הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

11.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51433

⸱

12 במאי 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physiological Genomics, Institute of Physiology, Ludwig Maximilians University Munich, 2Tumor Biology Lab, Neurosurgical Clinic, Ludwig-Maximilians University Munich, 3Institut für Biochemie, Emil-Fischer-Zentrum, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 4Institute of Physiological Chemistry and Focus Program Translational Neuroscience, Johannes Gutenberg University Mainz

במאמר זה

סיכום

מיקוד תאי מוח תושב לשושלת תכנות מחדש ישיר מציע נקודות מבט חדשות לתיקון מוח. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך להכין את התרבויות מועשרים עבור pericytes מוח תושב מהמבוגר קליפת המוח האנושית ולהמיר אותם לתאי עצב הנגרמים על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של שעתוק גורמי Sox2 וAscl1.

תקציר

שושלת תכנות מחדש ישיר של תאים שאינם עצביים לנוירונים מושרה (INS) עשוי לספק תובנות לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס נוירוגנזה ולאפשר אסטרטגיות חדשות לדוגמנות במבחנה או תיקון המוח החולה. סוגי זיהוי מוח שאינו תושב עצבי תא ניתנים להמרה ישירה לאח"י עשויים לאפשר לשיגור גישה כזו באתרו, כלומר בתוך רקמת המוח הפגועה. כאן אנו מתארים פרוטוקול שפותח בניסיון של זיהוי תאים שמקורם במוח האנושי הבוגר כי למלא את הנחת יסוד זו. פרוטוקול זה כולל: (1) culturing של תאי אדם מקליפת המוח המתקבל מביופסיות מוח אדם בוגרות; (2) ההרחבה במבחנה (כ דורשת 2-4 שבועות) ואפיון של התרבות על ידי immunocytochemistry וזרימת cytometry; (3) להעשרה על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS) באמצעות קולט-β נגד PDGF ונוגדנים נגד CD146;(4) התמרה בתיווך רטרווירוס עם השעתוק העצבי גורמי Sox2 וascl1; (5) ולבסוף האפיון של תאי העצב כתוצאה נגזרת pericyte המושרית (PdiNs) על ידי immunocytochemistry (14 ימים עד 8 שבועות הבאים התמרה retroviral). בשלב זה, תוספות יכולות להיות נחקר לתכונות חשמליות שלהם על ידי הקלטת התיקון-clamp. פרוטוקול זה מספק הליך שחזור מאוד להמרת שושלת במבחנה של pericytes מוח תושב לאח"י האנושי מתפקד.

מבוא

בניגוד לתכנות מחדש של תאים הסומטיים לתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs), אשר בתורו ניחן בשפע של פוטנציאל התמיינות, תכנות מחדש ישיר נועד להמרה ישרה של סוג תא ספציפי אחד למשנו. עם כל כבוד ליישום שלהם בהקשר של דוגמנות מחלה וטיפולים מבוססי תאים פוטנציאליים, יש שתי גישות תכנות מחדש יתרונות וחסרונות מסוימים. תכנות מחדש לiPSCs (i) מספק מקור כמעט אינסופי של תאים; (Ii) מאפשר להנדסה גנטית; (Iii) מעניק לך את פוטנציאל התמיינות בלתי מוגבל כמעט. עם זאת, חסרונות עיקריים של iPSCs כרוך הסיכון של tumorigenicity של תאים שלא עברו התמיינות (היווצרות תפלצת in vivo) ואת הצורך בטיפוח vivo לשעבר והשתלה שלאחר מכן, אם תאים אלה הם לשמש לטיפולים מבוססי תאים. לעומת זאת, שושלת תכנות מחדש ישיר מוגבל על ידי התשואה נמוכה יותר של התאים הרצוייםאשר עולה בקנה ישירות עם מספר התאים הממוקדים של האוכלוסייה מתחילה, אבל יש לה את היתרון שתאים לתכנות מחדש שושלת מופיעים לתערוכה לא tumorigenic סיכון על ההשתלה 1,2; יתר על כן, תכנות מחדש ישיר יכול גם להיות מושגת באתרו, כלומר בתוך האיבר שבו תאים אלה יהיו צורך, וכך למנוע את הצורך בהשתלה.

עם זאת בחשבון, במעבדה שלנו רדפה את האפשרות של תאי מוח תושב תכנות מחדש שושלת לאח"י כגישה חדשנית כלפי טיפולים מבוססי תאים במחלות ניווניות. תאי מוח תושב שעשוי להיות באופן פוטנציאלי נחשבים כמטרות הסלולר לשושלת תכנות מחדש מהווים סוגים שונים של macroglia (האסטרוציטים, תאי NG2 וoligodendrocytes), מיקרוגליה, ותאים הקשורים דם קטן (תאים וpericytes אנדותל). בהרחבה יש לנו למדנו את פוטנציאל תכנות מחדש במבחנה של astroglia של cor המוחיטקס של עכברים לאחר לידה המוקדם 3-5. בחיפוש אחר מקורות תא דומה המתאימים לשושלת תכנות מחדש ישיר במוח האנושי הבוגר, נתקלנו באוכלוסיית תא שניתן לתכנות מחדש בהצלחה לכל הפרטים סימני ההיכר תערוכה של pericytes. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך לקצור את התאים האלה מביופסיות מוח אנושיות בוגרות, כדי להרחיב ולהעשיר את התאים האלה במבחנה, ובסופו לתכנת מחדש בהצלחה חלק ניכר במבחנת תאים מורחבים אלה (בטווח של 25-30%) לתוך תוספות. תכנות מחדש יכול להיות מושגת על ידי שיתוף ביטוי בתיווך רטרווירוס בו זמנית של שני גורמי שעתוק, Sox2 וascl1. PdiNs אלה נמצאו לרכוש את היכולת של ירי פוטנציאל פעולה חוזר על עצמו ועל מנת לשרת מטרות הסינפטי כלנוירונים אחרים המצביעים על היכולת שלהם להשתלב ברשתות עצביות. הפרוטוקול שלנו מספק הליך פשוט להמרת הבידוד ושושלת של pericytes המוח האנושי הבוגר לתוספות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בידוד וCulturing של תאים בוגרים מוח האנושי

ניסויים מעורבים רקמה אנושית יש לבצע בהתאם לכל תקנות ממשלתיות ומוסדיות הרלוונטיות בנוגע לשימוש בחומר אנושי למטרות מחקר. הפרוטוקול הנוכחי פותח בהתאם לאישור על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במינכן LMU וכתב הסכמה מדעת מכל החולים.

פרוטוקול זה של תרבויות הכנה של האדם בוגר קליפת המוח כבר נקבע באמצעות דגימה של חולים משני המינים הסובלים מאפילפסיה של אונה הרקתית או נגעים אחרים עמוקים לא טראומטיים, שאינם ממאירים. הרקמה המתקבלת מחדר הניתוח המורכב אך ורק את ערוץ הגישה לפגיעה המוחית ולכן נחשבת בריאה. טווח הגילים של המטופלים היה 19-70 שנים.

  1. הכן את מדיום גידול על ידי הוספה עוברי עגל בסרום חום מומת(FCS) לגלוקוז גבוהה DMEM עם Glutamax להשיג ריכוז סופי של FCS 20%. הוסף 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין לסך של 500 בינוני מיליליטר צמיחה. לבצע את זה וכל הצעדים הבאים דורשים תנאים סטריליים תרבות בזרימה למינרית מתאימה.
  2. שמור על הביופסיה במוח האנושית הבוגרת שהתקבלה מחדר הניתוח בתמיסת מלח מאוזן "הנקס עם CaCl 2 וMgCl 2 בינוני (HBSS) כוללים HEPES (ריכוז סופי 10 מ"מ) על קרח עד לעיבוד. להתחיל בעיבוד בהקדם האפשרי.
  3. כדי להתחיל דיסוציאציה לתוך תאים בודדים, להעביר את הרקמה לתוך צלחת פטרי 65 מ"מ וברר לחתיכות קטנות על ידי שימוש בשני סכינים לשימוש יחיד סטרילי. לעיכול אנזימטי להשתמש 3-6 מיליליטר TrypLE בצינור חרוטי 15 מיליליטר ו דגירה של 15-30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
  4. הוסף 1 נפח של מדיום גידול prewarmed כדי להקל על ניתוק ובעדינות triturate התמיסה המכילה חתיכות רקמה למעלה ולמטה על ידי השימוש הראשון5 מיליליטר פיפטה חד פעמית, ואחריו בעזרת פיפטה פסטר זכוכית עד הומוגניזציה של ההשעיה התא. בדרך כלל, כמה חתיכות רקמת שייר, בעיקר מורכבות מחומר לבן, יישארו בהשעיה.
  5. ספין למטה ב157 XG במשך 5 דקות וresuspend את הכדור בכמות המתאימה של מדיום גידול (10 מיליליטר לבקבוק תרבות T75 ללא ציפוי). השתמש בבקבוק תרבות T75 אחד לביופסיה של 5-10 מ"מ קוטר בגודל ובלהסיק מכך במקרה של דגימות גדולות יותר.
  6. הנח תאים לתוך חממת 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2.
  7. החלף מחצית בינונית בכל 3-4 ימים עד תאים הגיעו confluency. זה בדרך כלל לוקח עד שבועיים (המכונים [P0] מעבר 0).

2. במבחנה התרחבות ואפיון של תאים בוגרים מוח האנושי

  1. בהרחבת מבחנה:
    1. לשאוב את מדיום התרבות ולשטוף עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS), המשיך בt החדרemperature, לפני הוספת 3 TrypLE מיליליטר.
    2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות עד שרוב התאים מנותקים. לטפוח בעדינות את צלוחיות כדי להקל על הסרת התאים; בעקבות תוספת של 3 כרכים של מדיום גידול, העברת התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר וספין למטה ב157 XG במשך 5 דקות ו resuspend התאים בכמות המתאימה של מדיום גידול.
    3. מעבר התאים ביחס של 1:3 לתשואה אופטימלית לתוך צלוחיות תרבית תאי T75 חדשות.
      הערה: יש לנו passaged תאים אלה עד P5 ללא כל סימנים של יעילות תכנות מחדש מופחתת. בעוד בP0 התרבות מכילה חלק ניכר של תאי האנדותל (כפי שהוערך על ידי ביטוי CD34), בקטעים שלאחר מכן מספרם הופך להיות זניח.
  2. אפיון של תרבויות מוח אנושיות בוגרות:
    1. Immunocytochemistry:
      1. לאפיון של תאים, זרעים ~ 60,000 תאים על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליקה ב500 μl mediu גידול הטרימ 'בצלחות תרבית רקמת 24 גם לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2.
      2. לניתוח immunocytochemical של תאי המוח האנושיים בתרבית להסיר את המדיום ולשטוף 3x עם 1 מיליליטר של PBS.
      3. תקן את התאים על ידי הוספת 500 μl של paraformaldehyde 4% ב-PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר.
      4. העבר את כיסוי הזכוכית מחליק לתוך תא מכתים humidified מתאים ולחסום עם 80 μl PBS המכיל 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ו0.5% טריטון X-100 במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
      5. הוספת נוגדנים עיקריים מדוללים באותו הפתרון (לגורמי דילול ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים) ודגירת הלילה בשעה 4 ° C או 1 שעות בטמפרטורת חדר.
        הערה: חלק ניכר אבל שונה של התאים בשלב זה של culturing הוא immunoreactive לβ רצפטור נגזר גורם גדילה של טסיות דם (PDGFRβ), מקבץ של בידול 146 (CD146), proteo כונדרואיטין סולפט NG2סוכרים, ויקטין שריר חלק (SMA), סמנים כלומר מאפיין של pericytes הקשורים דם קטן. רק מיעוט (<1%) מבטא את חלבון סמני astroglial גליה fibrillary חומצי (GFAP) וS100β. יתר על כן, בשלב זה את התרבות צריכה להיות נטול כל תאים המבטאים את βIII-טובולין הסמן העצבי. השתמש בשילובי נוגדן ראשוני מרובים לשיתוף תיוג של סמנים שונים. ניתן לקבל אישור נוסף לביטוי של סמני גליה, עצביים, אנדותל וpericyte ידי שעתוק לאחור ותגובה הכמותית זמן אמת שרשרת פולימרז (לא תוארה בפרוטוקול זה).
      6. לאחר דגירה עם הנוגדנים הראשוניים לשטוף שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS ולהוסיף נוגדנים המתאימים משני (בדילולים המתאימים) לפתרון מכתים ודגירת 1 שעות בטמפרטורת חדר בחושך. לשטוף את התאים 3x עם PBS. במידת צורך, לפני ההרכבה כולל צביעה עם DAPI במשך 5 דקות בחדרטמפרטורה.
      7. השתמש antifading הרכבה בינונית ולנתח את התלושים לכסות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence או מיקרוסקופ confocal.
    2. Cytometry זרימה:
      1. לניתוח של ביטוי סמן פני השטח באמצעות cytometry זרימה, לגדל תאים לconfluency בT25 ללא ציפוי או צלוחיות תרבית תאי T75.
      2. ניתוק תאים באמצעות TrypLE כפי שתואר קודם ו resuspend בפתרון מכתים בהיקף של BSA + 0.5% PBS. לכל תגובה מכתים, resuspend תאים ב100,000-200,000 של פתרון מכתים 100 μl. הכן את התגובות מכתים אחד לכל נוגדן משמשות (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, נוגדני שליטת אלוטיפ בהתאמה).
      3. הוספת נוגדני fluorochrome מצומדות לכל פתרון מכתים (לדילולים ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים) ישירות לתוך ההשעיה תא דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בחושך.
      4. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μl PBS וספין למטה בין כלשלב כביסה ב157 XG במשך 5 דקות.
      5. Resuspend התא גלולה ב 0.5-1 מיליליטר פתרון מכתים ותאי העברה דרך מסננת תא (70 מיקרומטר) לצינורות FACS. הגנה על המדגם מחשיפה לאור.
      6. דגימות ורטקס לפני הצבתם במכשיר FACS.
      7. כדי לנתח את תאי חיים ואינם כולל אגרגטים פסולת וסלולריים, שער לFSC-SSC ו-. duplets התא מגודרת החוצה במיוחד על ידי FSC-וFSC-W. כדי לקבוע את תנאי gating הנכונים עבור הסמנים פני התא להגדיר את השערים עם שליטת נוגדנים מתאים אלוטיפ מצומדת לfluorochrome בהתאמה. לאחר מכן לקבוע את חלקם של תאים הנכנס נוגדנים.

