הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

14.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51542

⸱

20 באוגוסט 2014

 ,  ,  , 
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

במאמר זה

סיכום

פינצטה אופטית שימשה לחקר קיפול RNA על ידי מתיחת מולקולות בודדות מקצות 5' ו-3' שלהן. כאן מתוארים נהלים נפוצים לסינתזה של מולקולות RNA לפינצטה, כיול המכשיר ושיטות למניפולציה של מולקולות בודדות.

תקציר

חלק גדול מהגנום האנושי הוא עיבד אבל לא תורגם. בעידן הגנומי הודעה זו, פונקציות רגולטוריות של RNA הוכחו להיות חשוב יותר ויותר. כפונקציה RNA תלויה לעתים קרובות ביכולתה לאמץ מבנים חלופיים, שקשה לחזות מבנים תלת ממדיים RNA ישירות מרצף. מולקולה בודדת גישות פוטנציאלי מופע כדי לפתור את הבעיה של פולימורפיזם מבני RNA על ידי ניטור מבנים מולקולריים מולקולה אחת בכל פעם. עבודה זו מציגה שיטה כדי לתפעל את הקיפול ומבנה של מולקולות RNA בודדות באמצעות פינצטה אופטית בדיוק. ראשית, שיטות לסנתז מולקולות מתאימות לעבודה מכאנית מולקולה בודדת מתוארות. הנהלים הבא, שונים כיול כדי להבטיח את פעילותו התקינה של פינצטה האופטית הם דנו. בשלב הבא, ניסויים שונים מוסברים. כדי להדגים את התועלת של הטכניקה, קיסין תוצאות של סיכות ראש RNA מכאני התגלגלות וRNA בודדמורכב גרם משמשים כראיה. בדוגמאות אלה, טכניקת nanomanipulation שימשה ללמוד קיפול של כל תחום מבני, ובכלל זה משני ושלישוני, באופן עצמאי. לבסוף, המגבלות ויישומים עתידיים של השיטה הם דנו.

מבוא

הפיתוח של טכניקת פינצטה האופטית כבר מלווה ארוך עם היישום שלה במחקר ביולוגי. כאשר השפעת ההשמנה האופטית התגלתה לראשונה, ארתור Ashkin ציין כי חיידקים במים מזוהמים יכולים להיות לכוד במוקד הלייזר 1. מאז, חיידקי השמנה הפכו ניסוי לא מכוון, כיף לדורות של תלמידי ביופיסיקה, כמו גם כלי מחקר רציניים ללמוד פיזיולוגיה של חיידקים 2,3. טכניקת הלכידה האופטית משתמשת בקרן לייזר ממוקדת כדי לשתק אובייקט מיקרוסקופי 1. למעשה, פונקציות מלכודת לייזר כמעיין אופטי, אשר מודד גם כוח (F) על האובייקט שנלכד על ידי עקירתה ממרכז המלכודת (ΔX). בטווח קצר, F = κ x ΔX, בκ הוא קבוע הקפיץ של המלכודת. המלכודת האופטית יכולה לשמש כדי להפעיל כוח בpicoNewton דיוק (PN) למייקרואובייקט copic ולמדוד את עמדתה עם ננומטר דיוק (ננומטר). בשני העשורים האחרונים, פינצטה אופטית הפכה לאחד טכניקות מולקולה בודדת הנפוצות ביותר בביופיזיקה. הטכניקה כבר מועסק ללמוד מתקפל ומכניקה של DNA 4-6, 7-9 RNA, וחלבוני 10,11. פינצטה אופטית יש גם שימשה להתבונן שכפול הדנ"א 12, שעתוק RNA 13, וסינתזה של חלבון 14,15, כמו גם אירועים אחרים רבים biomolecular 16-18.

