Method Article

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

DOI:

10.3791/51416

⸱

July 1st, 2014

 , 
1CEA, DSV, IG, Genoscope, 2CNRS-UMR8030, Évry, France, 3Université d'Évry Val d'Essonne, 4Massachusetts General Hospital Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג איזוטופ היציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא שיטה לכמת במדויק הבדלי ביטוי חלבון בין דגימות באמצעות ספקטרומטר מסה. תיוג רדה מבוצע באמצעות אחת רגיל (אור) או בצורות deuterated (כבדות) של cyanoborohydride פורמלדהיד ונתרן להוסיף שתי קבוצות מתיל לכל אמין בחינם. כאן אנו מדגימים פרוטוקול חזק לתיוג רדה והשוואה כמותית של תערובות חלבונים מורכבות. דגימות חלבון לשם השוואה מתעכלים לפפטידים, שכותרתו לשאת אור או תגי תיל כבדים, מעורב, ושיתוף נותח על ידי LC-MS/MS. שכיחותם חלבון יחסית הן לכמת על ידי השוואת אזורי שיא הכרומתוגרמה יון של גרסאות כבדות וקלות שכותרת של הפפטיד המכונן שחולץ מן MS הספקטרום המלא. השיטה המתוארת כאן כוללת הכנת מדגם על ידי מיצוי שלב מוצק התהפך שלב, תיוג רדה על הטור של פפטידים, חלוקה פפטיד ידי Rev-pH הבסיסיכרומטוגרפיה ersed-שלב (BPRP), וטיהור פפטיד StageTip. אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של תיוג רדה ביחס לשיטות אחרות לשילוב איזוטופ יציב. אנו מדגישים יישומי רומן באמצעות תיוג רדה כשיטת מהירה, זולה, ומדויקת כדי להשוות שכיחותם חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידת הבדלי ריכוז של חלבונים רבים בין דגימות מורכבות היא אתגר מרכזי בפרוטאומיקה. יותר ויותר, זה נעשה על ידי תיוג חלבונים בכל דגימה עם תגי איזוטופים שונים, המשלב דגימות, ובאמצעות ספקטרומטריית מסה לכמת הבדלי ריכוז. מספר שיטות קיימות לתיוג איזוטופי יציב של חלבונים ופפטידים. 15 N תיוג 1 וSILAC 2 להציג תוויות איזוטופי מטבולית in vivo, ואילו 3 ICAT, 4 iTRAQ, וdimethylation ההפחתה 5 להוסיף תגיות איזוטופ יציבים לאחר מיצוי חלבון ועיכול. בין השיטות הללו, dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא צובר פופולריות כמו שיטה זולה, לשחזור לכמת הבדלי ריכוז חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.

תיוג רדה כרוך פפטידים מגיבים עם פורמלדהיד כדי ליצור בסיס שיף, אשר לאחר מכן מצטמצםעל ידי cyanoborohydride. תגובה זו dimethylates קבוצות אמינו חופשיות ברשתות N-Termini והצד ליזין וmonomethylates prolines N-מסוף. הפרוטוקול המתואר כאן methylates פפטידים במדגם 1 עם תווית "קלה" באמצעות ריאגנטים עם אטומי מימן בתפוצתם הטבעית איזוטופי ומדגם 2 עם תווית "כבדה" באמצעות פורמלדהיד deuterated וcyanoborohydride (איור 1). כל קבוצת אמין dimethylated על תוצאות פפטיד בהבדל המוני של 6.0377 דה בין אור וצורות כבדות, אשר מועסקות להבחין בין שתי צורות באמצעות ספקטרומטר מסה. באופן ספציפי, שכיחותם היחסית פפטיד הן לכמת כיחס בין אזורי הכרומתוגרמה יון MS1 חילוץ (יחס אזור שיא MS1) של אור והגרסה כבדה לכל זוג יונים פפטיד. השפע היחסי של חלבון מחושב כיחס אזור שיא MS1 החציוני בין כל פפטידים בחלבון. בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול חזק על התנהגותing ניסויי תיוג רדה ידי LC-MS/MS הכולל חילוץ התהפך שלב פפטיד מוצק שלב, תיוג רדה על עמודות, חלוקה פפטיד על ידי pH הבסיסי התהפך שלב כרומטוגרפיה (BPRP), וטיהור של תערובות הפפטיד באמצעות StageTips (איור 2) . אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של שימוש בתיוג רדה לפרוטאומיקה כמותית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: שיטה זו תוארה 12 בעבר.

1. בידוד חלבון

הכן 1 מ"ג של חלבון תאי על ידי תאי lysing, רצוי בשיטות פיזיות, כגון עיתונות צרפתית, מכות חרוז, או sonication. הימנע תמוגה תא בתיווך ליזוזים כי האנזים לבלבל מדידות ספקטרומטריית מסה.

2. רטיבות TCA של חלבונים

הוספת חומצת 1 נפח trichloroacetic (TCA) לחלבון 4 כרכים ומקררים על קרח דק 10 כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של אצטון קר כקרח וצנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ולהפוך את הצינור על הספסל כדי לייבש את גלולה ל15 דקות. כדורי חלבון חנות ב -80 ° C.

3. חלבונים לפגל וצמצום חוב דיסולפיד

Reלהשעות את החלבונים ל~ 2 מ"ג / מיליליטר ב500 denaturation μl וחיץ ירידה (או אוריאה 4 M או 3% SDS ב50 HEPES מ"מ pH 8.5, 5 מ"מ DTT). לחלופין, כולל מעכבי פרוטאז במאגר. דגירה חלבונים ל30 דקות ב56 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות בטמפרטורת חדר.

4. Aklylate קבוצות sulfhydryl חינם לשבש גיבוש דיסולפיד בונד באופן בלתי הפיך

הכן iodoacetamide 0.3 M הטרי במים. זהירות! Iodoacetamide הוא רעיל ביותר. הוסף 25 μl 0.3 M iodoacetamide (ריכוז סופי 15 מ"מ) ל500 חלבון μl ודגירה של 20 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. להרוות iodoacetamide ידי הוספת 10 μl של 300 מ"מ DTT (5 מ"מ ריכוז DTT סופי). אחסן את חלבוני alkylated ב -80 ° C.

5. עיכול חלבון

TCA לזרז חלבונים (כפי שמתואר בשלב 2) ו resuspend ב 1 מיליליטר של 50 HEPES מ"מ (pH 8.2), האוריאה ז 1. הכן פתרון מניות של endoprotein LysylASE (יס-C) במים בריכוז של 2 מיקרוגרם / μl ולהוסיף 5 μl לפתרון החלבון. דגירה את התערובת ל16 שעות בטמפרטורת חדר. להבטיח את הריכוז ליס-C הסופי הוא 10 ng / μl ויחס חלבון לLysC (w / w) הוא 1/50 עד 1/200. Resuspend 20 טריפסין הכיתה רצף מיקרוגרם ב40 μl של 50 מ"מ חומצה אצטית, להוסיף 5 μl (10 מיקרוגרם טריפסין) כדי לעכל יס-C, ודגירה במשך 6 שעות ב 37 ° C. להשתמש באותו ריכוז פרוטאז ויחסי פרוטאז לחלבון ליס-C כמשמש לטריפסין.

6. הפוך שלב פפטיד הפקה

  1. להפוך לחומצת פפטידים על ידי הוספת חומצת trifluoroacetic (TFA) לריכוז סופי של .0.5% (pH ≈ 2). צרף עמודת C18 לסעפת חילוץ. השתמש בקצב הזרימה הגבוה ביותר האפשרי עבור כל השלבים מלבד טעינה וelution של פפטידים.
  2. עמודה רטובה עם אצטוניטריל מיליליטר 6 (ACN). לשטוף טור עם 6 מיליליטר 80% ACN, TFA 0.1%, ולאחר מכן לאזן עם 6 מיליליטר 0.1% TFA. אל תאפשרעמודה לרוץ יבש בין שלבים.
  3. תפסיק לחץ ואקום ולטעון 500 מיקרוגרם של פפטידים על הטור בקצב זרימה של כ 1 מיליליטר / דקה. ברגע שפפטידים שנקשרים לעמודה, הוואקום מחדש ולשטוף עם 6 מיליליטר 0.1% TFA, ולאחר מכן עם 3 מיליליטר של חיץ חומצת לימון (0.09 M חומצת לימון, 0.23 M Na 2 HPO 4, pH 5.5).
    שים לב: יכולות להיות מתויגות כמויות פפטיד גבוהות אבל טור C18 מחייב קיבולת צריך להיות לפחות פי שתיים גבוהים יותר מכמות פפטיד כדי למנוע אובדן מדגם.

7. בעמודת פפטיד תיוג ידי Reductive Dimethylation (רדה תיוג)

לבצע שלב זה מתחת למכסת מנוע כימי כמו המימן ציאניד הוא שוחרר בריכוז נמוך במהלך תהליך התיוג.

  1. הכן 12 מיליליטר של ומאגרי "אור", "כבדים" רדה לmethylate אמינים פפטיד בחינם. חיץ רדו אור מורכב מפורמלדהיד 0.8% ו0.12 ​​M cyanoborohydride נתרן נשא מימנים בההפצות EIR טבעיות איזוטופי במאגר חומצת לימון. חיץ רדה כבד מורכב מ0.8% פורמלדהיד deuterated ו0.12 ​​M cyanoborohydride נתרן deuterated במאגר חומצת לימון.
  2. דגירה עמודה המכילה פפטידים על ידי הוספת 10 מיליליטר בהיר או חיץ רדה כבד לעמודות המכיל פפטיד בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה וחזור על מנת להבטיח תיוג מלא. טור לשטוף עם 6 מיליליטר 0.1% TFA ולאחר מכן עם 1 מיליליטר 0.5% חומצה אצטית.
  3. תפסיק ואקום וelute פפטידים שכותרתו ראשון עם 1 מיליליטר 40% ACN, 0.5% חומצה אצטית, ולאחר מכן עם 1 מיליליטר 80% ACN, 0.5% חומצה אצטית באמצעות קצב זרימה של כ 0.5 מיליליטר / דקה. אם תרצה, למדוד את יעילות התיוג של דגימות בודדות על ידי ספקטרומטריית מסה לפני הערבוב כבדה וקלות דגימות (ראה "נציג תוצאות"). מערבבים 01:01 דגימות פפטיד כבדות ושכותרתו אור כדי לכמת על ידי ספקטרומטריית מסה.

8. תערובת פפטיד נפרדת בשלב הבסיסי pH הפוך כרומטוגרפיה (BPRP)

pH הבסיסי התהפך כרומטוגרפיה שלב (BPRP) להפריד את תערובת פפטיד לשברים מרובים, אשר מנותחים באופן עצמאי על ידי LC-MS/MS להגדיל את כיסוי proteome.

  1. Fractionate תערובת פפטיד על עמודת C18-HPLC ידי יישום הדרגתי של ריכוז ACN גובר ב10 מ"מ אמוניום ביקרבונט (pH 8). התחל עם 5% (v / v) ACN למשך 5 דקות, להגביר 35% ACN ב60 דקות, ולאחר מכן ל90% ACN בדקות 1. לשמר את ACN 90% למשך 4 דקות לפני הפחתת ACN עד 5% מחדש לאזן את העמודה במשך 9 דקות. לאסוף 96 שברים של נפח שווה בצלחת 96 היטב (A1 לH12). לפקח על חלוקה באמצעות גלאי UV ב220 ננומטר ואילו פפטידים משחררי את הטור (10-70 דקות לתנאים שתוארו כאן).
  2. שלב את השברים מבארות A1, C1, E1, ו-G1 (A1 שבריר), מB1 בארות, D1, F1, וH1 (B1 שבריר), מבארות A2, C2, E2, ו G2 (A2 שבריר) ובהתאם ל שברים שנותרו. הסר את solvenלא באמצעות צנטריפוגות ואקום. פפטידים resuspend משברי A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11, ו-B12 ב130 μl של 1% urea/0.5 M TFA ולטהר באמצעות StageTips כמתואר בשלב 9. חנות שברים B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, וA12 ב -20 º C.

