מאמר שיטה

ייצור מרוכז, חמצן שומנים מבוסס microbubble אמולסיות ידי הגזירה גבוהה Homogenization וריכוז סידורי

DOI:

10.3791/51467

⸱

26 במאי 2014

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטות לייצור כמויות גדולות של חמצן microbubbles שומנים מבוסס (LOMs) המיועד לאספקת חמצן לוריד באמצעות הומוגניזציה גבוהה גזירה וריכוז סדרתי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microbubbles גז מלא פותחו כניגוד אולטרסאונד וסוכני משלוח סמים. יכול להיות מיוצר על ידי עיבוד microbubbles פעילי שטח באמצעות sonication, תסיסה מכאנית, מכשירי microfluidic, או הומוגניזציה. לאחרונה, microbubbles חמצן שומנים מבוסס (LOMs) תוכנן כדי לספק חמצן לווריד במצבי חירום רפואי, היפוך היפוקסמיה מסכנת חיים, ומניעת פגיעה באיבר שלאחר מכן, דום לב ומוות. אנו מציגים שיטות לייצור מוגדל של microbubbles מחומצן מאוד באמצעות homogenizer גבוה גזירה לולאה סגורה. התהליך יכול לייצר 2 ליטר של LOMs המרוכז (90% לפי נפח) ב90 דקות. יש בועות וכתוצאה מקוטר ממוצע של ~ 2 מיקרומטר, ופרופיל rheologic בקנה אחד עם זה של דם כאשר מדולל ל60% בנפח. טכניקה זו מייצרת LOMs בקיבולת גבוהה ועם טוהר חמצן גבוה, טוען כי טכניקה זו עשויה להיות שימושית עבור מעבדות מחקר translational.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbubbles המורכב מחלבון, פולימר, ופגזי שומנים פותחו כוקטורים למשלוח סמים, ריפוי גנטי, וסוכנים בניגוד אולטרסאונד 1-5. בגלל שימושים טיפוליים אלה דורשים התמדת microbubble intravascular, microbubbles כזה מלא בדרך כלל עם גזים אצילים, גבוהים מולקולרי משקל כגון perfluorocarbons 6, שבו יש מסיסות נמוכה בדם ולייצב את 3,4 הבועה.

לאחרונה, microbubbles חמצן שומנים מבוסס (LOMs) תוכנן כדי לספק מינונים טיפוליים של חמצן, אשר עשוי לשמר את אספקת חמצן באיברי מטרה ולמנוע חוסר יציבות המודינמית בתקופות של חסימה בדרכי הנשימה או היפוקסמיה 7. תחליב המיועד לאספקת גז לוריד דורש תכונות עיצוב שונות מאלה המשמשים סוכנים בניגוד אולטרסאונד או משלוח תרופות ממוקד. ראשית, משום שהגוף צורך כמויות גדולות של גז חמצן (~ 200 מיליליטר / דקה), LOMs חייב להיות מיוצר והזריק בקנה מידה גדול. זה דורש שתהליך הייצור יהיה יעיל. שנית, תהליך הייצור צריך להיות בלולאה סגורה על מנת למנוע זיהום חנקן באמצעות החשיפה של LOMs (שאמור להיות מלאות ב100% חמצן) לסביבת אוויר. שלישית, משום שהמטרה של LOMs היא אספקת גז לוריד, את החלק היחסי של גז LOMs צריך להיות מוגדל, תוך הכרה במגבלות שהוטלו על ידי צמיגות תחליב 7. לבסוף, כמו בכל הזרקה תוך ורידית, שליטה מדויקת התפלגות גודל חלקיקים היא חיונית למניעת חסימת כלי הדם 8.

ישנן מספר שיטות שהוקמו לייצור microbubble. Sonication מנצל בעוצמה גבוהה, אולטרסאונד בתדירות נמוכה להחיל את ממשק אוויר הנוזל של תחליב הכולל פעילי שטח, כגון פוספוליפידים amphipathic, בנוכחותו של אמיץ גז לייצר microbubbles 7,9. תהליך זה הוא לשליטה על ידי שינוי אולטרהתדירות צליל, עוצמה ומשך דופק, והתפלגות גודל וכתוצאה מכך יכולים להיות מותאם כדי לייצר microbubbles של התפלגות גודל מסוימת, אם כי sonication משמשת רק לעתים נדירות בייצור של microbubbles קליני בשימוש. מיזוג הוא התסיסה מכאנית האינטנסיבית של פעילי שטח וגז במערכת סגורה, שהוא גם קשה בהיקף של עד כדי להכיל כמויות גדולות 2. מיקרופלואידיקה מבוסס אגל מאפשר שליטה מדויקת של התפלגות גודל microbubble 10-13. אמנם קשה באופן מסורתי בהיקף של עד, רב ערוצים, מיקרופלואידיקה מהירות גבוהה תוארו בו להגביר את יעילות ייצור microbubble 13. Microbubbles מיוצר באמצעות כל אחת מהשיטות הללו עשויים לדרוש תהליכי גודל הפחתה לאחר ייצור, כגון חלוקה צנטריפוגלי 14,15 ו הנפקת microbubble 16,17.