3. העשרה לתאים שמקורם בpericyte ידי תא הקרינה מיון פעיל

  1. לטהר את אוכלוסיית תא pericyte (resuspended במדיום גידול) לפני התמרה באמצעות FACS מיון באמצעות זרבובית 70 מיקרומטר. השתמש CD34-APC בשילוב עם CD140b-PE ו-CD146 FITC כדי לבחור עבור pericytes. מיון ל, תאי CD140b, וCD146-CD34 חיוביים שלילי.
  2. איסוף התאים ממוינים במדיום גידול וצלחת על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליק בצלחות תרבית רקמת 24 גם לדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2.
  3. 48 שעות לאחר המיון להחליף את המדיום עם מדיום גידול טרי ולבצע התמרה כפי שתוארו בפרוטוקול 4.

4. Retroviral התמרה של תאים שמקורם בpericyte ותכנות מחדש לנוירונים מושרה

הערה: עיין בהנחיות בטיחות ביולוגיות מקומיות בעת טיפול בחלקיקי רטרווירלי. בגרמניה השימוש ברטרווירוסים מועסקים כאן דורשים בטיחות ביולוגית ברמה 2. לייצור של חלקיקי רטרווירלי מתייחס לפרוטוקול 6. לבונת רטרווירלי משמשת לתכנות מחדש, עיין Karow et al. (2012). רטרווירוסים היו pseudotyped עם VSV-G (-glyco וירוס stomatitis שלפוחיחלבון) 5. לייצור עיין אל Gavrilescu et 6.

  1. 24 שעות לפני זרע התמרה retroviral ~ 60,000 תאים על פולי-D-ליזין מצופה כיסוי הזכוכית מחליקה ב500 μl מדיום גידול טרי ב24 גם צלחות תרבית רקמה ולדגור על 37 ° C עם 5% CO 2 ו -5% O 2 .
  2. למחרת, להחליף את מצע הגידול עם 500 μl מדיום גידול טרי, prewarmed ולהוסיף 1 μl של supernatants בהתאמה מרוכזת המכיל חלקיקי רטרווירלי (pCAG-IRES-DsRed לשליטה, במיוחד בתקופת הקמת הפרוטוקול במעבדה), pCAG-ascl1 -DsRed IRES, pCAG-Sox2-IRES-GFP.
  3. יום אחד לאחר מכן, להסיר את המדיום כולל חלקיקים נגיפיים מהתאים ולהוסיף 1 מיליליטר טרי, prewarmed בינוני B27-בידול, מורכב מ49 מיליליטר גלוקוז גבוהה DMEM עם Glutamax ותוספת סרום ללא 1 מיליליטר B27. לשמור על התאים בתרבית על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ו -5% O 2 במשך 4-8 שבועות מבלי לשנות את המדיום כמדיום שינויים חוזרים ונשנים להיות מזיקים כמו INS להתבגר.

5. אפיון מושרה נוירונים ידי Immunocytochemistry

  1. כדי לקבוע את הזהות הסלולרית של תאי transduced, בפרט כדי להדגים את רכישת הפנוטיפ עצבי, לבצע immunocytochemistry נגד אנטיגנים עצביים כגון bIII-טובולין, MAP2, וNeuN (לנוגדנים והדילולים שלהם, ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים ו ציוד; בצע את אותו התהליך כפי שצוין ב2.2.1).
  2. לשיפור ההבשלה של PdiNs, שיתוף תרבות תאים אלה עם תאי עצב שמקורם בקורטקס מוח עכבר E14. לשם כך, לנתח את קליפת המוח ולנתק את הרקמה באופן מכאני עם הזכוכית פיפטה פסטר אש מלוטשת. הוספת 10,000-50,000 נוירונים עכבריים לתרביות של תאים שמקורם בpericyte 2-3 שבועות הבאים התמרה עם Sox2 וascl1 קידוד מחדשtroviruses ולהמשיך culturing. ניתן להבחין בין תאי transduced מתא העצב עכברי על ידי ביטוים כתב (GFP וdsRed), או על ידי epifluorescence החי או הבא immunocytochemistry עבור ה-GFP וdsRed.
  3. כדי להעריך את היווצרות של סינפסות על PdiNs ידי נוירונים עכבריים, לבצע immunocytochemistry נגד קולטני הנוירוטרנסמיטר ועי כגון טרנספורטר לפוחי גלוטמט 1 (vGluT1).
  4. בדיקה תאי transduced לתכונותיהם חשמליות (כלומר יכולת לייצר פוטנציאל פעולה) ואת הקמתה של סינפסות הפונקציונלית על ידי אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק. לפרטים בדבר ההליך לראות היינריך et al. (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאה הראשונה של פרוטוקול זה לאחר הקמת הצלחת תרבות מדגימה של אדם מבוגר קליפת מוח מורכבת בזיהוי ההרכב התאי של התרבות. Immunocytochemistry לחלבונים ספציפיים סוג התא מגלה מידה רבה של הטרוגניות בין התרבויות נובעות מדגימה של חולים שונים (איור 1 א). כלכמת ידי cytometry זרימה תמיד יש אחוז ניכר של תאים המבטאים PDGFRβ (בממוצע ~ 75%, החל 30 לעד 99%); סמנים אחרים של pericytes כגון CD146, NG2 וCD13 באים לידי ביטוי בדרך כלל בטווח תחתון (איור 1). כמו כן SMA בא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההתרחבות במבחנה והעשרה של תאי שמקורם pericyte הבאות בידוד מהמבוגרים האנושי קליפת המוח ואת ההמרה שלאחר מכן לאח"י על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של השעתוק העצבי גורמי Sox2 וAscl1. פרוטוקול כזה מספק ניסיוני במערכת מבחנה כדי לחקור את שושלת ההמרה של תאי מוח תושב לנוירונים ובאופן פוטנציאלי גם גליה, עם המטרה בראש לתרגם סופו של דבר גישת המרה הישירה הזה להגדרת vivo במוח הבוגר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש מחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר מגדלנה גץ לקלט שלה במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אנו מודים לד"ר מריוס Wernig (אוניברסיטת סטנפורד) לנדיבות לתת לנו את רצף קידוד Sox2. אנחנו גם מאוד מודים לד"ר אלכסנדרה Lepier לייצור וירוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) וBMBF (01GN1009A) ל-BB, והמשרד הבווארית הממלכתי למדעים, מחקר והאמנויות לח"כ וBBCs קיבלו מימון מSYSTHER-דו לאומי מכון INREMOS וירטואלי (משרדי חינוך והמחקר הפדרליים גרמנים וסלובניים) וDFG (SFB 824).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
anti-CD140b-PEBD Biosciences558821להשתמש ב-1:100
anti-CD146-FITCAbD SerotecMCA2141FTלהשתמש ב-1:100
anti-CD13-FITCAbD SerotecMVA1270A488Tלהשתמש ב-1:100
anti-CD34-APCBD Biosciences560940להשתמש ב-1:100
anti-PDGFRβאיתות סלולרי3169Sהשתמש ב-1:200
אנטי-CD146AbcamAb75769השתמש ב-1:400
אנטי-NG2MilliporeAB5320השתמש ב-1:400
אנטי-SMASigma-AldrichA2547השתמש ב-1:400
אנטי-ובטא; III-tubulinSigma-AldrichT8660השתמש ב-1:400
אנטי-MAP2Sigma-AldrichM4403השתמש ב-1:200
אנטי-GFAPSigma-AldrichG3893השתמש ב-1:600
אנטי-GFPAves LabsGFP 10-20השתמש ב-1:1,000
אנטי-RFPChromotek5F8השתמש ב-1:500
אנטי-S100βSigma-AldrichS2532השתמש ב-1:300
