מאמר שיטה

בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial

69.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51411

⸱

27 במרץ 2014

 , 
1Forage-Animal Production Research Unit, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture

במאמר זה

סיכום

שיטות מתוארות להפרדת chromatographic בשכבה דקה (TLC) של תמציות צמחים וbioautography קשר לזהות מטבוליטים אנטי בקטריאליים. השיטות מיושמות להקרנה של תרכובות פנוליות תלתן אדומים עיכוב חיידקים מייצרי אמוניה היפר (HAB) יליד המסס השור.

תקציר

מסך משותף לתרכובות מיקרוביאלית צמח מורכב של הפרדת תמציות צמחים על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC), חושפת את chromatograms להשעיות של חיידקים (למשל פטריות או חיידקים במרק או אגר), ומאפשרים זמן לחיידקים לגדול ב סביבה לחה, באופן חזותי אזורים ללא התפתחותם של חיידקים. היעילות של שיטת הקרנה זו, הידועה בשם bioautography, תלויה הן באיכות של הפרדת chromatographic והטיפול נלקח בתנאי תרבות של חיידקים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים עבור TLC וbioautography מגע עם יישום חדשני לאמין חיידקי תסיסת חומצה. התמצית מופרדת על צלחות TLC סיליקה (מגובות אלומיניום) גמישות, ולהקות הם דמיינו תחת אור אולטרה סגול (UV). אזורים הם לגזור וטופחו על פנים על אגר מחוסן עם מיקרואורגניזם הבדיקה. להקות מעכבות הם דמיינו ידי מכתימים את הצלחת אגרים עם tetrazolium אדום. השיטה מיושמת להפרדה של תלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland) תרכובות פנוליות וההקרנה שלהם לפעילות נגד sticklandii Clostridium, חיידק היפר לייצור אמוניה (HAB) כי הוא יליד המסס השור. שיטות TLC תחולנה על סוגים רבים של תמציות צמחים ומיני חיידקים אחרים (אירוביים או אנאירובי), כמו גם פטריות, ניתן להשתמש בם כיצורי מבחן אם תנאי התרבות שונו כדי שיתאימו לדרישות הצמיחה של המינים.

מבוא

מנסה לאמוד עבור תרכובות מיקרוביאלית בצמחים דורש הפרדת המרכיבים של תמצית צמח, חושף מיקרואורגניזם בדיקה לרכיבים אלה, וקביעה אם הצמיחה של מיקרואורגניזם הוא מעוכב על ידי כל אחת מהתרכובות. הפרדות על ידי נייר או כרומטוגרפיה בשכבה דקה (PC או TLC) הן נוחים, כי תרכובות רבות יכולות להיות מופרדות על משטח מישורי. הפרדה מבוססת על קוטביות, עם כמה תרכובות מחייבות בחוזקה לבעלי כושר ספיגה (תאית במקרה של מחשב, ועוד מגוון של חומרי ספיחה במקרה של TLC) ונודדות פחות מאחרים 1. איור 1 מספק דוגמא למיקומים היחסי של תרכובות פנוליות קוטב ופולרי לאחר הפרדה על צלחת TLC סיליקה.

figure-introduction-1
איור 1. דיאגרמה המדגימה הפצות של תרכובות של קטבים שונים לאחר הפרדה על chromatographic דק שכבה סיליקה צלחת (TLC). תרכובות פנול של תלתן אדום (Trifolium pratense L.) משמשות כדוגמא. תרכובות קוטביות, כגון clovamide, יש זיקה חזקה עבור בעלי כושר ספיגה קוטביים כמו סיליקה ולהישאר קרובים למקור (OR), ואילו תרכובות קוטביות פחות, כגון שלושה איזופלבונים קרובים לחזית הממס (SF), מחיצה יותר בקלות לממסים (שהם פחות קוטביים מסיליקה, אלא אם כן מים, חומצות, בסיסים או כלולים) ולהעביר הלאה את הצלחת.

