הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים

8.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51477

⸱

16 באפריל 2014

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.

תקציר

ארבעה ממדים (4D) אור הדמיה נעשתה שימוש כדי ללמוד את ההתנהגות של מבנים קטנים בתוך מסוף עצב המוטורי של transversus abdominis שריר הרזה של נחש הבירית. הנתונים גולמיים כוללים רצפים של Z-ערימות 3D זמן לשגות. כל ערימה מכילה 4-20 תמונות שנרכשו עם אופטיקה epifluorescence במטוסי מוקד מופרדים על ידי 400-1,500 ננומטר. שלבים ברכישת ערימות של תמונות, כגון התאמה של מיקוד, מיתוג של אורכי גל עירור, ותפעול של המצלמה הדיגיטלית, הם אוטומטיים ככל האפשר על מנת למקסם את קצב תמונה ולמזער את הנזק לרקמות כתוצאה מחשיפה לאור. לאחר רכישה, קבוצה של ערימות תמונה deconvolved כדי לשפר את הרזולוציה מרחבית, שהומר לפורמט 3D הרצוי, ומשמש ליצירה "סרט" 4D כי הוא מתאים למגוון רחב של ניתוחים מבוססי מחשב, בהתאם לנתונים הניסיוניים ביקשו. יישום אחד הוא מחקר של ההתנהגות הדינמית של שתי מעמדות של endosomes מצאו במסופים-macroendosomes עצב (MES)וendosomes חומצי (AES), שגדלים (200-800 ננומטר עבור שני הסוגים) הן ליד או לגבול ההשתברות. גישה למידע 3D בכל נקודת זמן מספקת מספר יתרונות על פני הזמן לשגות הדמיה קונבנציונלית. בפרט, גודל ומהירות תנועה של מבנים ניתן לכמת לאורך זמן ללא אובדן המיקוד חד. דוגמאות לנתונים מהדמית 4D עולים כי MES ניגש קרום הפלזמה ונעלמים, מה שמרמז שהם exocytosed ולא רק נעים אנכי ממישור אחד של מוקד. חשף גם הוא היתוך משוער של MES ו-AES, על ידי הדמיה של חפיפה בין שני המבנים המכיל צבען כפי שנצפו בכל שלוש תחזיות המאונכות.

מבוא

זמן לשגות הדמיה של רקמת חיה מספקת גישה חזותית ליחסי תפקוד והמבנה דינמיים, שלא ניתן להערכה בהכנות קבועות או חיים צילמו בנקודה אחת בזמן. לעתים קרובות, עם זאת, שהתגמול עבור גישה למידע זמני הוא ירידה ברזולוציה אופטית. מטרות נפט טבילה צמצם מספרי גבוהה הן מעשיות ברקמת חיה בגלל הטווח הצר שלהם בפוקוס, והשאירו את הטבילה במים או מטרות יבשות כחלופות בלבד. יתר על כן, ברזולוציה המוגברת המוענקת על ידי אופטיקה confocal לא יכולה להיות מנוצל בכמה הכנות חיים בשל phototoxicity מהרמות גבוהות היחסי של תאורה הנדרשת 1,2. לבסוף, בעוד כמה שיטות אופטיות בזמן אמת או זמן לשגות זמינות שרזולוציה משופרת ההצעה, תחולתם מוגבלת להכנות שבו מבנים של עניין יכולים להיות ממוקמות בתוך כמה מאה ננומטרים של המטרה 1. השיטה המתוארתעושה שימוש בציוד בעלות נמוכה יחסית, הוא תכליתי, ובכל זאת מציעה רזולוציה משופרת בהשוואה לטכניקות זמן לשגות יותר נפוץ בשימוש. הוא מיועד לשימוש במעבדות בודדות, כמו גם מתקני הדמיה.