גישות מולקולה בודדת מועסקות במחקר מבני RNA בעיקר כדי לחקור את נוף אנרגיית קיפול המחוספס של רנ"א. רצף הרנ"א בדרך כלל יכול לקפל לתוך מבנים יציבים, שוללות מרובים, בשל כללי הרכב כימי וקילוף בסיס הפשוט של רנ"א. זה כבר זמן רב ידוע כי פולימורפיזם מבני RNA, כגון שמתרחש בriboswitches 19,20, ממלא תפקיד חשוב בויסות הגנים. Recenסקר הגנום t גילה כי שינויים בטמפרטורה קטנה כמו כמה מעלות להשפיע סינתזת מבנה וחלבון של חלק גדול מtranscriptome הסלולרי 21 מאוד. דוגמא זו מרמזת כי התפקיד הביולוגי של קיפול RNA החלופי הוא אולי יותר חשוב ונרחב יותר מאשר הניח בעבר. פולימורפיזם מבני, לעומת זאת, מהווה אתגר לגישות ביוכימיות וbiophysical המסורתיים, הבודקות תכונות ממוצעת של מולקולות רבות. לדוגמא, "על" ותצורות "את" של riboswitch אינן יכולות להתקיים. מבנה ממוצע נגזר ממבנים הטרוגנית אינו צפוי להיות דומה גם של conformers הרלוונטי מבחינה ביולוגית. יתר על כן, RNA מתורגם וmRNA בדרך כלל ליצור מבנים. האינטראקציה שלהם עם חלבונים וRNAs הרגולציה נפוצה דורשת התגלגלות של מבנה הקיים, כחלק מהאינטראקציה. לכן, לומד RNA התגלגלות / refolding הופך רלוונטינושא של הביולוגיה RNA. כדי לעמוד באתגר כזה, גישת המולקולה בודדת כבר מועסק לפענח פולימורפיזם מבני RNA על ידי לימוד מולקולה אחת בכל פעם 22-27.

בהשוואה לשיטת הקרינה המולקולה בודדת הפופולרית, פינצטה מבוססת מכאני התגלגלות מציעה יתרון כי תצורות של מולקולות בודדות ניתן להשפיע על ידי כוח ליישם ולמדוד בדייקנות ננומטר. יכולת nanomanipulation זה יכול להיות מנוצל כדי לפקח על התגלגלות / הקיפול של תחומים מבניים אדם כזה שמתקפל ההיררכי של RNA גדול יכול להיות גזור 28. לחלופין, גדיל בודד יכול להיות מופנה אל לקפל לתוך אחד מכמה conformers; או מבנה הקיים יכול להיגרם באופן מכאני ללקפל לתוך קונפורמציה שונה 29. בתנאים ביולוגיים, מבנה RNA ניתן לשנות על שינוי הטמפרטורה או ליגנד מחייב. היכולת של ים מולקולרי ישירות מניפולציהtructure פותח מקום חדש של מחקר המבני RNA. באופן עקרוני, טכניקות מכאניות אחרות, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי ופינצטה המגנטית, יכולות לשמש גם כדי ללמוד קיפול של מולקולות RNA בודדות. עם זאת, יישומים אמורים מוגבלים בעיקר בשל הרזולוציה מרחבית הנמוכה יחסית 30.

העסקתו של פינצטה אופטית מאפשרת מבני RNA שפרשו בכוח מכאני.

היתרון של מכאני התגלגלות הוא פי כמה וכמה. כוח יכול לשמש כדי להתפתח מבנים הן משניים ושיישונים, ואילו יונים של מתכות ומתקפלים ליגנד המושרה הם בעיקר מוגבלים למבנים שלישוני. טמפרטורה וdenaturant יכולים להשפיע באופן משמעותי את פעילותם של מים ומומסים. בניגוד לכך, כוח מיושם באופן מקומי כדי להפריע מבנים מולקולריים; ההשפעה של כוח על הסביבה היא זניחה. בנוסף, היתוך תרמי משמש הטוב ביותר ללמוד תרמודינמיקה קיפול של מבני RNA קטנים,ואילו פינצטה אופטית הייתה בשימוש ללמוד מבני RNA בגדלים שונים, הנע בין סיכת ראש tetraloop שבעה בסיס זוג 28 לribozyme 400 נוקלאוטיד 31 ב. יתר על כן, מבני RNA ניתן פרשו באופן מכאני בטמפרטורות מזופיליות. בניגוד לכך, להתפתח RNAs בניסוי היתוך תרמי, הטמפרטורה עולה בדרך כלל הרבה מעל טמפרטורות פיסיולוגיות, אשר מגדילה באופן משמעותי הידרוליזה RNA, במיוחד בנוכחות של יוני Mg 2 +.

