מיקוד תאי מוח תושב לשושלת תכנות מחדש ישיר מציע נקודות מבט חדשות לתיקון מוח. כאן אנו מתארים פרוטוקול של איך להכין את התרבויות מועשרים עבור pericytes מוח תושב מהמבוגר קליפת המוח האנושית ולהמיר אותם לתאי עצב הנגרמים על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של שעתוק גורמי Sox2 וAscl1.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה
במאמר זה
סיכום
תקציר
שושלת תכנות מחדש ישיר של תאים שאינם עצביים לנוירונים מושרה (INS) עשוי לספק תובנות לתוך המנגנונים המולקולריים שבבסיס נוירוגנזה ולאפשר אסטרטגיות חדשות לדוגמנות במבחנה או תיקון המוח החולה. סוגי זיהוי מוח שאינו תושב עצבי תא ניתנים להמרה ישירה לאח"י עשויים לאפשר לשיגור גישה כזו באתרו, כלומר בתוך רקמת המוח הפגועה. כאן אנו מתארים פרוטוקול שפותח בניסיון של זיהוי תאים שמקורם במוח האנושי הבוגר כי למלא את הנחת יסוד זו. פרוטוקול זה כולל: (1) culturing של תאי אדם מקליפת המוח המתקבל מביופסיות מוח אדם בוגרות; (2) ההרחבה במבחנה (כ דורשת 2-4 שבועות) ואפיון של התרבות על ידי immunocytochemistry וזרימת cytometry; (3) להעשרה על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS) באמצעות קולט-β נגד PDGF ונוגדנים נגד CD146;(4) התמרה בתיווך רטרווירוס עם השעתוק העצבי גורמי Sox2 וascl1; (5) ולבסוף האפיון של תאי העצב כתוצאה נגזרת pericyte המושרית (PdiNs) על ידי immunocytochemistry (14 ימים עד 8 שבועות הבאים התמרה retroviral). בשלב זה, תוספות יכולות להיות נחקר לתכונות חשמליות שלהם על ידי הקלטת התיקון-clamp. פרוטוקול זה מספק הליך שחזור מאוד להמרת שושלת במבחנה של pericytes מוח תושב לאח"י האנושי מתפקד.
מבוא
בניגוד לתכנות מחדש של תאים הסומטיים לתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs), אשר בתורו ניחן בשפע של פוטנציאל התמיינות, תכנות מחדש ישיר נועד להמרה ישרה של סוג תא ספציפי אחד למשנו. עם כל כבוד ליישום שלהם בהקשר של דוגמנות מחלה וטיפולים מבוססי תאים פוטנציאליים, יש שתי גישות תכנות מחדש יתרונות וחסרונות מסוימים. תכנות מחדש לiPSCs (i) מספק מקור כמעט אינסופי של תאים; (Ii) מאפשר להנדסה גנטית; (Iii) מעניק לך את פוטנציאל התמיינות בלתי מוגבל כמעט. עם זאת, חסרונות עיקריים של iPSCs כרוך הסיכון של tumorigenicity של תאים שלא עברו התמיינות (היווצרות תפלצת in vivo) ואת הצורך בטיפוח vivo לשעבר והשתלה שלאחר מכן, אם תאים אלה הם לשמש לט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בידוד וCulturing של תאים בוגרים מוח האנושי
ניסויים מעורבים רקמה אנושית יש לבצע בהתאם לכל תקנות ממשלתיות ומוסדיות הרלוונטיות בנוגע לשימוש בחומר אנושי למטרות מחקר. הפרוטוקול הנוכחי פותח בהתאם לאישור על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה במינכן LMU וכתב הסכמה מדעת מכל החולים.
פרוטוקול זה של תרבויות הכנה של האדם בוגר קליפת המוח כבר נקבע באמצעות דגימה של חולים משני המינים הסובלים מאפילפסיה של אונה הרקתית או נגעים אחרים עמוקים לא טראומטיים, שאינם ממאירים. הרקמה המתקבלת מחדר הניתוח המורכב אך ורק את ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאה הראשונה של פרוטוקול זה לאחר הקמת הצלחת תרבות מדגימה של אדם מבוגר קליפת מוח מורכבת בזיהוי ההרכב התאי של התרבות. Immunocytochemistry לחלבונים ספציפיים סוג התא מגלה מידה רבה של הטרוגניות בין התרבויות נובעות מדגימה של חולים שונים (איור 1 א). כלכמת ידי cytometry זרימה תמיד יש אחוז ניכר של תאים המבטאים PDGFRβ (בממוצע ~ 75%, החל 30 לעד 99%); סמנים אחרים של pericytes כגון CD146, NG2 וCD13 באים לידי ביטוי בדרך כלל בטווח תחתון (איור 1). כמו כן SMA בא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את ההתרחבות במבחנה והעשרה של תאי שמקורם pericyte הבאות בידוד מהמבוגרים האנושי קליפת המוח ואת ההמרה שלאחר מכן לאח"י על ידי ביטוי בתיווך רטרווירוס של השעתוק העצבי גורמי Sox2 וAscl1. פרוטוקול כזה מספק ניסיוני במערכת מבחנה כדי לחקור את שושלת ההמרה של תאי מוח תושב לנוירונים ובאופן פוטנציאלי גם גליה, עם המטרה בראש לתרגם סופו של דבר גישת המרה הישירה הזה להגדרת vivo במוח הבוגר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש מחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים לד"ר מגדלנה גץ לקלט שלה במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה. אנו מודים לד"ר מריוס Wernig (אוניברסיטת סטנפורד) לנדיבות לתת לנו את רצף קידוד Sox2. אנחנו גם מאוד מודים לד"ר אלכסנדרה Lepier לייצור וירוס. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) וBMBF (01GN1009A) ל-BB, והמשרד הבווארית הממלכתי למדעים, מחקר והאמנויות לח"כ וBBCs קיבלו מימון מSYSTHER-דו לאומי מכון INREMOS וירטואלי (משרדי חינוך והמחקר הפדרליים גרמנים וסלובניים) וDFG (SFB 824).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | להשתמש ב-1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | להשתמש ב-1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | להשתמש ב-1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | להשתמש ב-1:100 |
| anti-PDGFRβ | איתות סלולרי | 3169S | השתמש ב-1:200 |
| אנטי-CD146 | Abcam | Ab75769 | השתמש ב-1:400 |
| אנטי-NG2 | Millipore | AB5320 | השתמש ב-1:400 |
| אנטי-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | השתמש ב-1:400 |
| אנטי-ובטא; III-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | השתמש ב-1:400 |
| אנטי-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | השתמש ב-1:200 |
| אנטי-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | השתמש ב-1:600 |
| אנטי-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | השתמש ב-1:1,000 |
| אנטי-RFP | Chromotek | 5F8 | השתמש ב-1:500 |
| אנטי-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | השתמש ב-1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | השתמש ב-1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | השתמש ב-1:500 |
| אנטי-קלרטינין | Millipore | AB5054 | השתמש ב-1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | השתמש ב-1:1,000 |
| חולדה IgG1 בקרת איזוטיפ FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | השתמש 1:100 |
| חולדה IgG1 איזוטיפ בקרת PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | השתמש 1:100 |
| חולדה IgG1 בקרת איזוטיפ APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | השתמש 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 תוסף תזונה ללא סרום | Invitrogen | ||
| 17504044 סרום עגל עוברי | Invitrogen | 10106-169 | לבצע השבתת חום על ידי דגירה בטמפרטורה של 56 מעלות; C למשך 30 דקות |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס) | Invitrogen | 24020-091 | |
| PBS של Dulbecco ללא CaCl2 ו-MgCl2 (D-PBS, 1x) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine הידרוברומיד (PDL) | סיגמא-אולדריץ' | P0899 | |
| PFA (פרפורמלדהיד) | סיגמא-אולדריץ' | P1648 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא-אולדריץ' | A9418 | |
| טריטון X-100 | סיגמא-אולדריץ' | T9284 | |
| DAPI (4&פריים;,6-דיאמידין-2-פנילינדול) דילקטט | סיגמא-אולדריץ' | 042M4005 | |
| אקווה-פולי/ Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים | BD Biosciences | 352063 | |
| צינורות פוליסטירן תחתונים עגולים עם מכסה מסנן | BD Biosciences | 352235 | |
| צלחות 24 בארות | 5530305 | תפוז מדעי | |
| 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 ס"מ2 צלוחיות | גריינר ביו-וואן | 690175 | |
| פיפטות חד פעמיות 10 מ"ל | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| פסטר זכוכית פיפטות (150 מ"מ) | פישרברנד | FB50251 | |
| כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ | מנזל | CB00120RA1 | |
| אזמל חד פעמי כירורגי | ב. בראון | 5518083 | |
| כלים לתרבית רקמות | גריינר ביו-וואן | 633180 | |
| צינורות חרוטיים 15 מ"ל | BD Biosciences | 352095 | |
| קולט אדים | |||
| צנטריפוגה ורוטור מתנדנד עם מתאמים לצינורות 15 מ"ל ו-50 מ"ל | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| ממיין תאים ציטומטרי זרימה: FACSAria l עם תוכנת FACSDiva | BD Biosciences | ||
| חממת תרבית תאים משופרת | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| אמבט וואטר ב-37 מעלות; C | |||
| FACSנוזל נדן | BD Biosciences | 342003 | |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי BX61 | מיקרוסקופ אולימפוס | ||
| קונפוקלי LSM710 | Zeiss |
מקורות
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse f....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