לאחר ההפרדה של תמצית על צלחת TLC, יכולים להיחשף מיקרואורגניזמים מבחן לכל התרכובות על הצלחת, ובכך להאיץ את זיהוי של הרכיבים הפעילים של תמצית 2. אם תרבות פטרייתי או חיידקים חשופה להכרומתוגרמה, התפתחותם של חיידקים תתרחש בכל מקום פרט מעל אזורים עם צמיחת מעכביםתרכובות y. אזורים של עיכוב לאחר מכן ניתן לראות על ידי הניגוד בין צמיחת mycelial והאזורים ללא צמיחת פטריות אם כבר הוחלו 3 או על ידי ריסוס עם חומרים שמשנים את צבעם כאשר מופחת או הידרוליזה על ידי תאי חיים 4. למרות שימוש chromatograms נייר או בשכבה דקה למבחנים מיקרוביאלית יושם לראשונה לאנטיביוטיקה 5 וקוטלי פטריות 3,6, תמציות צמחים נמצאות כעת בתדירות גבוהה לגילוי תרכובות מיקרוביאלית בשיטה זו, המכונים לעתים קרובות bioautography. הפרוטוקולים שתוארו לעיל חלים על bioautography של chromatograms בשכבה דקה. TLC נעשה שימוש נרחב בגלל זה הוא מהיר יחסית ויכול להתבצע על חומרי ספיחה שונות (לדוגמא: סיליקה, עמילן, אלומינה), כמו גם לספק רזולוציה טובה ורגישות 1.

ניתן להכין תמציות צמחים לTLC בדרכים רבות. שיטות נפוצות כוללות חומר צמחי חילוץ בALCתערובות ohol מים כגון 80% אתנול 7,8, אולי עם התוספת של חומצה או בסיס 9. בעקבות מיצוי בממסים כאלה, המכילים מעט מים והם אולי חומצי או בסיסיים, תמציות חייבת להיות מרוכזות, כך שהם יכולים להיות מיושמים על צלחות TLC בנפח מינימאלי. הריכוז של תמציות אלכוהול מים יכול להיות מושגת על ידי החלוקה עם ממסים אורגניים במים immiscible 8 או בתערובת של ממסים כאלו, כגון אתר אתיל אצטט, אתיל (1:1, V / V) 10,11. מטבוליטים שונים של צמחים המחולצים לממסים אורגניים שונים, בהתאם לקוטביות שלהם. כדי להבטיח כי חומצות אורגניות צמח או בסיסים המחולצים לממסים אורגניים, בשלב זה, ה-pH של תמצית אלכוהול מים יכול להיות עלה או מונמכת עם חומצה מסיס במים או בסיס להמיר analytes ניתק לצורות nondissociated, אשר לאחר מכן מסיס בממסים אורגניים ניטראליים 9. לאחר מכן השלב האורגני יכול להיות דוארvaporated תחת לחץ מופחת או תחת חנקן ומותאם להיקף הרצוי עבור TLC. ה-pH של התמצית לא סביר שיהיה קטלני למיקרואורגניזמים מבדק בשל המחיצות של analytes לממסים ניטראליים, נפח סופי קטן, ואידוי של התמצית על צלחת TLC לפני ההפרדה.

פטריות וחיידקים שניהם מועסקים כמיקרואורגניזמים מבחן בbioautography של תמציות צמחים 2. נבגים של פטריות מסוימות, כגון cucumerinum Cladosporium, לנבוט על צלחות TLC (מלבד אזורים עם תרכובות מעכבות) אם ריססו על צלחות בפתרון תזונתי וטופחו בסביבה לחה במשך כמה ימים 3. התפטיר האפל של ג cucumerinum באזורי noninhibitory מספק ניגוד חריף לאזורים ללא צמיחה mycelial. למרות שחיידקים יושמו לכרומטוגרפיה בשכבה דקה צלחות (TLC) באותו אופן 4,12, חיידקים הם גם שפכו על TLCמשטחי צלחת אגרה שכבות 13,14. שמרים, כמו קנדידה אלביקנס, יכולים להיות מיושמים בשכבות אגר כמו גם 14. לחלופין, ניתן להציב צלחות TLC עם פנים כלפי מטה על גבי אגר מחוסן עם חיידקים או שמרי 10,15 8, בשיטה המכונה קשר bioautography 2.