השיטה משתמשת במיקרוסקופ epifluorescence קונבנציונלי, בשילוב עם מצלמה דיגיטלית רגישה ועם חומרה שנועדה לרכוש במהירות סטים של תמונות במישורים שונים מעט מוקד (Z-ערימות). כל Z-מחסנית היא deconvolved דיגיטלי כדי להגדיל את הרזולוציה. תכונה אחת של 3D הדמיה זמן לשגות (4D) היא מעקב מדויק של העברת אברונים או מבנים אחרים. כאשר להגדיר כראוי, מבנים צילמו לא לצאת מפוקוס, ותנועה בכל שלושת הכיוונים ניתן להבחין ולכמת. לכן זה בלתי אפשרי עבור מבנה מוכתם להיעלם מעל מסגרות זמן לשגות אחד או יותר רק על ידי היסחפות מעל או מתחת למישור מוקד צר. השיטה משמשת גם ככלי רגיש להערכת האינטראקציות ופו האפשרישיאון של מבנים קטנים. epifluorescence הקונבנציונלי או תמונות confocal של מבנים סמוכים לגבול ההשתברות (כמה מאה ננומטר) לא לאשר מיזוג גם אם תמונות התמזגו להראות חפיפה של התוויות שלהם 3. היתוך הוא הציע, אבל זה עדיין אפשרי שהאובייקטים מופרדים אופקי או אנכי על ידי מרחק שהוא מתחת לגבול ההשתברות. שלוש או הדמיה ארבעת ממדים, לעומת זאת, מאפשרת צפייה באובייקטים בכל אחד משלושה כיוונים מאונך. המראה של היתוך בכל שלוש התצוגות מגדיל את רמת הוודאות. וגם, בכמה הכנות חיים, בבימוי או תנועה הבראונית של אובייקטים התמזגו putatively מספקת הוכחה נוספת, כאשר שני התוויות לנוע יחד בזמן. כמובן, כאשר סמוך לגבול השתברות רמת הוודאות במבני הבחנה מהרקע, או שמראה שהם מכילים שני צבעים (היתוך), אינה מוחלטת. אם טכניקות ישימות, מיוחדות, כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג)4, הם מתאימים יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. כתם ההכנה עם Supravital צבעים

  1. לפרוטוקול נתיחת נחש הבירית לראות סטיוארט et al. 5 וטנג et al. 6 רקמות זוחלות נשארה פיסיולוגיות לזמנים ארוכים יותר, ועם פחות זיהום חיידקים, כאשר כל הזמן בטמפרטורות נמוכות (ראה להלן). רקמות יונקים בדרך כלל נשמרו בטמפרטורת חדר ומעלה.
  2. עבור מכתים צבע חיוני lysosomal, לפזר את הצבע ב1:5,000 הקר הזוחל אצבעות פתרון (0.2 מיקרומטר). דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לשטוף מספר פעמים עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי.
  3. לFM1-43 צביעה באמצעות גירוי KCl, לדלל את הצבע ב-high-KCl האצבעות 1:500 (7 מיקרומטר). דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 מרבי שניות. שטוף במהירות שלוש פעמים עם אצבעות קרות, ~ דקות 1 / שטיפה. תמונה בהקדם האפשרי.
  4. לFM1-43 צביעה באמצעות גירוי hypertonic (סוכרוז), לדלל את הצבע ב0.5 M אצבעות סוכרוז כאמור לעיל. דגירה על 4 & #176; C למשך 2-5 דקות. שטוף כמו בשלב 1.3 לעיל עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי.
  5. עבור מכתים FM1-43 באמצעות גירוי חשמלי, ראה טנג et al. 6 בקצרה, ההכנה ממוקמת מנה המכילה תמיסת מלח פיזיולוגית וצבע. עצב מגורה עם רכבת מתוכנת מראש של 200 μsec פולסים מלבניים (~ 7 V, 30 הרץ, 18 μsec). שטוף כמו בשלב 1.3 לעיל עם אצבעות קרות. תמונה בהקדם האפשרי.

2. הגדר את ההכנה להדמיה

  1. לכוון את ההכנה כך שמבנים של עניין הם קרובים ככל האפשר למטרת מיקרוסקופ.
  2. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוכה, לנצל את תא תחתון שמכיל להחליק את מכסה עגול דק. בדרך כלל, חדר ההדמיה צריך תחתית נירוסטה דקה עם תלוש 25 מ"מ קוטר # 1 זכוכית עובי כיסוי במרכז. אם נעשה שימוש במיקרוסקופ זקוף, coverslip תחתון הוא לא חובה אבל שימושיכדי לאפשר הדמיה עם אור מועבר (למשל התערבות ההפרש לעומת זאת, DIC) כדי לכוון את הדגימה ולאתר אובייקטים של עניין.
  3. בחר אובייקטיבי מתאים לקבל את ההחלטה ב3D הגבוהה ביותר האפשרית. ישנן פשרות בין צמצם מספרי (na), מרחק עבודה, הגדלה, וסוג של עדשה (יבש, מים ונפט טבילה). להכנות דקות כמו תרביות רקמה, מטרות נפט הן הטובות ביותר. השימוש במיקרוסקופ זקוף, לצוף להחליק את מכסה על האמבט המימית, ולהשתמש בשמן טבילה בין החלק העליון של להחליק את המכסה והאובייקטיבי.
  4. אם תוכנת deconvolution משמשת, הספק עשוי לספק פונקציות שנקבעו מראש נקודת התפשטות (PSFs) למטרות מסוימות. אם אין מידע כזה מסופק, או אם מטרה שאינה נתמכת נבחרה, לקבוע את כוחות הביטחון הפלסטיניים על ידי הדמיה ממוזערת ניאון או אובייקטים עקיפה מוגבל דומים 7,8.

3. להקים את עומק הרצוי של שדה ומספר ImaGES הרצוי לכל מסגרת זמן לשגות

  1. בחר בעומק הכולל של שדה, כך שהעברה או אינטראקציה מבנים של עניין לא נעלמים או ללכת מחוץ לפוקוס, כאשר הם עוברים בכיוון-z. Z-השדה צריך מעט לחרוג מהממד האנכי של התא בתהליך או תא להיות הדמיה. למסופים מנוע חוליות, 15-20 מיקרומטר הוא טיפוסי.
  2. לחשב את צעד Z-ציר צורך שלכל תוספת של מוקד. החלטה לאורך ציר Z-משתנה בהתאם מאפיינים של המטרה; זה בערך רבע מרזולוצית מישור XY. אם אחד confocal הדמיה או תוכנת deconvolution משמשת, ברזולוציה Z-ציר משופרת. שפר את ההחלטה סופית על ידי דגימת יתר מכוונת בכיוון-z 5, אבל ראית גם צעד 3.3 להלן. מרווח צעד אופייני הוא בטווח של 400-1,500 ננומטר למטרות 40-100X. אור צריך להיות מוגף מבין כל תמונת Z-צעד.
  3. בחר את מספר התמונות לZ-מחסנית, כלומר העומק הרצוי של שדה מחולקעל ידי מרווח הצעד. זמן כדי להשלים את Z-מחסנית טיפוסית הוא 1-10 שניות. אובייקטים הנעים במהירות (100 ננומטר / sec) יכולים להופיע מטושטשים בערימת תמונת 3D משום שכל מטוס תמונה מתאים לנקודת זמן שונה במקצת. כמו כן, כל תמונה נוספת תורמת לphotobleaching וphototoxicity האפשרי (ראה דיון). אם אחד המצב נוגע, לבחור Z-צעד גדול יותר כדי לאסוף פחות תמונות לכל מחסנית. לפצות מאוחר יותר באמצעות תוכנת אינטרפולציה תמונה (שלב 6.3 בהמשך).

4. בחר מסגרת שיעור הזמן לשגות

בחירה לפי ניסויי שיעור, כי הוא פשוט מספיק כדי לפתור בצורה חלקה משתנה עם זמן, כגון תנועה, אינטראקציות או אירועי היתוך 9. על פי דגימה יכולה לייצר חפצי תנועה (טעויות דגימה), ואילו דגימת יתר שלא לצורך מגדילה את החשיפה לאור. לאסוף או רצף ארוך אחד או כמה רצפים חוזרים ונשנים של אותה הכנה, כל אחד עם סך מרווח קטן יחסית בזמן ( מ 'לדוגמא). במידת האפשר, להציג את ההכנה עם תאורת epifluorescence מתמשכת בערך מהירויות תנועת הערכה, כולל סחיפה של כל ההכנה אם הוא קיים.

