פשוט ומהיר פרוטוקול למדידת שומנים ניטרלי בתאי אצות באמצעות הקרינה

סיכום

פרוטוקול פשוט כדי לקבוע את תוכן שומנים הניטרלי של תאי אצות באמצעות הליך מכתים הנילוס אדום מתואר. טכניקה לחיסכון בזמן זה מציעה אלטרנטיבה לפרוטוקולי כימות מסורתיים מבוסס gravimetric שומנים בדם. זה תוכנן עבור היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess הניטור.

תקציר

אצות נחשבות מועמדים מצוינים למקורות דלק מתחדשים בשל יכולות אחסון שומנים הטבעיים שלהם. ניטור חזק של תהליכי תסיסה של אצות והקרנה לזנים עשירים בנפט חדש מחייב פרוטוקול מהיר ואמין לקביעת תוכן שומנים תאיים. שיטות קיימות כיום מסתמכות במידה רבה על שיטות gravimetric כדי לקבוע תכולת שמן, טכניקות שפותחו לפני עשרות שנים, כי הם זמן רב ודורשות כמויות מדגם גדולות. במאמר זה, הנילוס האדום, צבע פלואורסצנטי שכבר נעשה שימוש כדי לזהות את נוכחותם של גופי שומנים בסוגים רבים של אורגניזמים, הוא שולב בפרוטוקול פשוט, מהיר, ואמין למדידת התוכן הניטרלי שומנים של protothecoides Auxenochlorella, ירוק אצה. השיטה משתמשת אתנול, ממס מתון יחסית, לpermeabilize קרום התא לפני הצביעה ו96 גם מיקרו צלחת כדי להגדיל את קיבולת המדגם במהלך מדידות עוצמת הקרינה. זה כבר עיצובאד עם היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess הניטור. דגימות מיובשות בעבר או דוגמאות חיות מתרבות הולך וגדל ניתן להשתמש בassay.

מבוא

בשל יכולתם כדי לאחסן גופי שומנים בדם בתנאי לחץ מסוימים, אצות קיבלו תשומת לב רבה בשנים האחרונות כמקור דלק מתחדש פוטנציאל ^1,2. שומנים ניטראליים יכולים להסביר מעל 60% מהמשקל היבש של התאים בתנאי גידול מתאימים ^3. עם זאת, התעשייה אין פרוטוקול סטנדרטי פשוט, נקי, מהיר, אמין ולכמת תוכן שומנים של תאי אצות על מנת לפקח כראוי ביצועי Bioprocess, לנתח תרבויות, ומסך לזנים חדשים.

שיטת gravimetric בליי-דייר שפותחה לפני כמה שנים 50 נותרת בין הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש כיום ^4,5. בעוד הליך זה הוא פשוט, אמין, וקל לביצוע, זה זמן רב, מחייב כרכי מדגם גדולים, ועושה שימוש בחומרים רעילים. זה לא מעשי לניתוח דגימות רבות מריצת תסיסה או הקרנה לזנים עשיר בנפט חדש. בשיטות אחרות יש בeen מפותח, אבל בדרך כלל דורש ציוד מתקדם ולא תוקננו ^6.

אלטרנטיבה שצברה עניין רב היא כתם הנילוס האדום. הנילוס האדום, צבע שהמאיר מעדיף בסביבות שאינן קוטביות, בו נעשה שימוש כדי לזהות או לכמת גופי שומנים באורגניזמים שונים, כולל נמטודות ^{7, 8} שמרים, חיידקים ^9, ואצות ^10-19. טכניקות ראשוניות מעורבת הנילוס האדום היו בעיקר איכותיות או חצי כמותית, המשלבות את הכתם עם spectrophotometry היחיד קובט או cytometry זרימה. בנוסף, יש כמה סוגים של אצות כגון אצות ירוקות בארות תא עבות המכילות בעיקר בלתי חדירים לצבע, שהגביל את הטווח של הטכניקה ^10.