anti-NeuNMilliporeMAB377השתמש ב-1:200
anti-GABASigma-AldrichA2052השתמש ב-1:500
אנטי-קלרטיניןMilliporeAB5054השתמש ב-1:500
anti-vGluT1SYnaptic SYstems135511השתמש ב-1:1,000
חולדה IgG1 בקרת איזוטיפ FITCAbD Serotec11-4301-81השתמש 1:100
חולדה IgG1 איזוטיפ בקרת PEAbD Serotec12-4301-81השתמש 1:100
חולדה IgG1 בקרת איזוטיפ APCAbD Serotec17-4301-81השתמש 1:100
TrypLEInvitrogen12605-010
DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAXInvitrogen61965
B27 תוסף תזונה ללא סרוםInvitrogen
17504044 סרום עגל עובריInvitrogen10106-169לבצע השבתת חום על ידי דגירה בטמפרטורה של 56 מעלות; C למשך 30 דקות
פניצילין-סטרפטומיציןInvitrogen15140122
HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס)Invitrogen24020-091
PBS של Dulbecco ללא CaCl2 ו-MgCl2 (D-PBS, 1x)Invitrogen14190
HEPESSigma-AldrichH3375
Poly-D-lysine הידרוברומיד (PDL)סיגמא-אולדריץ'P0899
PFA (פרפורמלדהיד)סיגמא-אולדריץ'P1648
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ'A9418
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'T9284
DAPI (4&פריים;,6-דיאמידין-2-פנילינדול) דילקטטסיגמא-אולדריץ'042M4005
אקווה-פולי/ MountPolysciences18606-20
צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים BD Biosciences352063
צינורות פוליסטירן תחתונים עגולים עם מכסה מסנן BD Biosciences352235
צלחות 24 בארות5530305תפוז מדעי
75 ס"מ2 צלוחיות תרביתGreiner Bio-One658175
25 ס"מ2 צלוחיותגריינר ביו-וואן690175
פיפטות חד פעמיות 10 מ"לSarstedt86.1254.001
פסטר זכוכית פיפטות (150 מ"מ)פישרברנדFB50251
כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"ממנזלCB00120RA1
אזמל חד פעמי כירורגי ב. בראון5518083
כלים לתרבית רקמות גריינר ביו-וואן633180
צינורות חרוטיים 15 מ"לBD Biosciences352095
קולט אדים
צנטריפוגה ורוטור מתנדנד עם מתאמים לצינורות 15 מ"ל ו-50 מ"לHettich Lab Technology1406
ממיין תאים ציטומטרי זרימה: FACSAria l עם תוכנת FACSDiva BD Biosciences
חממת תרבית תאים משופרתEppendorf Galaxy 170R
אמבט וואטר ב-37 מעלות; C
FACSנוזל נדן BD Biosciences342003
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי BX61מיקרוסקופ אולימפוס
קונפוקלי LSM710Zeiss
זרימה למינארי

מקורות

  1. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  2. Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
  3. Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
  4. Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
  5. Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
  6. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
  7. Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
  8. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
  9. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
  10. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
  11. Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
  12. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
  13. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
  14. Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
  15. Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
  16. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
  17. Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
  18. Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
  19. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
  20. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
  21. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
  22. Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PDGFR betaCD146
שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.