5. להשלים את כל הדמית החיה להכנה מסוימת

הכנות זוחלים בדרך כלל להישאר חזקות עבור ~ שעה 1-2, יותר אם מקוררות.

6. לנתח את הנתונים על פי שימוש רצוי

  1. לשמור את כל קבצי הנתונים הגולמיים. בעוד אחסון דיגיטלי הוא בדרך כלל לא בעיה, זמן עיבוד הוא משמעותי גם עם מחשבים אישיים מהירים או תחנות עבודה. מסיבה זו, יבול תמונות לתוך אזור של [ROI] ריבית. להבטיח כי האזור כולו של עניין הוא בחלון שנחתכו במהלך הזמן כולו.
  2. Deconvolve תמונת ערימות באמצעות תוכנה מתאימה ופונקצית נקודת ההתפשטות הנכונה. לאשר החלטה שהוא השתפר וששום חפץ כבר נוצר על ידיאלגוריתם deconvolution. איור 3 מציג תמונות ירושלים.
  3. השתמש באלגוריתם אינטרפולציה להרחיב רזולוציה לכאורה Z-ציר. התרחבות 6X מהפרדת מטוס בפועל תמונת 1.5 מיקרומטר להפרדת מיקרומטר לכאורה 0.25 הוא הציע. לחלופין, להשתמש בחלק שילוב של דגימת יתר (שלב 3.2) ואינטרפולציה.
  4. בצע ניגודיות, בהירות, סינון רעש, photobleaching והתאמות עיבוד תמונה טיפוסיות אחרות אם תרצה בכך. סטנדרטים תמונת מניפולציה להכתיב כי עבור רוב העבודה מדעית, מן ראוי שאותם התיקונים שיחולו על כל התמונות, גם בתוך ערימה ובנקודות זמן שונות. התוצאה של התאמה מסוימת יש לבחון בין כל התמונות 9.
  5. בחר מצב תצוגה מיוחד ליצוא של נתונים. התצוגה הברורה ביותר היא וידאו סטריאו או באמצעות anaglyphs אדום ירוק או אדום הכחול (דוגמאות באיור 3), זוגות סטריאו, או לסירוגין שמאל / righהעין לא מסגרות עם משקפיים תריס. Anaglyphs מוגבל לצבע יחיד. שפר את עומק תמונה נראית לעין אם תרצה בכך כדי לשפר את הרזולוציה חזותית Z-ציר.
  6. להתנסות בשיפור טכניקות סינון ותמונה שונות. לדוגמא, סינון Laplacian שימושי כדי להגדיל את הניגודיות של מבנים קטנים מעל רקע. הבהירות של פיקסלים במרכזו של חלון הפעלה משופרת תוך בהירות של הסביבה היא מופחתת. שים לב שכמה שיטות סינון אינן פועלות היטב בשילוב.
  7. החל תיקון להיסחף אם יש תנועה משמעותית של התכשיר לאורך זמן. תנועה כזו היא נפוצה בחיים שריר, אפילו עם סמים הוסיפו לדכא את פוטנציאל פעולה ופוטנציאל הסינפטי. אלגוריתם רישום פיקסל (למשל. Imaris, תוצאות הלוואי של Adobe, תוסף TurboReg לImageJ) מיישר זמן לשגות תמונות ויכול להפחית, אבל בדרך כלל לא לבטל לחלוטין, תנועה כזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הנתונים שמוצגים הם ממסופי התוקפת נחש (לראות תצוגות ההגדלה נמוכות וגבוהות באיור 3; צבע endocytic (FM1-43) הספיגה יוצר אובך שממלא כל אחד בוטון), ובפרט, macroendosomes (MES) וendosomes חומצי (AES) בתוך מסופים אלה 5. MES נוצרים על ידי אנדוציטוזה בתפזורת במהלך פעילות עצבית 10 ומספרם יורד באופן אקספוננציאלי עם זמן לאחר הפעילות חדלה 6. שימוש בהדמיה לחיות 4D היה לקבוע אם MES לנוע לעבר קרום הפלזמה ובמהירות נעלמת, טוען כי מספרם יורד כי חלק מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ההיבט הקריטי ביותר של ההדמיה 4D הוא ניהול של המשך ועוצמת חשיפה לאור. Photobleaching יורד יחס אות לרעש בתמונה ויכול להיות בעייתי או לא תלוי בגורמים שונים, לרבות בחירה של fluorophores. נזק ספציפי לרקמת חיה (phototoxicity) קשור לphotobleaching, ולעתים ניתן לזהות באמצעות בדיקות ניאון נועדו למטרה 2,12 או על ידי בדיקה של מורפולוגיה עם אופטיקה brightfield המתאימה, כגון התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC).