השיפורים אחרונים בשיטת צביעת הנילוס האדומה כבר דיווחו העוקפים את החסרונות הראשוניים של הפרוטוקול ^10,11. מכתים את התאים בנוכחות קארier ממס כגון DMSO ¹⁰ או ^10,11 אתנול linearizes הקשר בין תכולת שמן וספיג, המאפשר מדידות כמותיות אמינות. הממס עוזר permeabilize קרום התא, כך שמולקולות הנילוס האדומים יכולות לעבור דרכו. בנוסף, שילוב ספקטרופוטומטר עם יכולות קריאת מיקרו צלחת מאפשר פרוטוקולי תפוקה גבוהים המתאימים לניתוח כמוני.

בפירוט שמאמר זה שיטה פשוטה למדידת תכולת שמן של תאי אצות על ידי צביעת תרבויות עם הנילוס האדום בנוכחות של אתנול, ממס מתון. על מנת אופן מדויק ביותר להסביר את רעש רקע במדידות, עקומת סטנדרט מקשרת עוצמת הקרינה לתוכן שמן היא פותח באמצעות תאי אצות של הרכב נפט ידוע. השיטה מותאמת מפרוטוקולים שפורסמו בעבר ^10,11. באמצעות ספקטרופוטומטר 96 היטב, אחד הוא מסוגל לנתח את אותה הכמות של דגימות בשעה thaלא היה לוקח ימים כדי לפקח על ידי שיטות gravimetric. יתר על כן, על ידי כיול באמצעות מדגמים מייצגים של מיני אצות הרצויים בשיטה זו מייצרת מדידות מדויקות יחסית אשר מתייחסות ישירות לפירוש. קיימים פרוטוקולים רבים מתאר שיטות של מכתים את האצות עם הנילוס האדום מותאמים לזנים ויישומים שונים; הפרוטוקול המובא כאן פותח במקור על ידי דה לה הוז סיגלר ואח'. ¹¹ לprotothecoides Auxenochlorella, vulgaris כלורלה, dimorphus Scenedesmus, וobliquus Scenedesmus, למרות שסביר להניח מתאים למינים רבים נוספים וכיתות. זה תוכנן עם היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess ניטור וזה עובד באותה המידה גם עבור דגימות מיובשות בעבר ודגימות רטובות מתרבות הולך וגדל.

פרוטוקול

1. בידוד של האצות יבשים ביומסה כדי לשמש תקנים לקריאות הקרינה

1. הסר את נפח דגימה מהתרבות של אצות גוברת כי תספק לפחות 200 מ"ג של ביומסה היבשה, 400-600 מ"ג הוא עדיף.
2. צנטריפוגה מדגם ב C ° 4 10 דקות ב 10,000 X גרם. בטל supernatant ולשטוף את הכדור עם נפח שווה של חיץ פוספט גיבש לאותו pH כתקשורת הצמיחה.
3. חזור על שלב 1.2 עבור סכום כולל של 3 שלבי כביסה.
4. Re-להשעות גלולה במי דה המיונן ולהעביר לצלחת מראש שקל-לשקול. בואו יבש ב-C ° 50 ל48 שעות. הערה: ייבוש תחת ואקום יקטן זמן ייבוש וייבוש התרבות בטמפרטורות מעל 50 מעלות צלזיוס עלולה לגרום resuspension קשה.
5. תרבויות אצות חנות מיובשות בטמפרטורת חדר לשימוש עתידי.