אנו מתארים שיטה לbioautography מגע מסך עבור תרכובות פנוליות מיקרוביאלית מתלתן אדום (Trifolium pratense קורות חיים. Kenland). מיקרואורגניזם המבחן הוא sticklandii Clostridium, חיידק כרס היפר לייצור אמוניה (HAB) ולחייב anaerobe. למרות הפרדות שימוש אינן פותרות את כל הרכיבים של התמצית, הם להקל על זיהוי של אזורים של פעילות מיקרוביאלית, ובכך מצמצם את הבריכה של תרכובות מיקרוביאלית אפשריות. הפרוטוקול מנצל נהלים סטנדרטיים ל1 TLC. הפרוטוקול מתאר גם כמה הטכניקות הנדרשות לobli culturingאנאירוביים שער עבור assay כגון, שימוש בקשר bioautography 15 ושיטת הדמיה עם מלח tetrazolium, אשר כתמי תאי חיים 2,4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תמצית צמח

  1. ראה קגן וFlythe 10 להפקת תרכובות פנוליות מקורות חי pratense Trifolium. Kenland.
  2. כדי לחלץ תרכובות אחרות בצמחים אחרים, בדוק את ספרות ניתוח Phytochemical לשיטות מיצוי צמחים או המטבוליט ספציפי (רבים מתוארות), או לחפש פרוטוקולים כגון אלה של חוראם et al. 7,8 שבודד תרכובות רבות עם רחב מגוון רחב של קטבים.

2. הכנת לוחות דק שכבה

  1. צלחות TLC נקיות על ידי פיתוח בממסים קוטביים, ניטראליים אחד או יותר, על מנת להתרחק מהאזור של פיתוח המזהמים adsorbed.
    1. במנדף קטר, להכין מספיק ממס ניקוי (למשל 15-100 מיליליטר של 2:1 יצטט מתנול אתיל, V / V) כדי לכסות את החלק התחתון של חדר פיתוח TLC, כמו גם את הקצה התחתון של צלחת TLC כאשר סט בתוך החדר.
    2. השתמש commerזכוכית זמינה cially TLC פיתוח תאים (בגדלים שונים זמינים, עם מכסים) או כוסות פיירקס מכוסה בנייר כסף או צנצנות שימור.
    3. השתמש במספריים כדי לחתוך אלומיניום או צלחות בציפוי פלסטיק (גמישות) סיליקה ג'ל, המגיעים בגדלים שונים (סנטימטר וקטן יותר 20 x 20 סנטימטר), כדי שיתאימו לתא פיתוח זמין. (זהירות: סיליקה יכולה לגרום נזק לריאות אם בשאיפה לעבוד במנדף, ולהתמודד עם צלחות TLC עם כפפות כדי להימנע מקבלת שמני עור על גבי סיליקה..)
    4. הכנס את הצלחות לתוך התא, עם צמרות נשענו על קירות החדר. צלחות לא צריכים לגעת זה בזה. כסה את החדר ולתת לי הממס להזיז את הצלחת על ידי פעולת נימים.
    5. כאשר הממס הגיע לחלק העליון של הצלחות, להסיר צלחות מהחדר ולסדר בעמידה בתוך מנדף עד הממס התאדה.
    6. בדקו אם זיהומים היגרו בחלק העליון של צלחת TLC ידי מחפש להקה צהובה מתחת לעיןאור אור, או להקת ניאון מתחת לאולטרה סגול (UV) (ראה "מול הטומאה", או אם באיור 2 ב). אם הרוב של הצלחת עדיין יש גוון צהבהב, חזור על תהליך הניקוי.
    7. לאחר הסרת צלחות TLC מהאולם, לבטל את הממס. לאפשר ממס שיורי להתאדות לחלוטין לפני השימוש בחדר לפרוטוקול 2.
    8. כדי להסיר את הלחות שיורית שיכול להשפיע על הגירה של תרכובות על סיליקה 16, לתמוך הצלחות זקופות בתנור ייבוש ב100 ° C (10-15 דקות ל20 סנטימטר x 20 צלחת סנטימטר, ו -5 דקות ל7 ס"מ X 10 צלחות סנטימטר ).
    9. אם תנור ייבוש 100 ° C אינו זמין, צלחות חום לתקופה ארוכה יותר של זמן בטמפרטורות נמוכות יותר (כלומר 40 דקות על 60 מעלות צלזיוס).
    10. לאחר הצלחות יבשות, תן להם להתקרר לטמפרטורת סביבה לפני הטעינה.

3. הכנת פיתוח צ'יימברס להפרדת חלץ

  1. השתמש במספריים כדי לחתוך פיסת נייר סינון מעט מתחת לתא גובה, וכמחצית למתחם קאמרי ברוחב. מאמר זה משמש כפתילה לצייר ממס עד קיר החדר ולהרוות את החדר עם אדי חומר, ובכך לשפר את שחזור של הפרדות 1.
  2. במנדף, לערבב ממסים (אתיל אצטט, מתנול 4:1, V / V, למחקר זה). יוצקים את תערובת ממס לתוך החדר ולכסות. חכה עד שכל הפתיל הוא רטוב עם ממס, מה שמעיד תא לחץ, לשים את הצלחות לתוך תא.

4. טעינה ופיתוח של צלחות TLC

  1. קל לסמן את מוצאם עם עיפרון. אם בעלי כושר ספיגה צלחת TLC הוא רך ובקלות פגומה, להפוך את הסימנים בקצוות. תרכובות צריכה להיות מעל פני השטח של ממס הפיתוח כאשר צלחות מוכנסות לתוך תא TLC.
  2. ממיסים תמציות במספיק ממס אורגני (במקרה זה, מתנול) יש פתרון מרוכז במקום עכורהשעיה.
  3. דגימות עומס וסטנדרטים כמו להקות צרות עם מזרק microliter או micropipettes נימים, משאירים גבול 1 סנטימטר בצדדים של הצלחת. לאפשר ללהקות לייבוש (מלבה את הצלחת או טוען אותו במנדף עוזר).
  4. אם ריכוז גדול יותר של מדגם יש צורך בצלחת, "overspot" על ידי דגימות טעינה שוב בלהקות מיובשות.
  5. עם מלקחיים או מלקחיים, הניח את הצלחת (ים) בתוך חדר TLC הרווי. צלחות לא צריכים לגעת בפתיל כי זה עשוי לספק ממס לצלחות בנקודות מגע, ובכך לשנות את נתיב הגירת מתחם. כסה קאמרי ולתת צלחות להתפתח.

5. הכנת צלחות למבדק

  1. הסר את הצלחת (ים) מיכל TLC לפני מול הממס מגיע העליון של הצלחת, ולסמן את הגובה של חזית הממס בעיפרון. בואו יבש צלחת במנדף.
    1. לפתח כל צלחות TLC שנותרו באותו התא TLC, שזה generally שמיש עבור כל יום אם כל הזמן סגור. מהדורה מחודשת תערובת ממס עבור חדר TLC אם כמות הממס בתא יורדת בעיקר.
  2. לאחר הצלחות יבשות, לדמיין להקות תחת אור הנראה או UV, ולהתוות להקות בעיפרון. תא צפייה עם מנורת UV ניידת הוא נוח, במיוחד אם את המנורה יכולה לזהות תרכובות בשני 254 ננומטר (UV בגלים קצרים) ו365 ננומטר (UV גל ארוך).
    הערה: בשלב זה או לאחר השלב הבא, יכולות להיות עטופים צלחות בניילון נצמד, מכוסות בנייר כסף, ומאוחסנות ב -20 ° C. זמן אחסון מרבי תלוי ביציבות תרכובת. בגלל סיליקה אינה ניטראלית, כמה תרכובות עלולות לבזות ואילו על צלחת TLC.
  3. לצלם או לצייר צלחות.
    1. השתמש במערכת photodocumentation ג'ל אם אחד מצויד בUV תקורה ו / או אורות גלויים הוא זמין.
    2. אם אין מערכת photodocumentation מסחרית זמינה, צלחות צילום בתוך קופסא מרופדת בנייר או בד כהה, wiה להגדיר את המצלמה על חצובה ואור UV נייד מהודק לטבעת לעמוד 17. כאשר מצלמים צלחות שאין להן חיווי ניאון, השתמש במסנן אור כחול על עדשת המצלמה כדי לשפר את המראה של להקת 17.
  4. כדי לסייע באפיון להקות, לחשב גורם שימור (ו R) ערכים על ידי מדידת מרחקים נסעו במתחם וחזית ממס, וחלוקה לשעבר על ידי (איור 2 א) האחרון.

6. חיידקי תרבות וAssay

  1. להכין ולחסן תקשורת בתנאים אנאירוביים. התרבות משמשת במקרה זה הייתה SR Clostridium sticklandii המתח, אשר התקבל מאוסף התרבות של ג'יימס ב 'ראסל, אוניברסיטת קורנל, איתקה, ניו יורק.
    1. ראה Flythe ו13 קגן ורשימת החומרים לתיאור תקשורת HAB.
  2. לגדול התרבות לשלב מעריכי או נייח. השתמש techniqu אנאירובי סטריליes כאשר עובד עם מיקרואורגניזמים אנאירובי.
  3. לחסן התרבות (1% V / V) לתוך אגר מותך לאחר הטמפרטורה של אגר (0.75% w / v) ירד ל פחות מ 60 ° C. מערבבים בעדינות ולהביא מייד לחדר אנאירובי (95% H CO 2 -5% 2 אווירה לתקשורת HAB) לשפוך.
  4. יוצקים לתוך 15 מ"מ x 100 צלחות פטרי פלסטיק מ"מ, ומאפשר לחזק.
  5. עם מספריים, לחתוך את צלחת TLC לאזורים המכילים להקה (ים) של עניין. הנח להקות עם הפנים כלפי מטה על גבי צלחות אגר, לציון להקות בגיבוי הצלחת כדי לעקוב אחר כיוון המקורי על צלחת TLC. הנח רצועת TLC שאינו בשימוש על גבי צלחת אגר כביקורת.
  6. דגירה צלחות אגר, אגר צד למטה, בתא אנאירובי (שעה 24, 39 מעלות צלזיוס).

7. ויזואליזציה של צלחות Bioassayed אגר

  1. עם מלקחיים, להסיר להקות מצלחות אגר בזמן שהם בתא אנאירובי.
  2. להוסיף 1% (w / v) teאדום trazolium, שהוכן במים, dropwise על גבי המשטחים של הצלחות אגר. לאפשר את הצבע לפתח לפחות 20 דקות, או עד שצלחת השליטה הופכת לאדומה לגמרי, לפני הסרת מתא אנאירובי. החיידקים אנאירוביים יתחילו לאבד את יכולת הקיום מייד לאחר ההסרה מתא אנאירובי, אבל הצבע הוא יציב יותר מ24 שעות.
  3. לצלם מתחת לאור הנראה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרדות TLC סיליקה נציג של תלתן אדום תמציות (CV pratense Trifolium. Kenland), המכילים תרכובות פנוליות, מוצגות באיור 2. הפרדה של תמצית תלתן אדומה ביצטטו-הקסאן אתיל (9:01, v / v), מעל 8.5 סנטימטר, הביא חמש להקות, (איור 2 א) אחד חלקי נפתר מהמקור. עם זאת, איור 2 מראה כי להקות על כפליים נחשפו כאשר מדגם של תמצית תלתן אדומה (מאותו הזן, אבל גדלו בחלקה נפרדת באותו המשק) שונה הופרד על פני מרחק גדול יותר (15 סנטימטר במקום 8.5 סנטימטר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להפרדת תמצית לתוך תת קבוצות של תרכובות ומנסים לאמוד תת אלה על ידי bioautography ליצירת קשר. השיטה די דומה לזו ששמשה את Chomnawang et al. 15 למסך למטבוליטים צמח מעכבים לחיידקי גורמי זיבה. הסוג של bioautography המועסק מסך לתרכובות צמחים מיקרוביאלית תלוי בגורמים רבים, כולל בקטריה הבדיקה, התקנת המעבדה, ואת ההעדפות של האדם (ים) ביצוע המבדק. bioautography לתקשר, השיטה המשמשת במחקר זה, זכה לביקורת על תלוי ביכולת של מתחם כדי לפזר לתקשורת מחו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות. המחברים מצהירים שום אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