שיטה נוספת שהוקמה לייצור microbubbles מאוד יציב היא homogeniz גזירהation 6, אשר יכול לגרום לדפוס פוספוליפידים משושה ייצוב על משטח microbubble 18. בונה על המושג הזה, אנו מתארים את השילוב של homogenizer גזירה גבוהה בקו כדי ליצור LOMs הרכבה עצמית 19. בתהליך זה, homogenizer מנצל במהירות סיבוב להבים בסמוך למסכי emulsor הרשת בסדר כפולים, יצירת גזירה מכאנית והידראולית גבוהה ליצירת microbubbles. ריכוז סידורי של תחליב השומנים באמצעות מערכת זו מניב שבריר גז מרוכז יותר ויותר, אשר יכול להיות אפילו עוד יותר מרוכז על ידי צנטריפוגה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מערכת Set-up

המערכת מורכבת מאחזקה וריכוז טנק (HCT) מצויד במיקסר בשלב אחד, homogenizer גזירה גבוהה ב-line, משאבת הרים כדי להעביר נוזל בין HCT וhomogenizer, ומחליף חום (איור 1).

  1. הנח מעוקר, מצוידים עם 2 יציאות בסיס ו -3 יציאות בצד מתחת למיקסר שלב אחד כלי איסוף זכוכית 4 L פעור פה. מנמיכים את ראש המיקסר לפה של כלי השיט ולהבטיח הולם גז חזק באמצעות חותמות גומי או קלטת (על מנת למנוע את זיהום אוויר בסביבת מרחב הראש).
  2. תתאים אחד נמלי הבסיס (איור 1, # נמל 1) לHCT עם סטרילי "3/8 צינורות (ID) ברורים, כ 10" ארוך, מצויד בברזלי 3 כיוונים בקצה לאוסף של התחליב המרוכז .
  3. התאם את יציאת הבסיס השנייה צינורות, approximatel (איור 1, # יציאה 2) עם 3/8 סטרילי "(תעודת זהות)y 36 "באורך. להאכיל את הצינור הזה באמצעות משאבת הרים. התאם את המפרצון של homogenizer הגזירה הגבוה עם T-חתיכה כולל שתי יציאות ולחבר באופן הבא: חיבור צינורות מנמל # 2, באמצעות משאבת ההרים ולהתחבר ליציאת הצד של T-החתיכה. צרף את הנמל האחר למכל חמצן באמצעות flowmeter גז חמצן זרימה נמוכה.
  4. חבר את יציאת השקע של homogenizer הגזירה הגבוה ליציאת הכניסה של מחליף חום באונליין נשמר ב 4 ° C. חבר את יציאת השקע של מחליף החום לנמל השיבה של HCT (איור 1, # נמל 3), יצירת מערכת לולאה סגורה.
  5. צרף מיכל חמצן (דרך flowmeter) לHCT (איור 1, נמל # 4). צרף צג הרכב גז, כי הוא פתוח לאווירה ליציאה העליונה של HCT (איור 1, # יציאה 5).
  6. אם עקרות היא רצויים, לעקר את רכיבי זכוכית ומתכת לפני כל שימוש בחיטוי. לעקר את רכיבי צנרת ושיתוף פלסטיקnnectors ידי אתילן אוקסיד לפני כל שימוש. זה חשוב במיוחד אם המוצר הוא להיבדק in vivo.

