעות ממשלו הלוע התחתון. במודלים של חשיפת LPS, גם טמפרטורת הגוף ומשקל הם סמנים פונדקאיות אופייניים לתחלואה בעלי חיים והתקדמות מחלה. אתגר LPS ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים הקריטיים ביותר להערכת התגובה החיסונית המארחת בריאות עכבר בהצלחה הוא כדלקמן: 1) לבחור את הזן המתאים עכבר ומין עבור הדגם נבדק; 2) לייעל את משלוח PAMP לריאות; 3) בצורה נכונה לאסוף ולעבד את בלף; ו -4) לתקן כראוי ולהכין של הריאות להערכות histopathological.

הבחירה של זן עכבר היא גורם חשוב בהערכת התגובה החיסונית המארחת. C57Bl / 6 עכברים בדרך כלל נחשבים רקע העכבר האופטימלי לחקר חסינות מולדת עקב תגובת העיקום וחזקה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחברים מודים למכללה האזורית VA-MD ברפואת וטרינרית למתן תמיכת ליבה וטכנית עבור פרויקט זה. עבודה זו נתמכת על פיתוח קריירה פרס NIH (K01DK092355) על ידי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C57Bl/6Jמלאי מעבדת ג'קסון000664
קומפקטי בקנהמידה Ohaus Scale Corporation71142845
מדחום רקטלי לבעלי חיים קטניםBraintree ScientificTH 5
בדיקה רקטלית למכרסמיםBraintree ScientificRET 3
Ear PunchBraintree ScientificEP-S 901
ליפופוליסכריד מ-E. coli 0111:B4InvivoGenLPS-EB
1x Phosphate Buffered SalineLife Technologies10010-023
איזופלורןבקסטר40032609
מתן תוך-קנה ודוכן ניפוח ריאותICAP ייצורn/a
מעמד אינטובציה למכרסמיםBraintree Scientificמספריים RIS 100
(קהה/חד)פישר סיינטיפיק13-806-2
מלקחיים (ישר)פישר סיינטיפיק22-327-379
מלקחיים (45º, מעוקל)פישר סיינטיפיק10-275
מספריים (קהה/בוטה)פישר סיינטיפיק08-940
פיפטה (200 ומיקרו; l קיבולת)גילסוןF123601
אתנולסיגמא459844
1 מ"ל מזרקBD רפואי301025
10 מ"ל מזרקBD רפואי301604
27 גרם x 0.5 במחטBD רפואי305109
מיקרוצנטריפוגה מקוררתפישר סיינטיפיק13-100-676
צינורית קנה הנשימה 1.2 מ"מ עם מתאם לוארמנגנון הרווארד 732836
תמיסת מלח מאוזנת של האנקטכנולוגיות חיים14025-076
4-0 תפר כירורגי קלוע משיEthiconA183
ערכות מחבר לואר לצינורהרווארד מכשיר721406
ערכת Luer Stopcockמכשיר הרווארד 721664
Tygon Formula E-3603 צינורות מעבדהSigmaR-3603
תמיסת פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%SigmaHT501128-4L
עכבר IL-1β OptEIA ELISA KitBD Biosciences559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA KitBD Biosciences550950
עכבר TNF-α OptEIA ELISA KitBD Biosciences560478
HemocytometerHausser Scientific3520
Hemocytometer כיסוי משקפייםThermo Scientific22-021-801
Trypan BlueThermo ScientificSV3008401
Cytology Funnel ClipsFisher Scientific10-357
Cytology FunnelsFisher מדעי10-354
כרטיסי סינוןפישר סיינטיפיק22-030-410
מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-544-1
כיסוי משקפייםפישר סיינטיפיק12-540A
ציטוספין ציטוצנטריפוגהתרמו סיינטיפיקA78300003
Diff ערכת צביעה מהירהפישר סיינטיפיק
הרכבה בינוניתפישר מדעיSP15-500
47733150

מקורות

  1. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
  2. Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
  3. Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164(2012).
  5. Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
  6. Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
  7. Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
  8. Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
  9. Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
  10. Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
  11. Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
  12. Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

LPS
הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.