מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם קיבולת גבוהה לphagocytose או לבלוע את חומר בסביבה תאית שלהם. הנה, assay החלים רחב, אמין, וכמותי מאוד להדמיה ומדידת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של רכיבים סינפטיים מתואר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים
במאמר זה
סיכום
תקציר
Phagocytosis הוא תהליך שבו תא בולע חומר (כל תא, חלקי תא, פסולת, וכו ') בסביבה תאית המקיפה אותה ולאחר מכן מעכל את החומר הזה, בדרך כלל באמצעות השפלה lysosomal. מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שphagocytic פונקציה שתואר במגוון רחב של תנאים ממחלה ניוונית של מערכת עצבים (, אישור לדוגמא בטא עמילואיד במחלת אלצהיימר) להתפתחות של המוח בריא (למשל, הסינפטי גיזום) 1-6. הפרוטוקול הבא הוא assay היבלעות פותח כדי לחזות ולכמת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של תשומות presynaptic במערכת retinogeniculate עכבר פיתוח 7. בעוד assay זה שימש להערכת תפקוד מיקרוגליה בהקשר המסוים הזה, בגישה דומה ניתן להשתמש כדי להעריך phagocytes אחר בכל רחבי המוח (למשל, האסטרוציטים) ושאר הגוף(למשל, מקרופאגים היקפיים), כמו גם בהקשרים אחרים שבהם שיפוץ הסינפטי מתרחש (למשל, פגיעה במוח / מחלה).
מבוא
מעגלי Synaptic לשפץ לאורך החיים של בעלי חיים. במוח המתפתח, הסינפסות יוצרות עודפות וחייבות לעבור גיזום הסינפטי הכולל את ההסרה סלקטיבית של קבוצת משנה של סינפסות ותחזוקה וחיזוק של סינפסות אלה שנותר 8-10. תהליך זה הוא הכרחי כדי להשיג אופייני קישוריות המדויקת של מערכת העצבים הבוגרת. במבוגרים, סינפסות יכולות להיות גם פלסטיק, במיוחד בהקשר של למידה וזיכרון. הקושרת המבנית של פלסטיות זה חשב לכלול את התוספת ו / או חיסול של קוצים הדנדריטים וboutons presynaptic 11-13. בנוסף לתפקידים אלה במערכת העצבים בריאה, שיפוץ הסינפטית מעורב גם ב12,14,15 מחלה של מערכה / פציעת עצבים. כך למשל, בעקבות פגיעה בחוט השדרה,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. אנטרוגרדית תיוג של תשומות Presynaptic RGC
הערה: כל הניסויים של השימוש בבעלי חיים נבדקו ופיקוח של ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית (IACUC) בהתאם לכל הנחיות NIH.
- לעקר שדה ומכשירים.
- הרדימי עכבר עם isoflurane 4% כרך בחדר אינדוקציה פרספקס (isoflurane% כרך זה עובד על עכברי יילודים למבוגרים). שים לב לעכברים הדוק כדי למנוע יתר ההרדמה. זהירות: הימנע משאיפה עם פינוי גז פסולת ואקום.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחרונה, השתמשנו assay היבלעות זו כדי לחזות ולכמת היבלעות בתיווך המיקרוגלים של תשומות presynaptic במערכת retinogeniculate הפיתוח (איור 1) 7. RGCs מעכברים הטרוזיגוטיים CX3CR1-EGFP אותרו anterogradely עם CTB-594 וCTB-647 בעיני ימין ועל השמאל, בהתאמה. בעקבות מעקב זה, מיקרוגליה EGFP החיוביים בתוך dLGN היו הדמיה. תמונות אלו בהמשך פני השטח שניתנו למדידות נפח.
באמצעות טכניקה זו, מצאנו כי במהל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
על מנת למדוד במדויק phagocytosis, חייבים להיות מסומנים בחומרים נבלעו בצורה כזאת, כי החוקר יכול לדמיין את זה פעם אחת השפלה lysosomal התרחשה. בנוסף, נדרש הדמיה ברזולוציה גבוהה, ואחריו את השימוש בתוכנה שיאפשר לחוקר לדמיין את עוצמת הקול של כל התא ולכמת את התוכן שלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה אמינה וכמותי מאוד למדידת היבלעות בתיווך תא בלען באמצעות CTB מצומדת לצבעי Alexa לתווית חומר נבלע בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה ושחזור 3D. מתודולוגיה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
עבודה נתמכה על ידי מענקים מקרן סמית המשפחה (BS), קרן דנה (BS), תכנית ג'ון מרק מלומדים (BS), NINDS (RO1-NS-07,100,801; BS), NRSA (F32-NS-066,698; DPS), קרן ננסי וריא מרקס (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC ההדמיה Core).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כרית חום | Vet Equip, Inc. | 965500 | |
| מקור מים חמים לכרית חום | קנט סיינטיפיק | TP-700 | |
| מיקרוסקופ סטריאו | DSC אופטי | Zeiss Opmi -6 מיקרוסקופ | |
| מיקרוטום הזזה עם שלב הקפאה | Leica | SM2010 R | |
| להב מיקרוטום | Leica | 14021607100 | |
| מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי | ניקון | SMZ800 עם מצורף | |
| דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי | פרקין אלמר | UltraView Vox דיסק מסתובב קונפוקלי | |
| 10 ומיקרו; l מזרקים אטומים לגז המילטון | המילטון | 80030 | השתמש במזרק שונה לכל צבע צבע/עוקב |
| מחטי המילטון | המילטון | 7803-05, מפרטים: קהה, רעלן כולרה מצומד אלקסה 1.5 אינץ' | |
| ובטא; תת-יחידה (CTB) | Invitrogen | 488: C22841 | להרכיב מחדש במי מלח סטריליים, 80 ומיקרו; l (488), 100 ומיקרו; l (594), 20 ומיקרו; l (647) |
| 594: C22842 | |||
| 647: C34778 | |||
| פוספט חוצץ מלח ( PBS) | סיגמא | P4417-50TAB | |
| ניאומיצין ופולימיקסין B סולפטים ובציטראצין אבץ משחת עיניים USP (משחה אנטיביוטית) | באוש & Lomb | 24208-780-55 | |
| 30.5 גרם מחט | Becton Dickinson | ||
| Roboz | RS-5630 | ||
| מוליך עם קצה כותנה | פישר | 23-400-125 | |
| Paraformaldeyde (PFA) | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15710 | לדלל 16% עד 4% ב- PBS. Paraformaldehye רעיל, יש להשתמש במכסה אדים וללבוש ציוד מגן אישי. |
| כלי חיתוך – מספריים, מלקחיים, מרית | מספריים קטנים: כלי מדע עדינים | מספריים קטנים: 14370-22 | |
| מספריים גדולים: Roboz | מספריים גדולים: RS-6820 | ||
| # 55 מלקחיים: כלי מדע עדינים | # 55 מלקחיים: 11255-20 | ||
| מרית: טד פלה, בע"מ | מרית: 13504 | ||
| סוכרוז | סיגמא | S8501-5 ק"ג | הכינו 30% סוכרוז ב-PBS (משקל/נפח) |
| OCT תרכובת | VWR | 25608-930 | |
| סירת שקילה | ארה"ב מדעית | 2347-1426 | |
| צלחות 24 בארות | BD Biosciences | 353047 | |
| נתרן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא | S6566-500G | הפוך 0.2 M נתרן פוספט מונו-בסיסי (PB-A) ב-ddH2O ו-0.2 M נתרן פוספט דו-בסיסי (PB-B) ב-ddH2O. להכנת 0.1 M PB, שלבו 19 מ"ל PB-A ו-81 מ"ל PB-B, מלאו ל-200 מ"ל עם ddH2O |
| נתרן פוספט דו-בסיסי | Sigma | S5136-500G | |
| כיסויים, 22 X 50 מ"מ, מס' 1.5 | VWR | 48393 194 | |
| שקופית מיקרוסקופ טעונה | VWR | 48311-703 | |
| Vectasheild | Vector Laboratories | H-1200 |
מקורות
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
- Tremblay, M. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