2. ייצור LOM

  1. הנח 20 גרם של GMP 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DSPC) ו10 גרם של כולסטרול בבסיס של HCT. להוסיף 1 ליטר של פלזמה-Lyte לHCT ויד ומערבבים דקות 1, שילוב כמה שיותר שומנים ככל האפשר לשלב מימיים.
  2. מנמיכים את מיקסר שלב אחד אל השלב המימית, להבטיח כי כל ראש המיקסר מכוסה בשלב המימית. ודא שהחלק העליון של HCT הוא גז חזק (ראה שלב 1.1 לעיל), וכי אין תופעות יציאות פתוחות. הפעל את מקור הגז המחובר ליציאת מס '4 ולחכות עד שבר החמצן של אמיץ HCT מגיע> 95%. ב10 ליטר / דקה (LPM), זה צריך לקחת ~ 10 דקות.
  3. שימוש במיקסר שלב אחד, לערבב התחליב מבשר על 5 דקות בסל"ד 5,000. התערובת המתקבלת צריכה להופיע לבנה חיוור ואינם מכילה שום LIPI גלויגושי ד. מעורב פעם, תערובת שומנים מים שאינם בשימוש ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 30 ימים לפני שימוש יחיד.
  4. ראש מערכת הלולאה סגורה כולו עם תחליב המבשר ידי הפעלת משאבת ההרים ב1.3 LPM. ברגע שהמערכת דרוכה, לשמור על המשאבה ב1.3 LPM.
  5. כדי להתחיל ייצור של LOMs, הדלק את homogenizer הגזירה גבוהה באונליין ל -7,500 סל"ד. מייד לאחר מכן, הפעל את זרימת חמצן לחלק המפרצון של homogenizer ב0.5 LPM. שמור את המיקסר בשלב אחד (בHCT) ב3,500 סל"ד. LOMs נוצרים בממשק של להבי הרוטור ומסכי emulsor בתוך homogenizer ב-line (איור 2). בתוך דקות, נוזל צריך להיות גלוי יותר צמיג. גישה מחמירה יותר היא לקבוע צמיגות כפונקציה של זמן, שבו ניתן לעשות זאת על ידי הסרת aliquots מיום 1 בנמל במהלך ייצור וניתוח עם viscometer.
    הערה: אם בועות אוויר נראות לעין נמצאות בצינור יציאה מהמיקסר, חמצןתזרום לhomogenizer באונליין הוא גבוה מדי. לכיל את זרימת גז עד הנוזל הוא אטום ולא מכיל בועות גז גלויות.
  6. להפעיל את המערכת במשך 15 דקות, ולאחר מכן לכבות את homogenizer הגזירה הגבוה וכניסת החמצן אליו. תמשיך להפעיל את מיקסר שלב אחד בHCT עד תחליב מוסר; זה מפחית את הסיכון הפרדת פאזות ושומר על המוצר יחסית אחיד בתוך HCT.
    הערה: הנפח של תחליב הגז מלא צריך להגדיל בכ 2-3x בשלב ריכוז סדרתי. אם זה לא, בדוק כדי להבטיח חמצן שזורם לתוך homogenizer הגזירה הגבוה וכי ריכוזי שומנים בתחליב המבשר נכונים. יעילות של ייצור יורדת ככל שריכוז שומנים בדם יורד.

3. איסוף, ריכוז, הערכה, וחפצים של LOMs

  1. צרף סטריליים, שונה 140 מיליליטר מזרק luer נעילה לברזלים צמודים לנמל בסיס המס '1 בכלי האיסוף. צייר את 100 מיליליטר של נוזל. חוזקה כובע מזרק וחזור על פעולה עד שכל הנוזל הוסר.
    1. שינוי מזרקים על ידי נסיגה של אוויר 100 מיליליטר לתוך המזרק ולאחר מכן מנסר את בוכנת מזרק וחומר עודפים מעל סימן מיליליטר 140. מלא ומזרקים ריקים באמצעות מלקחיים שיניים לצייר את הבוכנה. שינוי זה מאפשר לצנטריפוגה קלה יותר.
  2. מזרקים צנטריפוגה עם הסוף הכתיר אוריינטציה כלפי מטה בצנטריפוגה דלי (4 מעלות) בקירור ב 225 XG 10 דקות.
  3. שלוש שכבות של חומר יופיעו לאחר צנטריפוגה. לגרש את השכבה התחתונה של שלב מימיים מעונן עודף וזורק. השכבה השנייה היא לבנה בוהקת ומכילה LOMs המרוכז. העבר את הקצף מרוכז למזרק גז חדיר באמצעות ברזלים שלוש דרך על מנת למנוע זיהום גז סביבה. מחק את השכבה הסופית, המכילה גז חמצן חופשי מLOMs מקרע.
  4. ניתן להעריך איכות קצף על ידי להגיע ≥ גז 90% מקצף מרוכז. Calculאכלתי ריכוז גז באופן הבא:
    % בנפח גז = [(משקל קצף / קצף נפח) - 1] x 100
    1. כבקרת איכות שנייה, microbubbles הגודל ידי התקדרות אור כדי לקבוע אם גודל חלקיקים נמצא בטווח הצפוי. יצוין, כי שינוי בזמן הומוגניזציה או ניסוח עשוי לשנות גודל בועה.
  5. חוזקה מכסה את מזרק הזכוכית עם הולם luer נעילה. יכול להיות מדולל LOMs המרוכז עם פלזמה-Lyte בעת השימוש. ניתן לאחסן את מזרקים ב22, 4, או -20 º C; טמפרטורות קרות יכולות לספק יציבות חיי המדף משופרת 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המגון גזירה גבוה מאפשר ייצור יעיל (כלומר בתוך יום אחד) של LOMs מספיק למחקר בבעלי חיים ואינו דורש מומחיות טכנית. ברגע שבקיא, עד 2 ליטר של LOMs המרוכז יכול להיות מיוצר ב90 דקות.