אנו מודים לד"ר הנור טיילור המנוח, מח' צמח ומדעי קרקע באוניברסיטת קנטאקי, על שאפשרת לנו להשתמש בדגימות מחלקות התלתן האדומות שלו למחקר זה. פרויקט זה מומן על ידי ארצות הברית מחלקת החקלאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סיליקה F254 לוחות TLC, עם גיבוי אלומיניום, עובי 0.2 מ"מ, 20 ס"מ x 20 ס"מEMD Chemicals5554/7לוחות אלה מצופים בסיליקה המכילה מחוון פלואורסצנטי ב-254 ננומטר. תרכובות הנספגות באורך גל זה נראות כהות על רקע ירוק פלואורסצנטי. מקורות חלופיים כוללים את Analtech, Selecto Scientific, Fluka.  ייתכן שיהיה צורך בחומרים סופחים שאינם סיליקה.  צלחות עם גב פלסטיק עשויות להתאים, בהתאם לממיסים שבהם יש להשתמש. 
מספריים חדים וכבדים כל חברת אספקת תפירההדומה ל-Fiskars 175800-1002לחיתוך לוחות TLC.  ניתן להשתמש גם בחותך נייר עם להב חד.  אין לשאוף אבק סיליקה.
תנור ייבוש ב-100 מעלות; C (הסעה מכנית)Thermo ScientificPR305225MQuincy Lab, Inc, שיקגו, אילינוי (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, הילסבורו, אורגון (www.cascadetek.com)
TLC chamberKimble Chase416180-0000מקורות חלופיים:  אולדריץ'. ניתן להשתמש בכוסות פיירקס או צנצנות שימור לצלחות קטנות (כלומר 5 ס"מ על 10 ס"מ). מכסים בנייר אלומיניום (מכסי צנצנות עשויים להכיל חומר הניתן לחילוץ על ידי אדי ממס).
50 ומיקרו; l מזרק עם קצה מחט שטוחהמילטון80965לטעינת כמויות סטנדרטיות או מדגם העולות על 5-10 µl.  מקורות חלופיים שווי ערך.
מיקרופיפטותדראמונד2-000-001להעמסת כמויות קטנות של תקנים או דוגמאות.  מקורות חלופיים:  VWR.  כמו כן, ניתן למתוח את פיפטות פסטר לקוטר דק יותר עם לפיד בוטאן.   
נייר סינון (כיתה #1)Whatman1001 917משמש כפתיל.  ציונים אחרים של נייר סינון הם בסדר.  ניתן לקצץ גודל זה לתאים המכילים צלחות בגודל 20 ס"מ על 20 ס"מ.      
מלקחיים של כוסותפישר סיינטיפיק15-186להכנסת צלחות פנימה והחוצה מתא TLC גדול.  מקורות חלופיים: VWR 
מלקחיים שטוחיםפישר סיינטיפיק10-275להכנסת צלחות לחדר קטן והחוצה ממנו. מקורות חלופיים: VWR
מנורת UV ניידת קטנה עם נורות 4 W או 6 W לתאורת אור UV בגלים קצרים וארוכים, (254 ו-365 ננומטר, בהתאמה)מוצרים אולטרה סגולים95-0271-01מקורות חלופיים: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
ארון צפייה לשימוש עם מנורת UV כף ידמוצרים אולטרה סגוליםChromato-Vue C-10Eרצועות פעילות UV מוקפות ביתר קלות אם ניתן להציב כאן לוחות. מקורות חלופיים: Spectronics Corporation. 
מערכת תיעוד צילום עם מנורת UV עילית ומנורה גלויהקודאקג'ל לוג'יק 200  מקורות חלופיים: מוצרים אולטרה סגולים (www.uvp.com).  ראה פרוטוקול לחלופה תוצרת בית.
תא אנאירובי, סוג A, וינילקוי7150000תא זה מתאים לחיידקים אנאירוביים, כמו Clostridium sticklandii, כמתואר.   עם זאת, תנאי הגידול חייבים להיות מותאמים לאורגניזם המשמש בבדיקה.  יש לנקוט בארון בטיחות ביולוגית ואמצעי זהירות אחרים אם משתמשים באורגניזמים פתוגניים. מקורות חלופיים: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, אחרים 
Tetrazolium redSigma-AldrichT8877מקורות חלופיים: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
Ingredients for HAB media
Pyridoxamine · 2HClSigma-AldrichP9380עבור זה ועבור כל הריאגנטים האחרים בטבלה זו, מקורות חלופיים שווי ערך.
ריבופלביןסיגמא-אולדריץ'R4500
תיאמין הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'T3902
ניקוטינאמידסיגמא-אולדריץ'N3376
סידן D-פנטותנטסיגמא-אולדריץ'C8731
חומצה ליפואית סיגמא-אולדריץ'T5625
עם חומצה אמינו-בנזואית סיגמא-אולדריץA9878
חומצה פוליתסיגמא-אולדריץ'F8798
ביוטיןסיגמא-אולדריץ'B4639
קובלמין סיגמא-אולדריץ'C3607
פירידוקסל הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'P9130
פירידוקסיןסיגמא-אולדריץ'P5669
EDTAסיגמא-אולדריץ'E6758