9. לטהר פפטידים על ידי להפסיק וללכת חילוץ (StageTips)

הכן 7 microcolumns C18-StageTip ידי אריזת 200 טיפים פיפטה μl עם שני C18 דיסקים עם קוטר פנימי (ID) של 1.07 מ"מ. שים טיפים שלב לתוך צינורות Eppendorf. השתמש microcentrifuge לשטוף טיפים עם 130 μl של מתנול, ולאחר מכן 130 80% ul ACN, 0.5% חומצה אצטית. לאזן StageTips עם 130 μl 0.1% TFA. העבר את תערובת פפטיד לStageTips ולשטוף עם 130 μl 0.1% TFA, אז 40 μl 0.1% TFA, אז 40 μl 0.5% חומצה אצטית. Elute פפטידים ראשון עם 20 μl 40% ACN, 0.5% חומצה אצטית, אז 20 μl 80% ACN, 0.5% חומצה אצטית. שלב eluatesnd יבש על ידי סינון ואקום.

10. LC-MS/MS microcapillary

  1. ממיסים פפטידים ב1-5 μl 5% חומצה פורמית, 5% ACN לריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl. לפתור ~ 1 מיקרוגרם פפטידים על 100 מיקרומטר × 20 סנטימטר עמודת HPLC שלב עם שיפוע של 6-22% ACN ב0.125% חומצה פורמית, התהפך C18 להחיל על 75 או 100 דקות בקצב זרימה של ~ 300 / דקות NL.
  2. לזהות פפטידים באמצעות LTQ Orbitrap ולוס 12 או פלטפורמה דומה נוזל כרומטוגרפיה מסת ספקטרומטריית עם ספקטרומטר מסת מתן ברזולוציה גבוהה ודיוק מסה גבוה. הפעל את ספקטרומטר מסת נתונים במצב תלוי עם מלאה MS סריקה (ברזולוציה של 60,000) שנרכשה במנתח Orbitrap. ליצור מלכודת היונים יניארי MS / MS ספקטרום ל20 יונים הנפוצים ביותר שזוהו בספקטרום MS המלא. הגדרת שליטה אוטומטית מטרות (AGC) עד 1 x 10 6 עבור MS המלא ו -2,000 עבור MS / MS. הגדר פעמים הצטברות יון המרביות ל1,000 אלפיות שנייםלטרשת נפוצה ו150 msec עבור MS / MS. תכלול יונים מבשר פפטיד מקוטעים מבחירה נוספת מ-MS / MS ל20-60 שניות.

11. MS / MS רכישת נתונים

לזהות פפטידים על ידי השוואת קבצי RAW MS / MS ספקטרום למסד נתונים תיאורטי עם אלגוריתם כגון SEQUEST 8 שימוש בפרמטרים (טבלת 1).

טבלה 1. חיפוש פרמטרים למסד פפטיד.

פרמטרים כלליים עיכול tryptic באופן מלא עם עד 2 החמיץ שסעים
25 סובלנות יון מבשר עמודים לדקה
1.0 סובלנות יון שבר דה
שינויי סטטי 57.02146 דה בציסטאין, carboxyamidomethylation
28.03130 דה בליזין ופפטיד N-הסופית, תווית dimethylation אור
שינויים דינמיים 15.99491 דה במתיונין, חמצון
6.03766 דה בליזין ופפטיד N-הסופית, תווית dimethylation כבדה
  1. פפטידים מסנן כדי 1% שיעור גילוי שווא עם שיטה כגון אסטרטגית 9 יעד דמה באמצעות מסד נתונים של מסגרות קריאה פתוחות באורינטציות בפועל והתהפכו.

12. פפטיד כימות

לחשב את התחומים כבדים וקלים זוגות MS1 חילוץ יון chromatograms (אזורי שיא MS1) ויחסי פפטיד אות לרעש (S / N) 10. כוללים זוגות פפטיד רק כאשר ממוצע אות לnoiיחס se הוא מעל חמש. לכמת שפע יחסי של פפטיד בשתי דגימות כיחס בין אזורי שיא של MS1 כבדים וקלות גרסאות של אותו פפטיד (יחס אזור שיא MS1). חישוב שכיחות חלבון יחסי כיחס אזור שיא MS1 החציוני לפפטידים בחלבון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכנו את הדיוק, הדיוק, ושחזור של תיוג רדה באמצעות שמר האפייה וClostridium phytofermentans lysates תא כולו. אנו לכמת את יעילות התיוג רדה מתערובת של ג הראשון phytofermentans lysates חלבון מתאי (שכותרתו כבדה, H) וגלוקוז (תווית אור, L) תרבויות. כאשר מסונן לשיעור גילוי 1% פפטיד שווא, מדגם זה הכיל 11,194 רצפי פפטיד ייחודיים עם 98% יעילות תיוג רדה. Unfractionated ס lysate חלבון cerevisiae היה שכותרתו באופן דומה עם חומרים כימיים H או L, מעורב ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמה נקודות לעשות תיוג איזוטופ יציב של פפטידים באמצעות dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) שיטה אטרקטיבית לפרוטאומיקה כמותיים: ריאגנטים זולים תיוג (ריאגנטים עולים פחות מ 1 $ לדגימה), קצב תגובה מהיר (10 דקות ~), היעדר מוצרי לוואי, גבוהים שחזור (איורים 3, 4), תוצרי תגובה יציבה, יכולת להשתמש בכל פרוטאז, ויעילות גבוה יינון של פפטידים שכותרתו. תיוג כימי על ידי רדה הוא גם יתרון יחסי לתיוג מטבולית שכן הוא אינו דורש זנים או שורות תאים עם auxotrophies ספציפי חומצת אמינו או צמ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל-SP Gygi ול-GM Church על העזרה וההדרכה. עבודה זו נתמכה על ידי יו"ר הצטיינות של CNRS ל-ACT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
חומצה טריכלורואצטיתסיגמא-אולדריץT9159משקעי חלבון
אצטוןסיגמא-אולדריץ650501משקעי חלבון
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'71736דנטורציה, הפחתת חלבון
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'S8045דנטורציה, הפחתת חלבון
DL-דיתיותרייטולSigma-Aldrich43816denature, reduce, alkylate
protein Protease Inhibitor Complete Mini CocktailRoche4693124001denature, מפחית חלבון
יודואצטמידSigma-AldrichI6125חלבון אלקילט
HEPESSigma-AldrichH7523השעיה, תמצית, תווית חלבון
סידן כלורי סיגמא-אולדריץ'C5670השהיית חלבון
Lysyl EndoproteaseWako Chemicals129-02541עיכול חלבון
בדרגת ריצוף טריפסיןPromegaV5111עיכול
חלבון חומצה אצטיתעיכול חלבון320099Sigma-Aldrich
חומצה טריפלואורואצטיתSigma-Aldrich299537מיצוי פפטיד שלב הפוך
tC18 Sep-Pak C18 מחסניותמיםWAT054960מיצוי פפטידים בשלב הפוך
סעפת מיצוימיםWAT200609מיצוי פפטיד שלב הפוך
אצטוניטרילסיגמא-אולדריץ'14261
פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'שונים 252549" אור" תיוג פפטידים
CyanoborohydrideSigma-Aldrich71435" אור" תיוג פפטיד
פורמלדהיד DeuteratedSigma-Aldrich492620" כבד" תיוג פפטיד
נתרן ציאנובורודוטרידCDN איזוטופיםD-1797" כבד" תיוג פפטידים
MESSigma-AldrichM3671תיוג פפטידים
עמודה C18-HPLC (4.6 x 250 מ"מ, 5 ומיקרו; m גודל חלקיקים)Agilent770450-902pH בסיסי כרומטוגרפיה בשלב הפוך
חומצה פורמיתSigma-Aldrich399388
דיסקים שונים C18 Empore3M14-386-3 טיפים לבמה
מתנולסיגמא-אולדריץ'494437טיפים לשלב
' '

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
  3. Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
  6. Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
  7. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
  8. Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
  9. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  10. Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
  11. Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
  12. Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
  13. Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
  14. Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
  15. Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
  16. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  17. Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
  19. Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
  20. She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
  21. Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
  22. Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reductive DimethylationStable Isotope LabelingQuantitative ProteomicsPeptide FractionationLC MS MS AnalysisSolid Phase ExtractionBasic pH Reversed Phase ChromatographyStageTip PurificationMass Spectrometry QuantificationProtein Abundance Comparison

Related Articles