מאמר שיטה

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

11.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51479

⸱

21 במאי 2014

 , 
1Department of Neurobiology & Anatomy, University of Utah

במאמר זה

סיכום

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

תקציר

יונקים להיכשל בהתאוששות חושית ומוטורית בעקבות פציעה בעמוד השדרה בשל חוסר צמיחה מחודשת אקסון מתחת לרמה של פציעה, כמו גם חוסר יכולת reinitiate נוירוגנזה השדרה. עם זאת, כמה anamniotes כולל תערוכת rerio Danio דג הזברה הן חושית והתאוששות תפקודית גם לאחר חיתוך רוחב של חוט השדרה. דג הזברה המבוגר הוא אורגניזם מודל שהוקם לחקר התחדשות בעקבות פציעה בחוט השדרה, עם התאוששות חושית ומוטורית על ידי 6 שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את היתרונות של ניתוח vivo של תהליך ההתחדשות זמינים בדג זברת הזחל השקוף, כמו גם כלים גנטיים אינם נגישים במבוגרים, אנו משתמשים בדג זברת הזחל ללמוד התחדשות לאחר חיתוך רוחב של חוט השדרה. כאן אנו מדגימים שיטה לreproducibly וverifiably transecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, הנתונים שלנו מראה התאוששות חושית תחילת ב2 ימים לאחר פציעה (dpi), שנינותשעות תנועת C-עיקול לזיהוי על ידי 3 dpi וחידוש של שחייה חופשית בשיעור של 5 dpi. לכן אנו מציעים דג הזברה הזחל ככלי לוויה לדג הזברה המבוגר לחקר ההתאוששות לאחר פגיעה בחוט השדרה.

מבוא

טראומה גדולה לחוט השדרה האנושי לעתים קרובות תוצאות שיתוק ואיבוד התחושה מתחת לרמה של פגיעה קבוע, בשל חוסר היכולת לגדל מחדש אקסונים או reinitiate נוירוגנזה 1,2. בניגוד ליונקים, לעומת זאת, anamniotes כוללים סלמנדרות ודג זברה (Danio rerio) מראה התאוששות חזקה גם לאחר חיתוך רוחב חוט השדרה 3,4.

דג הזברה המבוגר הוא מודל מבוסס היטב ללימוד תהליך ההתאוששות לאחר פגיעה בחוט השדרה 5-7. בעקבות חיתוך רוחב חוט השדרה שלם, הקמתה מחדש של תפקוד חושי וקטר הוא ציין בדג הזברה המבוגר ב -6 שבועות שלאחר פציעה 8. על מנת לבחון את תהליך התחדשות in vivo, פנינו לדג זברת הזחל השקוף 9.

כאן אנו מציגים שיטה ותחצה את חוט השדרה של 5 ימים לאחר ההפריה USI דג הזברה (DPF) זחלng פיפטה משופעת microinjection כאזמל, שונה מהאט, et al. 10 שיטה זו תומכת בקצב העברת נתונים גבוה, תמותה נמוכה, ושחזור. בעזרת תרגול, ניתן transected 300 זחלים / שעה, ובמשך 6 חודשים של transections, כוללים מעל 3,600 בעלי חיים, 98.75% ± 0.72% שרדו עד 7 ימים לאחר פציעה (dpi). הנתונים שלנו מראה התאוששות מהירה של תנועה חושית וגם: בdpi 1, כל התנועה על ידי הדגים הפצועים היא מונעת על ידי תנועת סנפיר חזה בלבד. עם זאת, זחלים מתחילים להגיב למגע טונגסטן הזנב מחט לחיתוך רוחב של 2 dpi, להקים מחדש את תנועת C-עיקול על ידי 3 dpi, ולהציג את חיה טורפת בשיעור של 5 dpi 11. באמצעות מכתים נוגדן כנגד טובולין acetylated, יש לנו אישרו כי האקסונים נעדרים מאתר הפציעה בdpi 1, אבל חצינו את הפגיעה באתר על ידי 5 dpi. אנו מאמינים פרוטוקול זה יספק טכניקת ערך לחקר צמיחה מחודשת אקסון ונוירוגנזה בחוט השדרה בעקבות פציעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דג הזברה גדלו וגדלה על פי נהלים קבועים; ניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש מוסדי יוטה.

1. הכנת לוחות ניתוח

  1. הפוך צלחות ניתוח באמצעות 60 מ"מ צלחות פטרי וSylgard 184 ערכת סיליקון אלסטומר, בעקבות הוראות יצרן. מלא מנות לא יותר מחצי מלא ולאפשר לפלמר. חנות מכוסות בטמפרטורת חדר.