ברזל גופרתי · 7H2OSigma-AldrichF8263
אבץ גופרתי · 7H2OSigma-AldrichZ0251
מנגן כלוריד · 4H2OSigma-AldrichM8054
חומצה בוריתSigma-AldrichB6768
קובלט כלוריד · 6H2OSigma-AldrichC8661
נחושת כלוריד · 2H2OSigma-Aldrich
459097 ניקל כלוריד · 6H2Oסיגמא-אולדריץ203866
נתרן מוליבדט · 2H2OSigma-Aldrich331058
Trypticase (עיכול לבלב של קזאין)Thermo FisherB11921
אשלגן פוספט חד בסיסיThermo FisherP284
נתרן פחמתי ומידות; H2O תרמו פישרS636
אגרתרמו פישר50841063
מגנזיום גופרתי · 6H2Oתרמו פישר7791-18-6
סידן כלורי · 2H2Oתרמו פישרBP510
ציסטאין HClתרמו פישר19464780
אשלגן פוספט דו-בסיסי נטול מיםתרמו פישרP290
נתרן כלוריתרמו פישרBP358
' ' נטול מים

מקורות

  1. Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
  2. Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
  3. Homans, A. L., Fuchs, A. Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances. J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.
  4. Lund, B. M., Lyon, G. D. Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms. J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).
  5. Betina, V. Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field. J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).
  6. Weltzien, H. C. Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm. Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).
  7. Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique. Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).
  8. Khurram, M., et al. Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).
  9. Robinson, T. The Organic Constituents of Higher Plants. , Burgess Publishing Co. (1963).
  10. Kagan, I. A., Flythe, M. D. Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium. Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).
  11. Mattila, P., Kumpulainen, J. Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection. J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).
  12. Hamburger, M. O., Cordell, G. A. A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity. J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).
  13. Flythe, M., Kagan, I. Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii. Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.
  14. Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants. Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).
  15. Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract. J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).
  16. Stahl, E., Kaldewey, H. Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate. Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.
  17. Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola. J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).
  18. Kline, R. M., Golab, T. A simple technique in developing thin-layer bioautographs. J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).
  19. Wedge, D. E., Nagle, D. G. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).
  20. Beck, A. B., Knox, J. R. The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover. Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).
  21. Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum. Plant Physiol. 115 (4), (1997).
  22. Peterson, C. A., Edgington, L. V. Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique. J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TLCClostridium sticklandii

מאמרים קשורים