זה אפשרי,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות גרנט NS-024,572 (לRSW).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
SGC5ביוטיום, הייוורד, קליפורניה70057קונקציה סופית: 10 מ"מ
FM1-43FXInvitrogen, קרלסבד, קליפורניהF35335קונקציה סופית: 7 מ"מ
LysoTracker RedInvitrogen, קרלסבד, CAL7528קונקציה סופית: 0.2 מ"מ
צלצולי זוחלים pH 7.2
NaCl145 מ"מ
KCl2.5 מ"מ
CaCl<תת>23.6 mM
MgSO41.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)1.0 mM
HEPES5.0 mM
זוחל KCl גבוה רינגרים pH 7.2
NaCl86 מ"מ
KCl60 מ"מ
CaCl23.6 mM
MgSO41.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)1.0 mM
HEPES5.0 מ"מ
צלצולי סוכרוז גבוהים pH 7.2
NaCl145 מ"מ
KCl2.5 מ"מ
CaCl23.6 mM
MgSO41.8 mM
KH2PO4 (Dibasic)1.0 מ"מ
HEPES5.0 מ"מ
סוכרוז0.5 מ' (17.1 גרם/50 מ"ל)
Axioplan 200 מיקרוסקופ הפוךCarl Zeiss, Thornwood, NYa href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com
>N-Achroplan 63X מטרת מים; n.a.=0.9; מרחק עבודה = 2.4 מ"מ  קארל זייס, ת'ורנווד, ניו יורקa href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com
DG4 שילוב מקור אור/מסנן עירור מחליף גלגליםSutter Instruments, Novato, CA175W מנורת קשת קסנוןwww.sutter.com
Lambda 10-2  מחליף גלגל מסנן פליטהSutter Instruments, Novato, CAwww.sutter.com
Sensicam CCD מצלמהCooke Instruments, Tonawanda, NYa href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com
Cascade 512 CCDמצלמה פוטומטרית, טוסון, AZa href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com
כלי הדמיה- תוצרת בית - קוטר 11 ס"מ; קוטר 25 מ"מ. כיסוי #1 מוטבע; פינים מגנטיים
תוכנה
Slidebook 5.0חידושי הדמיה חכמים, דנבר, CODeconvolution; תיקון סחיפה; הצגת נתונים בתלת-ממד ו-4Dwww.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2Bitplane, South Windsor, תיקון CTDrift; הצגת נתונים בתלת-ממד ו-4Dwww.bitplane.com
AfterEffects CS6Adobe, סן חוזה, קליפורניהתיקוןדריפטwww.adobe.com
ImageJ 1.46המכונים הלאומיים לבריאות, בת'סדה, MDתוספים מרובים זמינים; בניית זוג סטריאוhttp://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSMCarl Zeiss, Thornwood, NYבניית זוג סטריאוwww.zeiss.com
<<<<

מקורות

  1. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).
  2. Tinevez, J. -Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
  3. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
  4. Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
  5. Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
  6. Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
  8. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
  9. Cromey, D. W. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. Taatjes, D. J., Roth, J. 931, 1-27 (2013).
  10. Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).
  11. Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).
  12. Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. Mendez-Vilas, A., Diaz, J. , 1495-1505 (2010).
  13. Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאקרואנדוזומיםאנדוזומים חומצייםצביעה ב-FM 1-43רכישת Z-stackדקונוולוציה של תמונות (Image Deconvolution)תצוגות נפח בתלת-ממדהיטל אורתוגונלי
ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.