חשוב לציין כי ההשפעה המכנית של כוח תלויה איך הוא מוחל למבנה. הכח ליישם מטה נוף האנרגיה מתקפל. לדוגמא, כאשר הכוח מוחל על סיכת ראש, זוגות בסיסיהם ברצף שבורים, אחד בכל פעם (איור 1 א). המזלג קורע מתקדם לאורך ציר הסליל, שהוא ניצב לכח ליישם. בניגוד לכך, כאשר מורכב נשיקות מינימליות הוא תחת מתח, שתי נשיקותזוגות בסיסים, אשר מקבילים לכח המונע, חולקים את כוח העומס (איור 1b). הגיאומטריות השונות של סיכת הראש ויחסית מורכבים לנשק לתוצאת הכוח ליישם בתגובה המכנית השונות שלהם, שיכול להיות מנוצל כדי להבחין קיפול שניוני ושלישונית 28,32. ההיבט התיאורטי של מכאני התגלגלות נבדק בעבר 8,9,30. עבודה זו מתארת ​​את הגישות הבסיסיות להקמה ולבצע assay התגלגלות מכאני מולקולה בודדת.

התקנה ניסיונית. 7 בניסוי מושך המכני שלנו, מדגם RNA לtweezing מורכב מרנ"א של עניין וצדיו שתי ידיות פעמיים תקועים DNA / RNA (איור 2). כל המולקולה יכולה להיות קשורה לשני חרוזים מצופים משטח בגודל מיקרון (Spherotech) באמצעות streptavidin ביוטין ואינטראקציות נוגדן digoxigenin-אנטי digoxigenin, בהתאמה. חרוז אחד מוחזק על ידי TR האופטי למדידת כוחap, ואילו האחרים מוחזק על קצה micropipette. המרחק היחסי בין חרוזים ניתן לשנות על ידי מי מנווט את המלכודת או העברת micropipette. שימוש בגישה זו, מולקולת RNA חד קשירת חרוזים יכולה להיות מתוחה ורגועה.

הכנת דוגמאות. הסינתזה של דגימות RNA לtweezing כוללת כמה צעדים (איור 3). ראשית, רצף DNA המתאים לRNA של עניין הוא משובט ראשון בוקטור פלסמיד. בשלב בא, שלוש תגובות PCR מבוצעות כדי ליצור שתי ידיות ותבנית לשעתוק. תבנית השעתוק מקיפה את אזורי הידית ורצפים שהוכנסו. RNA באורך המלא הוא מסונתז על ידי שעתוק במבחנה. אחרון, RNA וידיות שינוי כימי הם מרותקים יחד כדי ליצור מולקולות למריטות חוזרות ונשנה.

כיול והפעלה של מלקחיים. העיצוב הבסיסי של שימוש Minitweezersד בעבודה זו נובע כי בפינצטה האופטית כפול קורה 33. עם שיפורים רבים, Minitweezers להציג יציבות יוצאת דופן בהשוואה לפינצטה האופטית הדור הראשון. מספר קבוצות מחקר בכמה מדינות להשתמש Minitweezers במחקר המולקולה בודדת שלהם 14,15,34-37. הפרטים של בנייה, כיול, והפעלה של המכשיר, כוללים קטעי וידאו הדרכה, זמינים באתר האינטרנט של "המעבדה מלקטת" (http://tweezerslab.unipr.it). הנה, שיפורים ונהלי כיול שצריך להתבצע על בסיס יומי מתוארים בפירוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

.1 הכנת RNA המולקולות לtweezing מולקולה בודדת

  1. שיבוט הרצף של עניין. לשכפל את רצף DNA התואם את מבנה RNA לוקטור.
  2. סינתזה וטיהור של תבנית השעתוק. לסנתז תבנית שעתוק על ידי PCR. [שולחן מקום 1 כאן] הבא, לטהר מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR, ולרכז את המדגם ל> 200 ng / μl. בגלל DNA המטוהר משמש לשעתוק, יש להשתמש במים RNase ללא בצעדים elution וריכוז.
  3. בשעתוק במבחנה. לסנתז RNA על ידי שעתוק במבחנה ב 37 מעלות צלזיוס למשך לילה על מנת למקסם את תשואת RNA. [שולחן מקום 2 כאן] לאחר שעתוק, להוסיף DNase μl 1 אני לעכל את תבנית DNA ל15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לטהר RNA באמצעות טור ספין סיליקה.
  4. סינתזה של א 'ידית biotinylated ראשונה, לייצר את הידית ללא שינוי על ידי PCR באמצעות פריימרים אפ וא וקונצרט כלשהוentrate DNA המוגבר ל> 200 ng / μl. בשלב הבא, לשלב שינויים ביוטין למוצר באמצעות PCR תגובת סיומת פריימר. הערה [מקום 3 בטבלה כאן]: ידית biotinylated (ביוטין-HA) ניתן להשתמש ישירות בחישול ללא טיהור. כביוטין-HA הוא להיות מרותק עם RNA, זה קריטי להשתמש במי RNase ללא בשני השלבים.
  5. סינתזה של הידית הותאם digoxigenin B. לסנתז digoxigenin הותאם ידית B (DIG-HB) על ידי PCR באמצעות פריימר Bf ואוליגו הותאם digoxigenin Dig-Br (איור 3). בשלב הבא, לטהר את מוצר PCR ולהתרכז המדגם ל> 200 ng / μl.
  6. RNA חישול לידיות. לחשל RNA עם ידיות. [שולחנות מקום 4 ו -5 כאן]
  7. לטהר מדגם annealed. הוסף 3 כרכים של אתנול מהמדגם המרותק ומערבבים היטב. אחסן את התערובת ב -70 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. ספין למטה ב15,800 XG ולהשליך supernatant. ייבש את גלולה באמצעות lyophilizer. ממיסים את גלולה ב100 מים חופשיים μl RNase. הערה: המדגם הוא מוכן לשימוש וניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

.2 כיול והפעלה של מלקחיים אופטיים

  1. לכייל גודל פיקסל של וידאו צג
    1. השתמש במלכודת האופטית למלכודת חרוז בקוטר ידוע (סטנדרטי בגודל).
    2. צלם תמונות של חרוז לכוד באמצעות תוכנת הדמיה (איור 4).
    3. לקבוע את הקוטר של חרוז באמצעות תוכנת ההדמיה המבוססת על שיטת centroid.
    4. חזור על הליך זה כדי לקבוע קטרים ​​של חרוזים בגדלים שונים.
    5. התאם את הקטרים ​​נמדדו וידועים של החרוזים על ידי רגרסיה ליניארית כדי לקבל את הגודל הפיזי של פיקסל.
  2. ודא מרחק כיול
    1. השתמש במלכודת האופטית למלכודת חרוז.
    2. לקבוע את מיקום פיקסל של centroid שלה על ידי התוכנה ללכידה תמונה ולהקליט את עמדתה באמצעות Minitweezers.
    3. לנווט את חרוז לdiffe לשכור עמדות ולחזור על קביעת העמדה.
    4. להמיר את עמדות X ו Y של חרוז מפיקסלים ליחידה מ 'שימוש בגודל פיקסל המכויל.
    5. השווה את X ו Y בין העמדות שנמדדו על ידי וידאו ועל ידי Minitweezers. שני סטים של ערכים צריכים להסכים. כרזולוציית התמונה היא> 0.1 מיקרומטר, להעביר את חרוז על 1 מיקרומטר בין מדידות כדי להבטיח דיוק. אם כיול המרחק הוא לא בר השוואה לזה שמאוחסן בMinitweezers, לכייל מחדש את המכשיר.
  3. מלכודת נוקשות כיול
    1. ללכוד חרוז באמצעות המלכודת האופטית ולהחזיק אותו עדיין.
    2. רשום את הכוח של המלכודת באמצעות רכישת נתונים מהירים עוקפת בקצב> 5 kHz במשך 3 שניות.
    3. צור כוח ספקטרום מההקלטה של ​​תנועת חרוז באמצעות תוכנה. התאם את ספקטרום הכח של לורנץ (איור 5) 38:
      542 51542eq1.jpg "width =" / 200 "/> (EQ. 1)
      שבו S (f) הוא הכח בתדירות של f, f c הוא שכיחות הפינה, וS 0 הוא כוח אסימפטוטי. תדירות הפינה, f ג, היא התדר שבו כוחה של תנועה תרמית ירד למחצית מערך אסימפטוטי. כf c משתנה עם כוח הלייזר וגודל חרוז, לכייל כל חרוז לכוד בנפרד.
    4. לחשב את קבוע הקפיץ של המלכודת, κ, מf c:
      figure-protocol-1 (משוואה. 2)
      בי γ הוא מקדם גרר של חרוז (EQ. 3). השתמש בקבוע הקפיץ כדי לקבוע שינויי הארכת RNA משינוי בכח.
  4. מבחן החוק 'סטוקס
    1. ללכוד חרוז באמצעות המלכודת האופטית. הזז את חרוז גב ו-כוח במהירות שונה.
    2. רשום את התנועה של חרוז ולכפות באמצעות Minitweezers.
    3. לחשב את הרדיוס של חרוז.
      הערה: כוח החיכוך, ד F, שנוצרה על ידי תנועתו של חלקיק כדורי בתוך נוזל יכולה להיות מתוארת על ידי החוק "סטוקס:
      figure-protocol-2 (משוואה. 3)
      שבו r הוא הרדיוס של הכדור, v הוא המהירות, ושעות היא הצמיגות הדינמית של הנוזל, אשר ניתן למצוא בטבלאות התייחסות. שימוש בכוח נמדד כד F, הרדיוס של חרוז יכול להיות מחושב באמצעות משוואה. 3 (איור 6) וצריך להסכים עם זה שנקבע על ידי תוכנת רכישת תמונה. מבחן החוק 'סטוקס ביעילות בדיקות כיולים וביצועים של המכשיר בכללותה.

.3 Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות

  1. מה שהופך את fluidics.
    1. לקדוח שישה חורים (קוטר 2 מ"מ כל אחד) על מכסה זכוכית מס '2 (7 א' איור) ולחתוך שלושה חריצים (רוחב 2 מ"מ) לקלטת polyimide דו צדדית (איור 7 ב) באמצעות חרט לייזר.
    2. הפוך תא זרימה על ידי הרבדה שתי מכסה זכוכית עם שתי שכבות של סרט חד צדדי כפול Kapton. הכנס micropipette ושני צינורות עוקפים בין הקלטת (7 ג איור).
    3. הר תא הזרימה על מסגרת מתכת על ידי (ד 7 איור) חורי fluidic התאמה.
    4. חבר את ערוצי fluidic של החדר ל10 מ"ל מזרקים מלאים בחיץ של בחירה באמצעות tubings פוליאתילן (7e איור).
    5. הר כולו קאמרי על פינצטה האופטית בין שני היעדים. ודא שהצד הקדמי של החדר עם ערוצי fluidic פונה ימינה. לחזור בו מהמטרה הנכונה ולחבר את סיכות פליז של המסגרת (7e איור) לחורים הרכבה על tהוא פינצטה. חזק את הברגים כדי לתקן את מיקום התא.
  2. ערבוב המדגם וחרוזים המרותקים. מערבבים את מדגם annealed עם חרוזים מצופים אנטי digoxigenin (DIG-חרוזים), ולתת לתערובת להישאר בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דק '. בדרך כלל, μl 1 מתוך מדגם מרותק מעורבב עם חפירות-חרוזים 5 μl ב 1 מ"ל של חיץ. הערה: כמות חרוזים להיות טעונה לתוך תא הזרימה צריכה להיבחר על מנת להבטיח כמות סבירה של חרוזים כדי להיות מועברת מצינור המעקף. היחס של המדגם המרותק לחרוזים לא ניתן לכמת בקלות. במקרה אידיאלי, יש לי ביותר חרוזים לא RNA כך שרק חלק קטן של חרוזים עשוי להיות רק מולקולה אחת RNA לחרוז. כדוגמות המרותקות והשעית חרוז שקשה לכמת, את הטוב ביותר ורק דרך כיום הוא לגוון את יחס הערבוב ולבדוק את התערובת על פינצטה.
  3. לספק חרוזים לאתר התגובה בתא הזרימה (כלומר, מיקרומטרים אחדים על גבי מילטיפ cropipette, 7 ג איור).
    1. לטעון השעיה של חרוזים streptavidin מצופה (סטרפטוקוקוס-חרוזים) לתוך מזרק 1 מ"ל.
    2. חבר את המזרק לצינור fluidic המוביל לערוץ התחתון של תא הזרימה (איור א 7).
    3. לדחוף את המזרק לזרום סטרפטוקוקוס-חרוזים לתוך התא.
    4. להעביר את כל החדר באמצעות תוכנת שליטה מוטורית למקום המלכודת האופטית ליד הפתח של החלק התחתון העוקף הצינור (7b איור). ואז להפעיל את המלכודת האופטית על ידי העקיבה כדי ללכוד סטרפטוקוקוס-חרוז.
    5. הזז את חרוז הקרוב לקצה micropipette באמצעות תוכנת השליטה המוטורית.
    6. משוך את המזרק מחובר לmicropipette למצוץ חרוז על micropipette.
    7. החל זרימה בעדינות על ידי לחיצה על המזרק לערוץ האמצע כדי לשטוף את זיהום חיידקי חרוזים נוספים.
    8. באופן דומה, לספק התערובת של מדגם וחפירות-חרוזים (ראה שלב 3.2) לערוצו העליון של התא.
    9. ללכוד חפירת חרוז ולהביא אותו קרוב לסטרפטוקוקוס-חרוז באמצעות המלכודת האופטית.
    10. נקה את ערוץ האמצע על ידי יישום זרימה. הערה: strep- ולחפור-חרוזים בוחרים להיות בגדלים שונים, כך שהם יכולים להיות מצוינים מבחינה ויזואלית תחת המבט המיקרוסקופי (איור 4).
  4. דייג "מולקולה בודדת קשירה בין זוג של חרוזים.
    1. הנח את חפירת החרוז אנכי על גבי סטרפטוקוקוס-חרוז (איור 4).
    2. הזז את חפירת החרוז מטה לכיוון סטרפטוקוקוס-חרוז ידי מנווט את המלכודת. פתח חלון עלילת כוח למרחקים במחשב כדי לחזות שינויים בכוח.
    3. במגע של שני חרוזים, להעביר את חפירות החרוז אנכי מן סטרפטוקוקוס-חרוז.
    4. אם אין קשר מסוים הוא עשה, הכוח נותר כמעט אפס. אם שני חרוזים מחוברים על ידי מולקולות, עליות הכוח באופן משמעותי, כאשר שני חרוזים להפריד. הליך זה, המכונה גם "דיג", הוא לעתים קרובות Perfמספר פעמים ormed על כל זוג חרוזים למצוא לקשור מולקולה בודדת יעילה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מוגבלת על ידי מרחב, nanomanipulation של מולקולות RNA יחידה באה לידי ביטוי בהצגת דוגמאות רק מכאניות התגלגלות של סיכות ראש RNA וRNA עם מבנה שלישוני.

מניפולציות מולקולות בודדת מכבנה

ברגע שרצועה שנוצרה בין חרוזים, הארכת וכוח ברצועה ניתן להשפיע באמצעות פרוטוקול מוגדר על ידי משתמש. ארבעה פרוטוקולי מניפולציה נפוצים נמצאים בשימוש נפוץ. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שינוי ופתרון בעיות בהכנת דוגמאות tweezing

בחירה של שיבוט וקטור. על אף שהתכנית הכללית שתוארה כאן (איור 3) אינה דורש וקטור שיבוט מיוחד, הווקטור הוא העדיף שלא צריך T7 הפנימי או אמרגן T3 עבור קלות השעתוק כזה שאמרגן יכול להיות הציג באמצעות PCR בעמדות רצויים.

רצף ואורכים של הידיות. אין דרישת רצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש לי המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF (MCB-1054449) ופרס תוכנית מחקר פיילוט בין-תחומית משותפת ממכון RNA באוניברסיטת אולבני ל-PTXL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיניטוויזרססטיבן ב. סמית הנדסהhttp://tweezerslab.unipr.it
כרטיס רכישת נתוניםNational InstrumentsUSB-6351
כרטיס מסךNational InstrumentsPCI-1407
Labview תוכנת תכנותNational Instruments
NI Vision BuilderNational Instruments
לייזר חרטאפילוג מערכות לייזרZing-16
PCR ערכת טיהורQiagen28104
MEGAscript T7 kitLife TechnologiesAM1334
MEGAclear kitLife TechnologiesAM1908
ביוטין-11-UTPתרמו פישר
T4 DNA פולימראזמעבדות ניו אינגלנדM0203
מיקרוספרה מצופה סטרפטווידיןSpherotechSVP-20-5
מיקרוספרה מצופה אנטידיגוקסיגניןSpherotechDIGP-20-2
מיקרוספירות סטנדרטיות בגודלSpherotechPPS-6K
קלטת קפטוןKaptontape.comKPPTDE-1
זכוכית כיסוי מס' 2תרמו פישר12-543D
FERR0081

מקורות

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, Science. New York, N.Y. 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, Science. New York, N.Y. 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J,, Bustamante, C. Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, Science. New York, N.Y. 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, Science. New York, N.Y. 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, Science. New York, N.Y. 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D'Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. Biochemistry. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, Science. New York, N.Y. 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, Science. New York, N.Y. 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, Science. New York, NY. 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. The ribosome modulates nascent protein folding. 334, Science. New York, NY. 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101(2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. Biochemistry. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, RNA. New York, N.Y. 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624(2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קיפול RNAמולקולה בודדתמתיחה בכוחסיכת RNAקשירה לחרוזתא זרימהפתיחה מכניתמבנה שלישוני
Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.