2. כימות Gravimetric של שומנים ניטרלי בהקסאן הפקה (מעובד מתוך בליי ^ו4 דייר)

1. מדוד כ 50 מ"ג ביומסה של אצות יבשות בצלחת לשקול. הערה: המונים הנעים 40-80 מ"ג יכולים לשמש ללא הפסד של שחזור.
2. העבר ביומסה למרגמה מראש נשטף עם הקסאן. במידת צורך, לשטוף את הצלחת לשקול עם כמות קטנה (1 מיליליטר) של הקסאן באמצעות פיפטה פסטר כדי להעביר לחלוטין ביומסה למרגמה. הערה: הקסאן הוא חומר נדיף והרעיל ביותר. זה חייב להיות מטופל במנדף עם בגדי מגן מתאימים.
3. לטחון ביומסה של אצות למשך 5 דקות באמצעות העלי. בגין עם טחינה עדינה ולהגביר את העצימות בהדרגה. לטחון ביומסה למשחה עדינה וחלקה בתקופה 5 דקות. אם הקסאן העודף משמש בעת העברה ביומסה למרגמה, עדיף לחכות להקסאן להתאדות לפני הטחינה.
4. הוסף כמה מיליליטר של הקסאן למרגמה ומערבבים את התערובת וכתוצאה מכך עם העלי עד שהוא הומוגני. ודא שכל פסולת התא דבקה בקירות של מורזפת הם דפקו חופשיים ותלויים בנוזל.
5. מעביר את התערובת ההמונית הקסאן התאים לצינור צנטריפוגות. הערה: צינור צנטריפוגות חייב להיות או זכוכית או פולימר מתאים בקנה אחד עם הקסאן כמו טפלון.
6. חזור על שלבים 2.4 ו2.5 עד שכל ביומסה הועברה לצינור צנטריפוגות (3-5x).
7. צנטריפוגה המדגם ב C ° 4 ל20 דקות ב 10,000 X גרם.
8. זהירות פיפטה את supernatant לתוך מתכת שקלה מראש לשקול מנה. אחסן במנדף.
9. מבצע חילוץ 2 ^nd הקסאן על ידי הוספת 3 מיליליטר של הקסאן לגלולה וvortexing במרץ דקות 1.
10. חזור על שלבים 2.7 ו2.8. במידת צורך, להפעיל את הדגימות למשך 30 דקות בצנטריפוגות במהלך החילוץ השני כדי להבטיח את כל פסולת התא מתיישבת באופן מלא. קביעת מסה של שמן מופק gravimetrically לאחר הקסאן התאדה לחלוטין.

3. Fluorometric כימות של שומנים ניטרלי באמצעות הנילוס האדום (כreporטד על ידי דה לה הוז סיגלר ואח'. ¹¹⁾

הערה: רק 10 μl של השעיה אצות ב5 גר '/ ליטר נחוץ לקריאת הקרינה. באופן כללי, בידוד של יומסה של אצות יבשות מ1.5 מיליליטר של מרק התרבות הוא יותר מהדרוש. כמו כן, עוצמת האור של המנורה בספקטרופוטומטר יכולה לפגוע לאורך זמן. מומלץ לכלול בתקנים בכל ניסוי, כדי להבטיח ששינויים במכשיר לא מוסיפים שגיאה מיותרת למדידות.

1. הכן פתרון הנילוס אדום בריכוז של 10 / מיקרוגרם מיליליטר מומס באתנול כיתה מגיב אלכוהול. אחסן את הפתרון הזה בחושך ב 4 ° C.
2. הכן פתרון אתנול 30% (v / v) במים וחנות deionized ב 4 ° C.
3. הכן את כל הדגימות של אצות באותו הריכוז ביומסה (5 גר '/ ליטר מומלץ) ובדיוק באותה צורה כמו בסטנדרטים המשמשים במדידה. עושה זאת על ידי שני דוגמאות מיובשות מראש המתלים בכמות המתאימהשל חיץ פוספט (dibasic אשלגן זרחה 0.6 גר '/ ל', monobasic 1.4 גר '/ L אשלגן פוספט), או התאמת הריכוז של תרבות של אצות גדלה עד 5 גר' / ליטר עם חיץ פוספט לאחר מדידת העכירות. הערה: לעתים קרובות יש מדידות שבוצעו בתרביות של אצות חיות שגיאה גדולה יותר הקשורים בהם בהתאם לדיוק של עקומת כיול עכירות. Resuspending דגימות יבשות עשוי לדרוש השימוש בhomogenizer לפזר ביומסה באופן מלא.
4. עבור כל דגימה, לערבב 80 μl של פתרון אתנול 30%, 10 μl של פתרון הנילוס האדום, ו10 μl של השעיה אצות בבאר אחד של צלחת 96 היטב. כדי להסביר כראוי לשונות של מדידת הקרינה, לבצע 5 חזרות של כל דגימה.
5. הפעל עקום כיול של שתי נקודות עם סטנדרטים שהוכנו קודם לכן על מנת לתת דין וחשבון לוריאציות היום יום במכשיר וההכנה. הכן את הסטנדרטים למדידת הקרינה באמצעות sהליך ame כדוגמאות. הערה: באופן כללי שתי נקודות מספיקות לכיול של המכשיר, ניתן להפעיל שלוש נקודות כדי לאמת את הליניאריות.
6. לבצע מדידות הקרינה בספקטרופוטומטר צלחת קורא רב גם. התנאים הבאים נמצאו להניב תוצאות עקביות ביותר ^11:
   1. לנער ב1,200 סל"ד, מסלול 3 מ"מ, ל30 שניות.
   2. לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
   3. לנער ב1,200 סל"ד, מסלול 3 מ"מ, ל30 שניות.
   4. שיא הקרינה, עירור ב 530 ננומטר, פליטה ב 604 ננומטר.
7. להמיר את מדידות הקרינה לתוכן שמן באמצעות התוצאות מהסטנדרטים הפנימיים.

4. טכניקת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

הערה: הפרוטוקול מכתים המתואר בסעיף 3 מיועד לניתוח כמוני, אבל זה גם יכול להיות שימושי כדי לספק ייצוגים חזותיים של טכניקות המבוסס על כתם במשך pu החינוכי וההמחשהrposes. כדי להפיק תמונות של הקרינה מדגם אחד דורש מיקרוסקופ אופטי עם מקורות שידור ותאורת epifluorescence נוסף מסורתיים. מסנני אור עירור והפליטה בטווח 530 ננומטר (ירוק) ו604 ננומטר (אדום), בהתאמה, יש צורך בכתם האדום הנילוס, כמו גם מצלמה מותקנת מיקרוסקופ עם התוכנה נלווית. התמונות מוצגות במחקר זה (איור 1) נרכשו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר מצויד במצלמה ומונוכרום ליחידת ממיר RGB. ההליך להפקת תמונות הקרינה הנילוס אדום שימוש בכלים אלה הוא המפורטים להלן:

1. הכן מדגם תרבות עם הכתם האדום הנילוס על פי סעיף 3 לפרוטוקול. הערה: מדגם בטווח ריכוז 5 גר '/ ליטר מייצר שקופיות של צפיפות תאים נאותה ללא צפיפות.
2. לאחר השלים שלב 3.6 של הפרוטוקול מכתים, להכין שקופיות מיקרוסקופ של מדגם מעובד על פי נהלי מעבדה סטנדרטיים.
3. החל עם מיקרוסקופ במצב שידור, טען את השקופיות שהוכנו למיקרוסקופ, ולאתר את התאים בהגדלה הרצויה (תמונות מוצגות במאמר זה נרכשו במטרה 100X).
4. ברגע שהתמקד, לעבור למיקרוסקופ מהעברה למצב תאורת epifluorescence. מקור האור צריך להיות עכשיו מגיע ישירות מהעדשה האובייקטיבית (זה יכול להיות אישר באופן חזותי על ידי התבוננות במרחב שבין השקופיות והעדשה האובייקטיבית).
5. הכנס מסנן עירור ירוק למקור האור ומסנן פליטת אדום לתוך נתיב תצפית האור; הקרינה של התאים המוכתמים צריכה עכשיו להיות גלויה ישירות דרך העינית.
6. לעבור את מצב תצפית מיקרוסקופ מהעינית למצלמה המותקן ומשתמש בתוכנת צפייה ללכוד תמונה של תאי fluorescing. בהתאם לרגישות של המצלמה, המדגם לא ייתכן בתחילה מופיע בחלון התצוגה המקדימה (כלומר המסךלהיות שחור); כדי לתקן את זה, להתאים את זמן החשיפה ורווח של המצלמה לרמה שבה התאים גלויים. הגדרות ספציפיות תשתנה עם מכשירים, ציוד וסוגי תאים.

תוצאות

תאי אצות נציג מוכתמים בצבע אדום הנילוס מתוארים באיור 1. החלקים A ו-B של תמונות תצוגת איור 1 א protothecoides גדל בחנקן עודף, מה שמוביל להצטברות שומנים תאית נמוכה מאוד. בחלקי C ו-D, דגימות של א ' protothecoides גדל תחת מגבלת חנקן מוצג. תחת תאורת שידור, גופי השומנים של התא יכולים להיות דמיינו עם בדיקה מדוקדקת של איור 1 ג, שבו הם מופיעים כמבנים עגולים מבריקים ומהווים את רוב נפח התא....

דיון

האצות המשמשות בעקומה סטנדרטית חייבים להיות אותו המין טיפח באותם תנאים ניסיוניים כמו אלה שנמדדו. שינויים משמעותיים בהרכב תקשורת, טכניקת טיפוח, ופרוטוקול מכתים יכולים להשפיע על עוצמת קריאת הקרינה. חילוץ הקסאן (המתואר בסעיפי 1 ו -2) שימש כדי לקבוע את תוכן שומנים הניטרלי של דגימות בשימוש בעקומה סטנדרטית. עבור מדידות עוצמת הקרינה מדויקות, כל הדגימות חייבת להיות מנותחות באותו הריכוז ביומסה (5 גר '/ ליטר היה בשימוש במחקר זה). תכולת שמן ולאחר מכן ניתן לקבוע בקלות על ידי השוואה לעקומה ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
משקל
25 מ"ל פיפטות חד פעמיות	פישר	13-676-10K
נורת פיפטה	פישר	13-681-51
40 מ"ל צינורות צנטריפוגה טפלון של נלג'ין	פישר	05-562-16A	טפלון דרוש לכלים
במשקל הקסאן (פוליפרופילן)	פישר	2-202B
1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה צינורות	פישר	05-408-129
צנטריפוגה	Sorvall	RC6plus
(Fisher 625D)	פישר	13-254-2
בקבוקוני אחסון	פישר	0337-4
מיקרוצנטריפוגה ספסל (Eppendorf 5415D)	פישר	05-40-100
כימות גרבימטרי
טיט חרסינה (קורסטק)	פישר	12-961A
עלי חרסינה (קורסטק)	פישר	12-961-5A
40 מ"ל צינורות צנטריפוגה (FEP)	פישר	05-562-16A	יכול להשתמש גם בצינורות זכוכית
פיפטות זכוכית פסטר	פישר	13-678-20C
כלי אלומיניום במשקל פישר		08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
כימות פלואורומטרי של תכולת
קורא צלחות פלואורסצנטי רב בארות	Thermo Lab Systems	פלואורוסקאן Ascent
	Systems	תוכנת עלייה 2.6
COSTAR 96 צלחת באר עם תחתית עגולה	פישר	06-443-2
נילוס אדום	סיגמא	N3013-100MG
אתנול (דרגת ריאגנט אלכוהול)	פישר	AC65109-0020
הדמיה תאים
Leica DMRXA2 (או שווה ערך) מיקרוסקופ	Leica	DMRXA2
שקופיות מיקרוסקופ	פישר	12-550-15
כיסוי מיקרוסקופ מחליק	פישר	12-541B
מצלמה	Qimaging	Retiga Ex
Imaging תוכנה	Qimaging	QCapture v.1.1.8