2. הכנת Micropipettes

  1. לפברק micropipettes על ידי חימום ומשייכת צינור נימי ורוסיליקט קיר דק בחולץ micropipette עם אותן ההגדרות להכנת מחטי microinjection.
  2. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להצמיד את קצה micropipette כ 200 מיקרומטר בקוטר עם מלקחיים.
  3. קצה שבור פוע עם microgrinder תחילה ל35 °, ואחריו beveling שני 25 מעלות. ודא קצה חד וSMOOTH. חנות סיימה micropipette המשופע בצלחת פטרי על כמות קטנה של חימר.

3. הכנת דג הזברה הזחלים

  1. 7 ימים לפני הניתוח, להגדיר טנקי הזדווגות של דג הזברה זכר ונקבה.
  2. איסוף עובר למחרת בבוקר, 3 שעות אחרי שהאורות באים על מנת להבטיח תשואה מקסימלי. אם אתם משתמשים בקו כתב מהונדס כגון Tg (elevl3: eGFP) knu3, עוברים מופרים סוג 100/100 צלחת מ"מ ב25 מיליליטר של E3 על 28.5 ° C. אם באמצעות wildtype, מופרה סוג עוברים 25/100 צלחת מ"מ ב25 מיליליטר של E3 על 28.5 ° C.
  3. אם אתם משתמשים בקו עיתונאי, מסך עובר לביטוי ניאון ב48 hpf. אפשר לעוברים מזוהים להבשיל בצפיפות של 25/100 צלחת מ"מ ב25 מיליליטר של E3 על 28.5 ° C.
  4. כאשר זחלים 5 DPF, להכין צלחת ניתוח על ידי כיסוי Sylgard עם E2 +10 מ"ג / ליטר gentamycin סולפט (GS) + Tricaine.
    1. הכן את התאוששות מנה על ידי הוספת 25 מיליליטר E2 + GS ל100 מ"מ דיס פטרישעות.
    2. הכן את האזמל על ידי מקליט יחד שלוש מטליות. זה יהווה כלי משולש עם שלושה חריצים.
    3. הר micropipette הוכן על מטליות ידי מקליט אותו לאחד מהחריצים.
  5. אם שימוש חוזר micropipettes, סומק עד ברור עם E2 + GS באמצעות מזרק 1ml ומחט G 27 לפני ההרכבה במטליות.

4. ניתוח

  1. הרדימי צלחת 1 של זחלים בכל פעם (25 דגים) עם Tricaine. דגים במידה מספקת בהרדמה כאשר הם כבר לא מציגים מגע תגובה. חשוב שהדגים מורדמים לחלוטין לפני הניתוח, אחרת הם עווית כאשר האזמל נוגע בם. ניתוח מתבצע תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
  2. העבר את הזחלים לצלחת ניתוח.
    1. תחת הגדלה המרבית, לסובב זחל אחד בכל פעם, כך שהוא שוכב על הצד שלה עימה חזרה הקרוב ביותר למחזיקה אזמל היד.
    2. עמדת מלקחיים כך שהן מונחות על Sylgard,זווית מעל הרוחב של הזחל.
    3. מרענן אזמל הזכוכית נגד אחת מהזרועות של המלקחיים, חתוך לרוחב הפנים הגב של הזחל ברמה של נקבובית האנאלי, להיות בטוח שלא לחתוך מעבר לקצה הגחון של notochord. לסובב את סכין המנתחים לנתק את חוט השדרה.
    4. חזור על פעולה עם זחלים הנותרים.
      הערה: אם זחל מדמם, הוא לא יתאושש מהניתוח. מייד להסיר את הזחל מצלחת הניתוח ולהרדים אותו באמצעות מנת יתר Tricaine.
  3. ברגע שהניתוח באצווה של זחלים הוא מוחלט, העברה נפצעה חיות לצלחת ההתאוששות. זאת על מנת לתמוך בסליקה של הרדמה.
    1. זהירות: בעת איסוף זחלים נפצעו להעברה, לוודא שהם ראשון נאספים ראש או זנב: אינו מדגיש את הפגיעה באתר על ידי כיפוף הזחלים.
      הערה: כל ההתקנים המשמשים לניתוח ניתן לעשות שימוש חוזר, כוללים micropipettes.

5. שחזור

  1. Transfer נפצע זחלים מצלחת ההחלמה ל100 צלחות מ"מ מלאות 25 מיליליטר E2 + GS בצפיפות של 25/plate. לאפשר להתאושש בC חממה 28.5 °.
  2. בדוק צלחות יומיות, הסרת בעלי חיים חולים ומתים. לא לשנות את התקשורת עד Coleps (פרוטוזואה המים המתוקים) נראה בתקשורת. כאשר משנה את התקשורת, לא להעביר את הדגים לצלחת חדשה; במקום זאת, להסיר כמה שיותר אמצעי תקשורת אפשרי ולהציף את אותה צלחת עם מדיה חדשה. חזור על פעולה במידת צורך כדי להקטין את אוכלוסיית Coleps.
  3. להאכיל מדי יום עם כמות קטנה של מזון מטגנים אבקה.
    הערה: מזון חי (למשל, בסנדליות או rotifers) לא יכולה להיות מוזנת לזחלים פגועים עד אחרי שהם התאוששו תנועה. אחרת, המזון החי יהיה ליישב את הפגיעה באתר ולהרוג את הזחלים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להפחית את חומרת נזק לרקמות המקיפות את אתר פציעה, beveling התקין של micropipette הוא קריטי. איור 1 א מציג קצה משופע בצורה נכונה. שימוש בטיפ זה הוא רחב מדי (איור 1 ב) נוטה לגרום להרוגים גבוהים יותר בשל הסבירות המוגברת של אב העורקים שסחבו על הגב, ואילו קצה שהוא צר מדי (איור 1 ג) נוטה לחלוף מעל העור ולא חיתוך רקמות.

כדי לתרגל את הטכניקה הזו, זה יתרון להשתמש בקו כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאשר בתחילה ללמוד את הטכניקה הזו, אנו ממליצים שתנסו לא יותר מ 50-100 transections בפגישה אחת. כאשר תשלטו בטכניקה זו, אנו מסוגלים transect עד 300 עובר לכל שעה; עם זאת, רמה זו של תפוקה דורשת כמה חודשים של תרגול שבועי. בנוסף, אנו ממליצים לתרגל עם קו כתב ואימות חיתוך רוחב מלא עד לשכיחות של חיתוך רוחב חוט השדרה שלם מצטמצמת פחות מ -1%.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה המבוגר הוא טכניקה מבוססת וחזקה ללימוד לצמיחה מחודשת ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו חייבים תודה למתקן דג הזברה אוניברסיטת יוטה לגידול בעלי חיים. RID נתמכה על ידי NIH R56NS053897, וLKB היה חניך predoctoral נתמך על ידי היוזמה HHMI Med-Into-הגראד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת פטרי 60 מ"מVWR82050-544
צלחת פטרי 100 מ"מVWR89038-968
PDMS, ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184פישר סיינטיפיקNC9644388
: OD 1.00 מ"מ, מזהה 0.78 מ"מוורנר אינסטרומנטס בע"מ.64-0778
מלקחייםפיין סיינטיפיק כלים בע"מ11252-30
מיקרוסקופ דיסקציהניקוןSMZ6454
מיקרוגריינדרNarishigeEG-44
Gentamycin SulfateAmresco Inc.0304-5Gממיסים במים 10 מ"ג/מ"ל, מאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C
TricaineAcros Organics118000100
מוליך כותנה, עץ, 6 אינץ'פישר סיינטיפיק23-400-101
מזרק BD 1 מ"לBD309625
27 גרם מחטBD305109
Fry מזוןArgent Labsחנות F-ARGE-PTL-CNב-20 מעלות; C
חולץ מיקרופיפטהSutter Instrument Co.דגם P-97נימה תיבה FB330B
<חזק>20x E2 (1 ליטר); יש לאחסן ב-RT
17.5 גרם NaClFisher ScientificS671-500
0.75 גרם KClFisher ScientificP217-500
2.90 גרם CaCl2· 2 שעות<תת>2OסיגמאC7902-500G
4.90 גרם MgSO4· 7H2OMerckMX0070-1
0.41 גרם KH2PO4Fisher ScientificP285-500
0.12 גרם Na2HPO4SigmaS0876-500G
500x NaCO3 (10 מ"ל); להכין טרי, להשליך
0.35 גרם נוסף NaCO3SigmaS5761
<חזק>1x E2 (1 ליטר); יש לאחסן ב-RT
50 מ"ל 20x E2
2 מ"ל טרי 500x NaCO3
צינורות נימי בורוסיליקט

מקורות

  1. Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
  2. Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
  3. Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
  4. Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
  5. Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
  6. Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
  7. Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
  8. Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
  9. Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
  10. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  11. McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
  12. Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים