Method Article

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

DOI:

10.3791/51416

⸱

July 1st, 2014

 , 
1CEA, DSV, IG, Genoscope, 2CNRS-UMR8030, Évry, France, 3Université d'Évry Val d'Essonne, 4Massachusetts General Hospital Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג איזוטופ היציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא שיטה לכמת במדויק הבדלי ביטוי חלבון בין דגימות באמצעות ספקטרומטר מסה. תיוג רדה מבוצע באמצעות אחת רגיל (אור) או בצורות deuterated (כבדות) של cyanoborohydride פורמלדהיד ונתרן להוסיף שתי קבוצות מתיל לכל אמין בחינם. כאן אנו מדגימים פרוטוקול חזק לתיוג רדה והשוואה כמותית של תערובות חלבונים מורכבות. דגימות חלבון לשם השוואה מתעכלים לפפטידים, שכותרתו לשאת אור או תגי תיל כבדים, מעורב, ושיתוף נותח על ידי LC-MS/MS. שכיחותם חלבון יחסית הן לכמת על ידי השוואת אזורי שיא הכרומתוגרמה יון של גרסאות כבדות וקלות שכותרת של הפפטיד המכונן שחולץ מן MS הספקטרום המלא. השיטה המתוארת כאן כוללת הכנת מדגם על ידי מיצוי שלב מוצק התהפך שלב, תיוג רדה על הטור של פפטידים, חלוקה פפטיד ידי Rev-pH הבסיסיכרומטוגרפיה ersed-שלב (BPRP), וטיהור פפטיד StageTip. אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של תיוג רדה ביחס לשיטות אחרות לשילוב איזוטופ יציב. אנו מדגישים יישומי רומן באמצעות תיוג רדה כשיטת מהירה, זולה, ומדויקת כדי להשוות שכיחותם חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידת הבדלי ריכוז של חלבונים רבים בין דגימות מורכבות היא אתגר מרכזי בפרוטאומיקה. יותר ויותר, זה נעשה על ידי תיוג חלבונים בכל דגימה עם תגי איזוטופים שונים, המשלב דגימות, ובאמצעות ספקטרומטריית מסה לכמת הבדלי ריכוז. מספר שיטות קיימות לתיוג איזוטופי יציב של חלבונים ופפטידים. 15 N תיוג 1 וSILAC 2 להציג תוויות איזוטופי מטבולית in vivo, ואילו 3 ICAT, 4 iTRAQ, וdimethylation ההפחתה 5 להוסיף תגיות איזוטופ יציבים לאחר מיצוי חלבון ועיכול. בין השיטות הללו, dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא צובר פופולריות כמו שיטה זולה, לשחזור לכמת הבדלי ריכוז חלבון בכמעט כל סוג ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: שיטה זו תוארה 12 בעבר.

1. בידוד חלבון

הכן 1 מ"ג של חלבון תאי על ידי תאי lysing, רצוי בשיטות פיזיות, כגון עיתונות צרפתית, מכות חרוז, או sonication. הימנע תמוגה תא בתיווך ליזוזים כי האנזים לבלבל מדידות ספקטרומטריית מסה.

2. רטיבות TCA של חלבונים

הוספת חומצת 1 נפח trichloroacetic (TCA) לחלבון 4 כרכים ומקררים על קרח דק 10 כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכנו את הדיוק, הדיוק, ושחזור של תיוג רדה באמצעות שמר האפייה וClostridium phytofermentans lysates תא כולו. אנו לכמת את יעילות התיוג רדה מתערובת של ג הראשון phytofermentans lysates חלבון מתאי (שכותרתו כבדה, H) וגלוקוז (תווית אור, L) תרבויות. כאשר מסונן לשיעור גילוי 1% פפטיד שווא, מדגם זה הכיל 11,194 רצפי פפטיד ייחודיים עם 98% יעילות תיוג רדה. Unfractionated ס lysate חלבון cerevisiae היה שכותרתו באופן דומה עם חומרים כימיים H או L, מעורב .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמה נקודות לעשות תיוג איזוטופ יציב של פפטידים באמצעות dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) שיטה אטרקטיבית לפרוטאומיקה כמותיים: ריאגנטים זולים תיוג (ריאגנטים עולים פחות מ 1 $ לדגימה), קצב תגובה מהיר (10 דקות ~), היעדר מוצרי לוואי, גבוהים שחזור (איורים 3, 4), תוצרי תגובה יציבה, יכולת להשתמש בכל פרוטאז, ויעילות גבוה יינון של פפטידים שכותרתו. תיוג כימי על ידי רדה הוא גם יתרון יחסי לתיוג מטבולית שכן הוא אינו דורש זנים או שורות תאים עם auxotrophies ספציפי חומצת אמינו או צמ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ל-SP Gygi ול-GM Church על העזרה וההדרכה. עבודה זו נתמכה על ידי יו"ר הצטיינות של CNRS ל-ACT.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
חומצה טריכלורואצטיתסיגמא-אולדריץT9159משקעי חלבון
אצטוןסיגמא-אולדריץ650501משקעי חלבון
נתרן דודציל סולפטסיגמא-אולדריץ'71736דנטורציה, הפחתת חלבון
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'S8045דנטורציה, הפחתת חלבון
DL-דיתיותרייטולSigma-Aldrich43816denature, reduce, alkylate
protein Protease Inhibitor Complete Mini CocktailRoche4693124001denature, מפחית חלבון
יודואצטמידSigma-AldrichI6125חלבון אלקילט
HEPESSigma-AldrichH7523השעיה, תמצית, תווית חלבון
סידן כלורי סיגמא-אולדריץ'C5670השהיית חלבון
Lysyl EndoproteaseWako Chemicals129-02541עיכול חלבון
בדרגת ריצוף טריפסיןPromegaV5111עיכול
חלבון חומצה אצטיתעיכול חלבון320099Sigma-Aldrich
חומצה טריפלואורואצטיתSigma-Aldrich299537מיצוי פפטיד שלב הפוך
tC18 Sep-Pak C18 מחסניותמיםWAT054960מיצוי פפטידים בשלב הפוך
סעפת מיצוימיםWAT200609מיצוי פפטיד שלב הפוך
אצטוניטרילסיגמא-אולדריץ'14261
פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'שונים 252549" אור" תיוג פפטידים
CyanoborohydrideSigma-Aldrich71435" אור" תיוג פפטיד
פורמלדהיד DeuteratedSigma-Aldrich492620" כבד" תיוג פפטיד
נתרן ציאנובורודוטרידCDN איזוטופיםD-1797" כבד" תיוג פפטידים
MESSigma-AldrichM3671תיוג פפטידים
עמודה C18-HPLC (4.6 x 250 מ"מ, 5 ומיקרו; m גודל חלקיקים)Agilent770450-902pH בסיסי כרומטוגרפיה בשלב הפוך
חומצה פורמיתSigma-Aldrich399388
דיסקים שונים C18 Empore3M14-386-3 טיפים לבמה
מתנולסיגמא-אולדריץ'494437טיפים לשלב
' '

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
  2. Ong, S. -E., Blagoev, B., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reductive DimethylationStable Isotope LabelingQuantitative ProteomicsPeptide FractionationLC MS MS AnalysisSolid Phase ExtractionBasic pH Reversed Phase ChromatographyStageTip PurificationMass Spectrometry QuantificationProtein Abundance Comparison

Related Articles