Method Article

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

DOI:

10.3791/51554

⸱

September 9th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, University Medical Center Göttingen, 2Microbial Interface Biology Group, Research Center Borstel

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל לייצור מקרופאגים אנושיים. מעילים באפי מעובדים על ידי צנטריפוגה הכפולה שיפוע צפיפות ולאחר מכן מונוציטים מבודדים נבדלים למקרופאגים בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון. זה ממקסם תשואות מקרופאג ומקל על קצירת תאים לניסויים הבאים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופאגים אדם מעורבים בשפע של תהליכים פתולוגיים הנעים בין מחלות זיהומיות לסרטן. כך הם מהווים כלי רב ערך כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס של מחלות אלו. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקול פשוט לבידודה של מונוציטים אנושיים ממעיילים באפי, ואחריו הליך בידול וכתוצאה מכך תשואות מקרופאג גבוהות. הטכניקה מסתמכת בעיקר על ציוד מעבדה זמין בדרך כלל ובכך מספקת דרך עלויות וזמן אפקטיבית להשגת כמויות גדולות של מקרופאגים אנושיים. בקצרה, מעילי אפים מתורמי דם בריאים נתונים לצנטריפוגה כפולה שיפוע צפיפות למסוק מונוציטים מהדם ההיקפי. מונוציטים אלה בתרבית, בשקיות fluorinated פרופילן אתילן (FEP) מצופי טפלון תרבית תאים בנוכחות גורם macrophage-stimulating מושבה (M-CSF). ניתן לקצור מקרופאגים המובחנים בקלות ולהשתמש בהם ללימודים ופונקציונליים כמו שלאחר מכןאומר. שיטות חשובות לבקרת איכות ואימות של צעדי הבידוד ובידול יהיו מודגשות בתוך הפרוטוקול. לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר למדענים באופן שיגרתי וreproducibly לבודד מקרופאגים אנושיים ללא הצורך בכלי עלות האינטנסיבית. יתר על כן, ניתן ללמוד מודלים של מחלות במערכת אנושית syngeneic עקיפת השימוש במקרופאגים עכבריים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים משושלת monocytic והנגזרים סופני מבודלים שלהם - מקרופאגים - תערוכת פלסטיות מדהימה בכל קשור לתפקוד הביולוגי שלהם, שמובילה למעורבותם בתהליכים מגוונים כגון פיתוח, תיקון רקמות, וחסינות 1. האחרון הוא עקב phagocytic ויכולת הצגת אנטיגן אשר מציבה מקרופאגים בצומת שבין תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות 2. עם זאת, היכולת שלהם להפריש ציטוקינים, כמוקינים, גורמי גדילה, ומולקולות איתות אחרות 1 לא רק מגביר את תפקוד מערכת החיסון-modulatory, אלא גם משמש כבסיס לפונקציות נוספות שלהם. מנסה לשקף את הפעולות הבאות מגוונות הפעלה בהקשר של תנאים בתיווך שאינם חיידקים גרמו בקטגוריות M1 ו M2 3. בעוד סיווג זה אינו שלם, היא מאפשרת להבנה בסיסית של הביולוגיה מקרופאג.

בשל היכולות רבת הפנים האלה זה לא מפתיע שמקרופאגים קשורים למצבים רבים שבדרך כלשהי כרוכה שיפוץ רקמות או דלקת. הבא לתפקיד הבסיסי שלהם בהכרה ובאישור של פתוגנים הפולשים 4-6, מקרופאגים הגיעו יותר ויותר למוקד בטרשת עורק, סיסטיק, השמנת יתר, וסרטן 7-10. שיטה לשחזור לדור של מקרופאגים האנושיים לכן חיונית להבנה של פתולוגיות אלה. כאן אנו מציגים שיטה המבוססת על הבידוד של מונוציטים אנושיים מהדם ההיקפי של תורמים בריאים על ידי טכניקה כפולה צנטריפוגה שיפוע צפיפות כפי שתואר לעיל 11. על מנת להקל על בידול כלפי מקרופאגים, תאי monocytic המבודדים מודגרת בנוכחות ריכוזים נמוכים של M-CSF וסרום אנושי נורמלי 12. כדי להקל עוד יותר טיפול וקציר תא, התמיינות מתבצעת בFEP החדיר הגזשקיות תרבית תאים מצופים טפלון עם משטח הידרופובי 12-15. יכולים להיות נתונה מקרופאגים נחים וכתוצאה מכך למגוון רחב של מבחני כפי שהם עדיין מסוגלים להגיב בכל אופנת M1 או כמו-M2. יש להם שיטות אלטרנטיביות של בידוד מונוציטים ובידול שלאחר מכן, כגון תא מופעל מגנטי מיון (MACS) או נגדי elutriation צנטריפוגלי (CCE) מגבלות מסוימות לגבי התשואה, העלות, והזמן הנדרש. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מציע את היתרון שניתן לבצע אותו עם ציוד מעבדה סטנדרטי ללא הצורך בחומרים כימי מיוחדים (למשל, מקים חרוזים מגנטיים) או התקנים (לדוגמא, מנגנון CCE) ומאפשר לעיבוד של כמויות גדולות של תאים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 הכנת סרום סטרילי AB האדם

  1. לאסוף 4-5 שקיות של פלזמה טרי קפואה (FFP). שקיות חנות ב -20 ° C עד מספיק תיקים כבר נאספו.
  2. להפשיר שקיות ודגירה של 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס באמבט מים כדי להשבית משלים ולהסיר הפיברין.
  3. ביסודיות לחטא מחוץ לשקיות ולהעביר את הפלזמה ל50 צינורות מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר כדי להיפטר ממשקעים וטסיות דם שיורית.
  5. בריכה כל supernatants וזורקים את כדורים.
  6. דגימות סרום Aliquot ב15 צינורות מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בסרום זמין מסחרי מומת חום נורמלי אנושי AB.

.2 בידוד של המונוציטים

כדי להקל על איזון של צנטריפוגות, מומלץ לעבד שני מעילים באפי במקביל. עם זאת, לקחת caמחדש להשתמש בחומרים נפרדים לכל תורם ולא לערבב את התאים. במקרה שלא ניתן להשיג את המעילים באפי בקלות, 400 מ"ל של דם היקפי heparinized ניתן להשתמש במקום.

  1. לחטא בזהירות את שקיות ניילון המכילות את המעילים באפי ולהעביר את התוכן של כל מעיל באפי לשני צינורות 50 מ"ל.
  2. עבור כל מעיל באפי למלא שלושה 50 צינורות מ"ל עם 15 מ"ל פתרון Ficoll (1.077 g / ml). Ficoll צריך להיות בטמפרטורת חדר להכנה.
  3. שכבת 30-35 מ"ל של דם המעיל באפי על גבי פתרון Ficoll לשיפוע הצפיפות הראשון. להיות זהיר כדי לעשות לאט ובזהירות זה על מנת למנוע ערבוב שני השכבות.
  4. צנטריפוגה ב XG 400 ללא בלם 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  5. לכל שיפוע לאסוף את הטבעת הלבנה של תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) אשר ממוקם בין שני השלבים עם פיפטה פסטר פלסטיק ולהעביר צינור 50 מ"ל.
  6. ממלא כל צינור עם PBS-EDTA (1 מ"מ) עד 40 מ"ל בסך הכל.
  7. צנטריפוגה XG 300 10 דקות ללא בלם בטמפרטורת חדר.
  8. supernatant ולשאוב לשטוף גלולה שוב עם 40 מ"ל PBS-EDTA (1 מ"מ).
  9. עבור כל בריכה שתורם כדורים ב20 מ"ל RPMI-1640 ללא FCS% אדומים 10 + פנול.
  10. הכן את פתרון Percoll iso-האוסמוטי לשיפוע הצפיפות השני: לשני תורמים לערבב 23.13 מ"ל פתרון Percoll (צפיפות: 1.131 גר '/ מ"ל) בצינור 50 מ"ל עם 1.87 מ"ל פי 10 PBS. לאחר מכן להעביר 23 מ"ל של פתרון זה לצינור 50 מ"ל חדש ולהוסיף 27 מ"ל RPMI-1640 עם FCS% אדומים 10 + פנול כדי להשיג פתרון Percoll iso-האוסמוטי 46%. Percoll צריך להיות בטמפרטורת חדר להכנה.
  11. עבור כל העברה תורמת 25 מ"ל של פתרון Percoll מוכן צינור מ"ל 50 ושכבת פתרון PBMC הערוך 2.9) על גבי פתרון Percoll. להיות זהיר כדי לעשות את זה מאוד לאטד בזהירות, בשתי השכבות נוטות לערבב קלות. אם נעשה בצורה נכונה ניתן להבחין בין שני השלבים בשל ההבדל שלהם בצבע.
  12. צנטריפוגה ב 550 XG ללא בלם 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  13. לכל שיפוע לאסוף את הטבעת הלבנה של מונוציטים הנמצא בין שני השלבים עם פיפטה פסטר פלסטיק ולהעביר צינור 50 מ"ל.
  14. ממלא כל צינור עם PBS-EDTA (1 מ"מ) עד 50 מ"ל בסך הכל.
  15. צנטריפוגה ב XG 400 עבור 10 דקות ללא בלם בטמפרטורת חדר.
  16. לשאוב supernatant ו resuspend את כדורים ב20 מ"ל RPMI-1640 עם FCS% אדומים 10 + פנול.

.3 התמיינות של מונוציטים להמקרופאגים

  1. לקבוע את מספר מונוציטים מבודדים בדילול 1:10 בכחול trypan. לספור רק את התאים הגדולים, לעתים קרובות לא סדירה בצורת, שהם מונוציטים. אל לספור את התאים הקטנים יותר, בצורה העגולה שהם לימפוציטים.
    NOTE: מספרים מונוציטים לא צריכים להיקבע גם באופן מדויק, כי לתת להם רק רמזו על כמה ואשר מצופה טפלון FEP שקיות (קטנות או גדולות) צריך לשמש להתמיינות התאים.
  2. ל1.0-1.5 x 10 8 מונוציטים מתורם אחד, זרע התאים בשקית תרבית תאים מצופה טפלון FEP גדולה. עבור כל שקית להכין מדיום התרבות בהיקף של 174 מ"ל RPMI-1640, 2% בסרום אנושי AB (כפי שהוכן בסעיף 1), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו2.5 ng / ml M-CSF (נפח כולל: 180 מ"ל).
    1. ל3.0-5.0 x 10 7 מונוציטים מתורם אחד, זרע התאים בשקית תרבית תאים מצופה טפלון קטנה. עבור כל שקית להכין מדיום התרבות בהיקף של 28.5 מ"ל RPMI-1640, 2% בסרום אנושי AB (כפי שהוכנו בסעיף 1), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו2.5 ng / ml M-CSF (נפח כולל: 30 מ"ל).
      הערה: אם למשל, 8.0 x 10 7 מונוציטים מתקבלים, אנו ממליצים לזרעם בtwo שקיות נפח קטנות יותר עם ​​4.0 x 10 7 תאים כל אחד. במקום M-CSF, יכולים לחלופין להיות מובחנים מונוציטים עם גורם מקרופאג granulocyte מגרה מושבה (GM-CSF) באותו הריכוז (2.5 ng / ml).
  3. מוסיף את ההשעיה התא (20 מ"ל) למדיום מוכן ומערבבים היטב. אם שתי שקיות מוכנות מתורם אחד, להוסיף 20 מ"ל RPMI-1640 להשעית התא ולאחר מכן להוסיף חצי מההשעיה לכל הכנה בינונית.
  4. אופציונאלי: כדי לקבוע אם הכנת מונוציטים נשארה סטרילי, לקרוע ירידה של ההשעיה תא אחד על צלחת אגר דם ודגירה במשך לילה על 37 מעלות צלזיוס.
  5. הדק את הנדן של 50 מ"ל perfusor מזרק על התוספת של שקית תרבית תאים מצופה טפלון FEP ולמלא אותו בהשעית התא מוכנה.
  6. נתק את המזרק ולדחוף את האוויר שנותר מחוץ לשקית. סגור את השקית עם קונוס סגירה.
  7. דגירה השקיות של 6-7 ימים ב3776; C עם 5% CO 2.

.4 מקרופאג קציר

  1. מניחים את שקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP עם מקרופאגים המובחנים על קרח למשך שעה לפחות 1 כדי להקל על ניתוק של התאים (דגירה של עד 3 שעות אפשרית). לוודא כי פני השטח של התיק כולו מכוסה בקרח.
  2. משוך את השקית עם לחץ מינימאלי 10x מעבר לקצה שולחן / לוח.
  3. לחטא בזהירות מחוץ לתיק ולהסיר את חרוט הסגירה.
  4. הדק מזרק 50 מ"ל בתוספת של התיק, להסיר את ההשעיה התא, ולהעביר אותו ל50 צינורות מ"ל.
  5. צנטריפוגה ב XG 400 עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי לסובב את התאים.
  6. לשאוב supernatant וברכת כדורים משקית אחת ב10 מ"ל RPMI-1640 10 + FCS% בסך הכל.
  7. קבע את מספר התא בhemocytometer (1: 4-1: 10 דילול בכחול trypan). לספור את התאים עגולים הגדולים בלבד.
    הערה: לאחר ההבחנה מקרופאגים בשקיות מצופות טפלון FEP, לא יכול להיות תאים שיורית למשל, לימפוציטים, בהתאם לתורם ועל איכות בידוד מונוציטים.
  8. כדי לעשות שימוש חוזר בשקיות מצופות טפלון FEP, לשטוף אותם פעמיים עם 70% אתנול להסרת תאי שיורי. למלא אותם עם 50 מ"ל 70% אתנול ו דגירה הלילה. שטוף את השקיות 3x עם PBS סטרילי, לעטוף אותם בנייר עיקור, ולעקר ב החיטוי באמצעות נהלים סטנדרטיים.
    הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר שקיות תרבית תאים מספר פעמים ללא כל הפסד בתשואות מקרופאג. עם זאת, החלטנו לבטל את שקים אחרי 10 משתמש לפני שהם מתחילים לדלוף.
  9. למקרופאגים תרבות הניסויים הבאים בFCS + 10% RPMI-1640. אם ריכוזים נמוכים יותר בסרום נדרשים, טיפוח בRPMI-1640 עם 1% FCS הוא גם אפשרי. זרע ותאי דגירה ל3-4 שעות. לאחר תקופה זו, לציין כי מקרופאגים לצרף אל פני השטח של אותו זמן צלחת תרבית תאיםכל תאים מזהמים (כלומר אריתרוציטים, לימפוציטים, ותאים דנדריטיים) להישאר בהשעיה. שטוף תאים לפחות פעמיים עם PBS להסיר תאים שאינם חסיד.
  10. לנתק מקרופאגים תרבותיים מצלחת תרבית תאים לניסויים נוספים, לגרד בזהירות אותם מעל פני השטח. לחלופין, דגירה מנות ל20 דקות על קרח, לשאוב את מדיום התרבות, ולהוסיף למאגר תא דיסוציאציה ללא אנזים 1 מ"ל. אחרי 5 דקות דגירה על 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 4 מ"ל PBS, ולנתק תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 3 דקות.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צנטריפוגה שיפוע הצפיפות הראשונה באמצעות Ficoll מניבה הביניים לבנים המכילים את PBMCs (איור 1 א) כלומר לימפוציטים ומונוציטים. זה יכול להיות אישר באמצעות הכתמת מאי גרינוולד (1B דמויות וC) של התאים שנאספו אשר מציג שני גרעין / יחס ציטופלסמה גבוה (האופייניים של לימפוציטים) וbean- או גרעינים בצורת טבעת (אופייני של מונוציטים). כאשר תאים אלה אז מועמסים על שיפוע צפיפות שני באמצעות Percoll, מונוציטים ניתן להפריד עוד יותר לימפוציטים ומופיעים שוב כביניים לבנים (איורים 1D-F). עבור כל מעיל באפי צנטריפוגה שיפוע הצפיפות כפולה תיארה מניבה באופן שגרתי x 150 ± 40 10 6 מונוציטים שיכולים להיות מובחן לx 70 ± 30 10 6 מקרופאגים (איור 2) למעייל באפי. תשואת מקרופאג הממוצעת מ20 הכנות עצמאיות היו 47 ± 14% ממונוציטים מבודדים סך הכל.

לאחר צנטריפוגה שיפוע Percoll עדיין ייתכן שיש כמה תאים שאינם monocytic השיורי נוכחי בהכנה וזה תלוי בתורם הדם, כמו גם על הדיוק של תהליך הבידוד. עם זאת, לאחר שלב ההתמיינות של 6-7 ימים, ההכנה מורכבת בעיקר מקרופאגים בוגרים (איור 3) אשר יכול להעשיר את בשל דבקותם במשטחי פלסטיק, תכונה שאינו משותפת על ידי תאי זיהום האקראי (איורים 4 א וב '). ברגע שמצופה, רוב מקרופאגים להראות מורפולוגיה קלאסית "ביצת עין" בזמן שיש גם תאים עם פנוטיפ כמו ציר נמתח (4C דמויות וD). זה משתקף על ידי הפצת F-תקטין בתוך אשכולות ציטופלסמה והדבקה. התאים המובחניםמאופיינים בביטוי של CD45, CD14, CD16, CD206 (קולט מנוז), CD11b וCD11c שהם סמנים אופייניים למקרופאגים הבוגרים (איור 5). הנוכחות של CD11b טוענת נגד בידול בעיקר דנדריטים אשר נתמך על ידי העובדה שהתאים הם שליליים עבור CD209 דנדריטים סמן תא (DC-SIGN).

לאחר תהליך התמיינות התאים נשארים פונקציונלי ומטבולית פעילה כ 5-7 ימים (איור 6) כפי שניתן דמיינו אותו על ידי calcein מכתימה בבוקר ואת היכולת שלהם לקחת את שלפוחית ​​תאית לשפוך מתאי גידול. בנוסף, עדיין יכולים להיות מופעלים התאים כפי שמוצג למשל, לגירוי עם lipopolysaccharide (LPS) אשר גורם לביטוי של מספר גנים פרו דלקתיים (איור 7).

figure-results-1 איור מראה 1 ורכב PBMC- ומונוציטים שכבה לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות כפולה. לצלם ממחישים את PBMC-band () לאחר שיפוע Ficoll ו( D) מונוציטים-השלב לאחר צנטריפוגה Percoll iso-האוסמוטי. stainings מאי-גרינוולד הכנות cytospin של (B, C) ​​חלק PBMC ו( E, F) שנותרה מונוציטים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר בB, E, = 50 מיקרומטר בC ו פ

figure-results-2
תשואת איור 2 של מונוציטים ומקרופאגים. Countings נציג התא של מונוציטים מבודדים ומקרופאגים של יחסי ציבור מעיל 20 אפיםeparations.

figure-results-3
Micrographs איור 3 ומדידות גודל תא של מונוציטים ומקרופאגים. מיקרוסקופ לעומת שלב של השעיה תא monocytic לפני () ואחרי בידול מקרופאג (B). מתאים היסטוגרמות גודל תא של מונוציטים (C) ומקרופאגים (ד '). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.

figure-results-4
איור 4 מורפולוגיה וארגון cytoskeletal של מקרופאגים חסיד. מיקרוסקופ לעומת שלב של מקרופאגים חסיד לפני () וההסרה אחרי (B) של אי adheren תאי T. הכתמה (C, D) Phalloidin-TRITC של אקטין פילמנטיות במקרופאגים חסיד, שאינו מגורה. סרגל קנה מידה בAC = 100 מיקרומטר, 20 מיקרומטר בד אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5
איור 5 immunophenotype של מקרופאגים המובחנים. זרימת cytometry הניתוח של מקרופאגים לאחר 6 ימים של בידול בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP (מסומן באדום). בקרות אלוטיפ המקבילות מוצגות באפור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

-page = "תמיד"> figure-results-6
איור 6 ספיג של microvesicles תאים סרטניים על ידי מקרופאגים. Micrographs של מקרופאגים חסיד אחרי האקספוזיציה לmicrovesicles שמקורן בתאים שכותרתו PKH26 גידול (אדום ניאון). תמונות תכסינה לbrightfield המקביל (א) או הכתמת cytosolic (ב ') עם AM calcein צבע הכדאיות. ברים סולם = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-7
איור 7 upregulation של β IL-1, Wnt5a, TNFα, IL-6, MMP-2, MMP-7, וMT1-MMP לאחר stimuויסות של מקרופאגים עם LPS (100 ng / ml) ל24 שעות. התבטאות גנים נמדד על ידי RT-PCR מדגימות כוללת RNA () ומנורמלות על ביטוי HPRT1 וGNB2L1. הערכים המוצגים הם שינויים לקפל בהשוואה לקבוצת הביקורת (פירוש SD ±, n = 5, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001). האינדוקציה TNFα וIL-6 תחת גירוי LPS אושרה עוד יותר על ידי ELISA (ב) (אמצעי ± SD, * p <0.05).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המקרופאגים הם תאי מפעיל חשובים של מערכת החיסון המולדת ולהציג תפקידים חשובים במשפר תפקוד מערכת חיסון, הצגת אנטיגן והומאוסטזיס רקמה. בשל הפלסטיות המדהימה שלהם, הם מסוגלים להגיב לגירויים שונים עם שינויים של הפנוטיפ שלהם. עם זאת, עד כה הרבה נתונים לגבי קיטוב מקרופאג מתקבלים במערכת העכברית, אם כי יש דיווחים שהראו כי רק כ 50% מסמני קיטוב מקרופאג יכולים להיות מתורגמים ישירות מעכבר ל16 אנושיים. לכן, אנו מציגים כאן שיטה כדי להשיג מקרופאגים אנושיים ראשוניים במספר ובטהרה מספקים ללא הצורך בחומרים יקרים, למשל, חרוזים מגנטיים MACS או מכשיר elutriation צנטריפוגלי נגדי.

השיטה שלנו מבוססת על הבידוד של מונוציטים מPBMCs והבידול הבא שלהם למקרופאגים בFEP הטפלון מצופים שקיות תרבית תאים בנוכחות conce הנמוךntrations של M-CSF 11-13. בעוד מונוציטים מהווים פחות מ -5 10% מכדוריות דם לבנות בדם היקפי בבני אדם, על גירוי שהם מגויסים לאתרים היקפיים שבו הם לבדל למקרופאגים רקמת תושב או תאים דנדריטים 17. ציטוקינים M-CSF הוא חשובים להישרדות מונוציטים ומניעים את הבידול שלהם למקרופאגים 18,19. עד כה, ריכוזי M-CSF שנבחרו לבידול מונוציטים נעו עד 100 ng / ml, לעומת זאת, בפרוטוקול שלנו אנו מסוגלים להשיג כמות מספקת של מקרופאגים הבוגרים עם ריכוז M-CSF של רק 2.5 ng / ml 12 , 20. בנוסף, תאים בתרבית בשקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP המאפשרות הניתוק של מקרופאגים והזריעה הבאה שלהם במספרים סלולריים שהוגדרו. מאז ניתן לעשות שימוש חוזר בשקיות כמה פעמים, זה מקטין עוד יותר את העלויות לתהליך הבידוד.

מקרופאגים מתקבלים על ידי הליך זהחיוביים מאוד עבור CD45, CD14, CD11b, CD11c ולהראות ביטוי של CD206 קולט מנוז אשר טוען לאוכלוסייה של מקרופאגים הטהורים, בוגרים 21,22. במיוחד ביטוי CD14 גבוה אופייני למקרופאגים מובחנים בנוכחות M-CSF 23. לאחר הזריעה של התאים, הם מציגים את דבקות מהירה למשטחי פלסטיק עם כמה תאים מראים מורפולוגיה כמו ציר טיפוסי, בעוד שאחרים מפגינים פנוטיפ ביצה מטוגן. זה בהתאם לתצפיות ממחברים אחרים 18,22,24.

נמסר כי בידול מונוציטים בנוכחות M-CSF גורם למקרופאגים מקוטבים-M2 16,25. עם זאת, מקרופאגים המבודדים על ידי הפרוטוקול שלנו עדיין מסוגלים להגיב למגוון רחב של גירויים הכוללים חשיפה לmicrovesicles שמקורן בתאי גידול והתרבות משותפת עם תאי גידול 26,27 או חשיפה לLPS שאליו הם מגיבים עם גיוס של הפרו גנים דלקתיים כגון IL-1 &# 946 ;, TNFα, Wnt5a, או metalloproteinases מטריצה ​​השונים שנחשבים אופייניות למקרופאגים מקוטבים-M1 3,5,28.

לסיכום, את בידודה של מונוציטים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות הכפולה והבחנה שלאחר מכן לכיוון מקרופאגים בתוצאות שקיות תרבית תאים מצופים טפלון FEP במספרים גבוהים של מקרופאגים ללא הצורך בהליכים קשים או יקרים מבחינה טכנית. מקרופאגים שהושגו יכולים להיות מנוצלים לניתוח שלאחר מכן החל הפעלה קלאסית דרך LPS לתרבות המשותפת עם תאים סרטניים.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש לי המחברים אין לחשוף כמו שאף ניגוד העניינים קיים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לגב 'מיקה Schaffrinski לקבלת הסיוע הטכני תמיד המעולה שלה במהלך השנים האחרונות.

עבודה זו מומנה על ידי המועצה הגרמנית למחקר (DFG) בקבוצת המחקר המשותף 942 (FOR942) ועל ידי תכנית המחקר של הפקולטה לרפואה, גטינגן גיאורג אוגוסט-אוניברסיטה.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוגדנים לאימונופנוטיפבקמן קולטרלדוגמה: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), בקרת איזוטיפ IgG1-PE (A07796), בקרת איזוטיפ IgG1-FITC (A07795)
BioLegendsלדוגמה: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)
מיקרוסקופ Axiovert 200MZeiss
Calcein AMAnaSpec89201
קונוסים לסגירת פקק משולבבראון4495101
1x PBS, ללא Ca ו- MgPan ביוטקP04-36500עבור PBS-EDTA (1 מ"מ) הוסף 1 מ"ל 0.5 M EDTA לכל 500 מ"ל PBS
10x PBS, ללא Ca ו- MgInvitrogen14200-067
EDTA (Titriplex III)Merck1084211000להכין תמיסה של 0.5 M ב- H2O, השתמש במסנן סטרילי
מאגר דיסוציאציה של תאים (נטול אנזימים, מבוסס PBS)Gibco13151-014
סרום עגל עוברי (FCS)Invitrogen10091148מומת בחום
(צפיפות 1.077 גרם/מ"ל)Biochrom AGL6115
FACSCanto IIBD Biosciences
עז נגד עכבר FITCסנטה קרוזSC-2010
LPS מ- E.coliSigmaL8274conc סופי: 100 ננוגרם/מ"ל
מולטיפוגה 3 L-RHeraeus
פניצילין/סטרפטומיציןBiochrom AGA2213
Percoll (צפיפות 1.131 גרם/מ"ל)GE Healthcare17-0891-02
מזרק פרפוזור 50 מ"לבראון8728844F
Phalloidin-TRITCSigmaP1951מושהה במתנול (c = 0.1 מ"ג/מ"ל)<
פלסטיק חד פעמי פסטר פיפטותטכנולוגיות LVL 2655181
rh M-CSFImmunoTools11343117השעיה ב-500 ומיקרו; l סטרילי H2O סטרילי (c = 100 ng/µ l), aliquot
RPMI-1640 עם פנול אדוםGibco21875-034
RPMI-1640 ללא פנול אדוםGibco11835-063
נייר עיקורVP group3KFKFS230116
כתם כחול טריפן (0.4% w/v)SigmaT8154
FEP שקית תרבית תאים מצופה טפלון,CellGenix72-C
קטןשקית תרבית תאים מצופה טפלון FEP,CellGenix197-C
Ficoll td colspan="4">[header] גדול

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, 445-455 (2013).">Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, 445-455 (2013).
  2. Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System. Science. 327, 291-295 (2010).">Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System. Science. 327, 291-295 (2010).
  3. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).">Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).
  4. CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival. J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).">Lionakis, M. S., et al. CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival. J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).
  5. The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation. Blood. 108, 965-973 (2006).">Blumenthal, A., et al. The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation. Blood. 108, 965-973 (2006).
  6. Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania. Nat Med. 19, 909-915 (2013).">Lima, D. S., et al. Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania. Nat Med. 19, 909-915 (2013).
  7. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).">Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).
  8. Obesity, inflammation, and macrophages. Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).">Subramanian, V., Ferrante, A. W. Jr Obesity, inflammation, and macrophages. Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).
  9. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).">Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).
  10. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice. Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).">Pradere, J. P., et al. Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice. Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).
  11. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).">Danciger, J. S., et al. Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation. J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).
  12. Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity. J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).">Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity. J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).
  13. Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes. J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).">Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes. J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).
  14. Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast. Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).">van der Meer, J. W., et al. Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast. Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).
  15. Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag. Immunology. 47, 617-625 (1982).">van der Meer, J. W., et al. Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag. Immunology. 47, 617-625 (1982).
  16. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).">Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  17. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).">Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).
  18. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).">Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10. Blood. 89, 315-321 (1997).
  19. Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy. Cell. 28, 71-81 (1982).">Tushinski, R. J., et al. Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy. Cell. 28, 71-81 (1982).
  20. Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion. Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).">Rietkotter, E., et al. Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion. Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).
  21. Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts. Plos One. 4, E7475(2009).">Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts. Plos One. 4, E7475(2009).
  22. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos One. 7, e42656(2012).">Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos One. 7, e42656(2012).
  23. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).">Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  24. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair? Cell Ther Transplant. 2, (2010).">Chernykh, E. R., et al. The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair? Cell Ther Transplant. 2, (2010).
  25. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).">Verreck, F. A., et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  26. Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).">Pukrop, T., et al. Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).
  27. Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK. J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).">Hagemann, T., et al. Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK. J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).
  28. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).">Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human MonocytesDouble Gradient CentrifugationTeflon coated Cell Culture BagsMacrophage DifferentiationBuffy Coat IsolationPeripheral Blood Mononuclear CellsM CSF StimulationFlow Cytometry AnalysisCell Culture BagsDensity Gradient Centrifugation

Related Articles