גודל microbubble ומורפולוגיה הוערכו על ידי מיקרוסקופ אור ועל ידי התקדרות אור. כאשר מדגם 10 μl של LOMs היה דמיינו, LOMs הכדורי היו האמור, כמו גם מיעוט יחסי של שומנים בדם פסולת (איור 3 א). הדבר נכון במיוחד כאשר משמש ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצעדים החשובים ביותר ליצירת LOMs המרוכז, מחומצן מאוד כוללים: 1) להבטיח כי האמיץ בתוך HCT נשאר מחומצן באופן מלא; 2) להבטיח כי הטוהר של חומרים בלתי פעילים שומנים הוא אופטימלי (כולל תנאי אחסון ושימוש במוצרי GMP); 3) להבטיח כי שומני האבקה לערבב לחלוטין עם השלב המימית לפני תחול המערכת; ו4) הקדשת תשומת לב לעלייה בשבריר גז בתוך HCT כדי להבטיח שעוצמת השבר של גז אינו עולה 70%.

השיטה שאנו מתארים כאן מנצלת המגון גזירה גבוה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימון: מחקר רפואי של צבא ארצות הברית וציוד פיקוד (USAMRMC) ומנוהל על ידי טלרפואה וטכנולוגיה מתקדם מרכז מחקר. Shunxi ג'י תרם השינוי של המזרקים כפי שמתואר כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)Avanti Polar Lipids770365מוצר חלופי: non-GMP מ-NOF America (Coatsome MC-8080)
CholesterolSigma AldrichC75209
Plasma-Lyte AVWR80089-818לחלופין יכול להשתמש בכלי
איסוף NaCl GlassSpecialty Glass, Inc.מותאם אישית: פאם זורבריק - 281-595-2210
צג הרכב גז (חמצן)
רפואי מדויק Sarns 8000Calicut Medical16407חלק ממערכת זלוף מודולרית
מחליף חום BIOthermMedtronicECMOtherm-II
Verso מעבדה במיקסר מקווןSilverson Machines, IncTH-IL-102-VERSOהשתמש בראשי עבודה רב-שלביים והארכה קדמית עם חתיכת T
חתיכת T עבור יציאת כניסת סילברסון ורסוחידושי תהליךמותאם אישית: בריאן ליוויט - 508-423-2266
מערבל מעבדה L5M-ASilverson Machines, IncNC0136483 השתמש במסך מתחלב רשת (עדין)
מלקחיים עם שיניים של רוצ'סטר-אוקסנרפישר סיינטיפיק13-812-18
מזרק 140 מ"לKendall Healthcare Monoject8881114030ודא שיש מנעול לואר.
IX71 מיקרוסקופ אור הפוךאולימפוסIX71
מצלמת מיקרוסקופ Retiga-2000RQImagingRET-2000R-F-M-12
מאשים 780A דילול אוטומטיPSS-NICOMP מערכות גודל חלקיקיםמחוץ לייצור
איש קשר משאבת רולר PM5900L איש קשר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
  2. Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
  3. Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
  4. Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
  5. Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
  6. Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
  7. Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
  8. Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
  9. Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
  10. Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
  11. Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
  12. Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
  13. Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
  14. Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
  15. Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
  16. Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
  17. Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
  18. Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
  19. Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים