הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T

14.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51627

⸱

19 ביוני 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

במאמר זה

סיכום

היכולת לעקוב אחר תגובות תא T בפירוט in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו. כאן אנו מתארים את השימוש במערכי ניאון יעד (FTAs) בin vivo assay תא T שמעריך> 250 פרמטרים בו זמנית על ידי cytometry זרימה.

תקציר

היכולת לעקוב אחר תגובות תא T in vivo היא חשובה לפיתוח ההבנה של התגובה החיסונית שלנו ואת העיצוב של immunotherapies. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית מערך יעד ניאון (FTA), אשר מנצלת צבעים חיוניים כגון succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE), צבעי לייזר סגול להתרגש (ויולט CellTrace: CTV) וצבעי לייזר אדום להתרגש (Cell הפצת הנשק דיי eFluor 670: CPD ) לcombinatorially ימפוציטים עכבר תווית ל> 250 צבירי תאי ניאון להבחין. צבירי תאים בתוך FTAs אלה ניתן פעמו עם histocompatibility המרכזי (MHC) פפטידים מחייבים ברמה שאני וMHC ברמה השני ובכך לפעול כתאי מטרה לCD8 + ותאים מסוג CD4 + T, בהתאמה. תאי FTA אלה להישאר קיימא ומתפקד באופן מלא, ולכן יכולים להינתן לעכברים כדי לאפשר הערכה של הרג בתיווך תא CD8 + T תאי יעד FTA והל-מדיטציה של תאי CD4 +עמ 'של תאי יעד תא FTA B בזמן אמת in vivo על ידי cytometry זרימה. מאז ניתן להעריך> 250 תאי מטרה בפעם אחת, הטכניקה מאפשרת הניטור של תגובות תא T נגד כמה אפיטופים אנטיגן בכמה ריכוזים ובחזרות מרובות. ככזה, הטכניקה יכולה למדוד את תגובות תא T בשני (למשל גודל המצטבר של התגובה) כמותיים ו( להיטות למשל. פונקציונלית ותגובתיות epitope צולב של התגובה) איכותית ברמה. בזאת, אנו מתארים כיצד FTAs ​​אלה בנויים ולתת דוגמא של איך הם יכולים להיות מיושמים על מנת להעריך את תגובות תא T הנגרמות על ידי נגיף אבעבועות חיסון רקומביננטי.

מבוא

תאי T לשחק תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית אדפטיבית ולעתים קרובות יעד למניפולציה באימונותרפיה. תאי T מסוג CD4 + מפעיל להגיב לאנטיגן הזר על ידי הפרשת ציטוקינים המסדירים היבטים רבים של חסינות והוא יכול גם לעזור באופן ישיר תאי B לייצר נוגדנים. תאי CD8 + T ציטוטוקסיים (הרג) יכולים גם להגיב לאנטיגן הזר על ידי הפרשת ציטוקינים כמו גם משחק תפקיד מרכזי באופן ישיר הרג תאי מבטאי אנטיגן זר. האינטראקציה הבסיסית שיוזמת פונקציות מפעיל תא T אלה כרוך באינטראקציה של קולטן תא T (TCR) עם פפטידים זרים המוצגים על מולקולות MHC על פני השטח של תאים. תאים מסוג CD4 + T מכירים חלבונים המוצגים על מולקולות MHC ברמה השניה בתאי המציגים אנטיגנים ותאי CD8 + T מכירים חלבונים המוצגים על מולקולות MHC ברמה שאני שמוצגים בדרך כלל בתאי חיידק נגוע.

על מנתכדי להעריך את תפקיד תאי T לשחק בתגובה חיסונית, זה חיוני כי פונקציות מפעיל שלהם נמדדות על ידי טכניקות אמינות ורגישות. שיטות נפוצות להערכת תגובת תא T כוללות; MHC class-I/II/peptide תגובתיות tetramer; ייצור ציטוקינים על ידי ELISPOT ומכתים ציטוקינים תאיים; והורג את הקיבולת על ידי 51 מבחני Cr-שחרורו. מבחני אלה, לעומת זאת, מבוצעים בדרך כלל ex vivo עם גירוי במבחנה, או לספק תובנה מוגבלת לתפקוד תא T. באופן אידיאלי, כאשר מודדים תגובות תא T זה יהיה מועיל להעריך אותם באתרו, in vivo כפי שהם מתרחשים, ללא מניפולציה של תאי T כדי למנוע שינויים בפרמטרים תפקודיים שעלולים להתרחש באמצעות גירוי במבחנה. חלק הנפוץ ביותר במבחני תא T vivo פונקציונליים מבוססים על מדידת הרג CTL בתיווך של תאי היעד פעמו עם פפטידים אני מחייב כיתת MHC, המנויים בvivoבאמצעות זיהוי שלהם באמצעות תיוג ניאון עם צבעים חיוניים כגון CFSE. בעוד סוגים אלה של מבחני יכולים לפקח על הרג CTL בתיווך של מטרות כשהם קורים in vivo, יש להם יכולת מוגבלת יחסית להעריך הריגתם של מטרות מרובות הצגת ריכוזים שונים וסוגים שונים של אפיטופים פפטיד, אשר נדרש כדי לאפשר לפרמטרים איכותיים כגון בעבר להיטות כפונקציונלית וריאנט epitope תגובתיות צולבת להיות מוערכת. מבחני אלה גם אינם מספקים שום מידע על תגובות תא בתיווך מסוג CD4 + T.

כדי להתגבר על רב מהמגבלות עם שיטות הנוכחיות שימשו להערכת תגובות תא T, שפתחנו לאחרונה זמנית assay המבוסס על מערכי ניאון יעד (FTAs), המאפשר הניטור של תגובות תא T נגד> 250 תאי המטרה בו זמנית בחיה אחת על ידי cytometry זרימת 1, 2. FTAs מורכב של לימפוציטים שכותרתו עם sevריכוזי eral ושילובים של צבעים חיוניים כמו CFSE, CTV ועלות לכל יום ומאפשרים> 250 צבירי תאים של הקרינה ייחודית להיות שנוצרו. מכיוון שהתאים אלה נשארים קיימא ומתפקד באופן מלא, הם יכולים להיות מוזרקים לבעלי חיים כדי לאפשר ניטור של האינטראקציה שלהם עם תאי T מפעיל in vivo 3. לדוגמא, יכולים להיות פעמו צבירי תאי FTA עם פפטידים אני מחייב ברמה MHC כדי לאפשר הערכה של הרג CTL בתיווך אנטיגן הספציפי של תאי יעד 1. בנוסף, יכולים להיות גם פעמו צבירי תאי FTA עם פפטידים MHC ברמה השנייה מחייבים, המאפשרים הערכה של תא T מסייע אנטיגן ספציפי לפעילות (T H) על ידי הערכת הפעלה (על ידי הערכה של סמני הפעלה כגון CD69, CD44 ו / או CD62L) של תאי B בתוך FTA נושאים פפטיד מאותו המקור 2. מאז ניתן לאתר יותר מ -250 מטרות בו זמנית, ניתן למדוד תגובות CTL וT H נגד צבירי תאים רבים יעד פעמו עם nפפטידים umerous בריכוזים שונים וההכללה של משכפל רבים. Assay FTA לכן מספק רמה חסרת תקדים של הערכת תגובת מפעיל תא T in vivo.

כאן אנו מתארים בפירוט את הבנייה של FTA ולהראות עד כמה הם יכולים להיות מיושמים להערכת תגובות תא T in vivo. הנוהל מתאר את בניית FTA המורכב מ252 צבירי תאים ניתן להבחין באמצעות השימוש בשלושה צבעים חיוניים, מורכבים 6 חזרות של 42 צבירי תאים פעמו עם MHC ברמה שאני ופפטידים השני מחייבים. התיוג של 42 צבירי תאים מתרחש ב10 חרוטי מיליליטר עם תחתית צינורות וזה עוזר להוציא אלה במעמד צינור כמתואר בטבלה 1. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למספרים קטנים יותר של אשכולות להבחין כפי שנדרשה על ידי הפחתת הכמות של תיוג של כל צבע שבוצע 1.

אנו מדגישים את התועלת של assay על ידי מראה איך זה יכול למדוד responses שנוצר על ידי חיסון אבעבועות וירוס רקומביננטי נגד אפיטופים מרובים במדגם קטן של עכברים. זה מראה כיצד assay FTA יכול לשמש כדי למדוד את התגובות מצטברות ולהיטות פונקציונלית דרך, בהתאמה, את השימוש בשטח תחת עקומת הערכות (AUC) ומדידת ריכוז הפפטיד יעיל נדרש ליצור תגובות מחצית מקסימליים (50 EC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: עכברים המשמשים תחת פרוטוקול זה טופלו על פי ההנחיות של ועדת האתיקה לניסויים בבע"ח האוניברסיטה הלאומית של אוסטרליה והעכברים מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם.

1. דיי ופפטיד הכנה

  1. הכנה דיי
    הערה: צבעים הם prediluted בריכוזים שונים כדי לאפשר תיוג של תאים בעוצמות הקרינה בדידות. CFSE משמש בשבעה ריכוזים נעשו באמצעות דילולים סדרה 3.5 פי, וCTV ועלות לכל יום נמצאים בשימוש בשישה ריכוזים שונים נעשו באמצעות דילולים סדרה 3.7 פי (ראה לוחות 2-4). ריכוזי המניות של צבעים המופיעים בלוחות 2-4 ישמשו לתייג תאי יעד בריכוזי הצבע הסופיים מופיעים בלוחות 2-4. צבעים מגיבים בחשיפה לתמיסה מימית. לכן חשוב שבקבוקונים להיות equilibrated לRT לפני הפתיחה כדי לצמצם את החשיפה של צבעים לעיבוי.
    1. CFSE
      הערה: CFSE נרכש כsuccinimidyl אסתר diacetate carboxyfluorescein (CFDA, SE; MW 557.47), בדרך כלל ב25 מ"ג / בקבוקון.
      1. Resuspend 25 מ"ג CFSE ב4.48 מיליליטר DMSO להשיג פתרון מניות 10 מ"מ.
      2. סדרתי לדלל CFSE: הוסף 35 μl של 10 מניית CFSE מ"מ ל87.5 μl של DMSO ולחזור על זה עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז לצבוע בטבלה 3.
    2. CTV
      הערה: CTV נרכש בדרך כלל באריזות של 9 מבחנות, כל אחת מהן ניתן מחדש עם 10 μl של DMSO לייצר פתרון 10 מ"מ של הצבע.
      1. מחדש וברכה כל 9 הבקבוקונים של CTV עם 90 μl של DMSO לתת פתרון 10 מ"מ.
      2. סדרתי לדלל CTV: הוסף 11 μl של 10 מניית מ"מ CTV ל29.7 μl של DMSO ולחזור על זה עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז לצבוע בטבלה 2.
    3. CPD
      הערה: עלות לכל יום (MW 792.6) אופייניתly נרכש כ0.5 מ"ג / בקבוקון.
      1. מ"ג resuspend 0.5 של CPD ב63 מיליליטר של DMSO לקבל פתרון 10 מ"מ.
      2. סדרתי לדלל CPD: הוסף 11 μl של 10 מניית CPD מ"מ ל29.7 μl של DMSO ולחזור על זה עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז לצבוע בטבלה 4.
        הערה: ניתן לאחסן מניות דיי ב -20 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים ויכולות להיות מופשרת ומקפיא כמה פעמים ללא איבוד משמעותי בתפקוד.
  2. הכנת פפטיד
    הערה: פפטידים MHC ברמה שאני מחייב משמשים בדרך כלל לדופק תאי יעד ב6 ריכוזים שונים נעשה באמצעות 10 דילולים קיפול מריכוז התחלתי של 1 מיקרומטר (לוח 5). פפטידים השני מחייבים כיתת MHC משמשים בדרך כלל לדופק תאי יעד ב6 ריכוזים שונים נעשה באמצעות 3 דילולים קיפול מריכוז התחלתי של 400 מיקרומטר (לוח 5). כל פפטיד מורכב בריכוז סופי 2x בtha כגון PBSיש לא כל ריכוז הפפטיד היקף מינימאלי של 250 μl. ניתן להכין מניות פפטיד לפני בניית FTA ומאוחסנות ב -20 ° C, ללא אובדן משמעותי בתפקוד.
    1. פפטידים מניית הכנת MHC ברמה שאני מחייב
    2. הכן את הריכוז הגבוה ביותר של כל epitope פפטיד ל2 פתרונות מניות מיקרומטר (2x 1 מיקרומטר)
    3. סדרתי לדלל פפטידים אני מחייב ברמה MHC: להוסיף 44.4 μl של 2 מניות פתרון פפטיד מיקרומטר ל400 μl של PBS. חזור על פעולה זו עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז הפפטיד בטבלה 5.
    4. פפטידים מניית הכנת MHC ברמה השנייה מחייבים
    5. הכן את הריכוז הגבוה ביותר של כל epitope פפטיד ל800 מיקרומטר פתרונות מניות (2x 400 מיקרומטר).
    6. סדרתי לדלל פפטידים ברמה השנייה מחייבים MHC: להוסיף 150 μl של 800 פתרון פפטיד מיקרומטר ל300 μl של PBS. חזור על פעולה זו עם פתרון מניות מדולל לתת לכל ריכוז הפפטיד בטבלה 5 .

2. FTA הכנה

הערה: ההליך שלהלן מתאר את הקמתו של אזור סחר חופשי המורכב מתאים פעמו עם 7 אפיטופים פפטיד שונים ב6 ריכוזים שונים (כלומר 42 צבירי תאים.) חוזרים 6 פעמים כדי ליצור 252 צבירי תאים להבחין. בתוך כל חוזר, אשכול תאים לא פעמו עם כל epitope (ניל), נכלל כביקורת. זה מועיל עבור FTAs ​​יש הבדל allotype CD45 מבעלי החיים מארח כדי לאפשר האפליה שלהם מתאי נמען על ידי תיוג נוגדן בזמן הניתוח. אחרת יכול להיות מתויג FTAs ​​עם צבעים אחרים כגון PKH-26 למטרה זו (שמתוארת בשלב 2.6). בדרך כלל, הליך הכנת FTA מתבצע מתחילתו ועד סופו בישיבה אחת.

  1. תווית 42, 10 חרוטי מיליליטר עם תחתית צינורות פלסטיק 1-42 (כמו בטבלה המס '1 לדוגמא).
  2. הכנת תאים
    1. לבודד טחול ו / או lymphnodes מעכברים. הכן את ההשעיה תא בודדת מרקמות על ידי רסוק דרך 70 מיקרומטר התעמק מסננת עם בוכנת מזרק 5 מ"ל ולספור תאים באמצעות hemocytometer.
    2. Resuspend ימפוציטים בעד 200 x 10 6 תאים / מיליליטר ב11.5 מיליליטר של רוצ'סטר פרק זיכרון מכון 1640 (RPMI, או שווה ערך) המכיל 5% בסרום עוברי עגל (FCS). הערה: חשוב להשתמש חיץ עם תוכן אמין גבוה כדי למזער את רעילות צבע לתאים 3.
  3. תיוג CTV
    הערה: תאים תחילה מסומנים עם 6 ריכוזים של CTV.
    1. יסודיות resuspend התאים על ידי צינור היפוך כמה פעמים. הוספת 1.9 מיליליטר של השעיה תא עד 6 מתוך 10 מיליליטר הצינורות שכותרתו 37-42, נזהרת שלא להרטיב את המחצית העליונה של החצוצרות.
    2. תווית תאים עם CTV, להסיר את כובע הצינור ולהניח את הצינור בצורה אופקית.
    3. הוספת 83 μl של PBS לחלק הלא הרטוב בחלקו העליון של הצינור, וזה מוסיף 17 μl של המניה CTV (ראה Table 2 שעבורה פתרון מניות מוקצה שלצינור). הערה: צינור רטוב שאינו חשוב כדי למנוע תנועת השעיה תא וערבוב המוקדם של פתרון התא עם פתרון הצבע.
    4. שווי הצינור ולערבב את ההשעיה התא עם הצבע במהירות וביסודיות על ידי vortexing.
    5. חזור על שלבי 2.3.2-2.3.4 עבור מניית הפתרונות של CTV בצינורות המיועדים המתוארים בטבלה 2.
    6. דגירה תאים למשך התקופה מינימאלית של 5 דקות ב RT (20 מעלות צלזיוס).
  4. תיוג CFSE
    1. לאחר תיוג CTV, מוסיף 5 מיליליטר של RPMI FCS המכיל 5% לכל צינור וresuspend ביסודיות את התאים על ידי vortexing.
      1. מצינור 37 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא לצינורות ביום 31 ב, 25, 19, 13, 7 ו 1.
      2. מצינור 38 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא צינורות 32, 26, 20, 14, 8, ו -2.
      3. מצינור 39 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא צינורות 33, 27, 21, 15, 9, ו -3.
      4. ממיליליטר צינור 40 העברה 1 של תאהשעיה לצינורות 34, 28, 22, 16, 10, ו -4.
      5. מצינור 41 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא צינורות 35, 29, 23, 17, 11, ו -5.
      6. מצינור 42 העברה 1 מיליליטר של השעיה תא לצינורות 36, 30, 24, 18, 12, ו6
        שים לב: יש להיזהר שלא להרטיב את המחצית העליונה של הצינורות במהלך שלבי 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. תווית תאים עם CFSE, להסיר את כובע הצינור ולהניח את הצינור בצורה אופקית.
    3. הוספת 103 מיליליטר של PBS לחלק הלא הרטוב בחלקו העליון של הצינור, וזה יוסיף 7 מיליליטר של CFSE המניות (ראה טבלה 3 שעבורה פתרון מניות מוקצה שלצינור).
    4. שווי הצינור ולערבב את ההשעיה התא עם הצבע במהירות וביסודיות על ידי vortexing.
    5. האם צעדי 2.4.2-2.4.4 עבור מניית הפתרונות של CFSE בצינורות המיועדים המתוארים בלוח 3.
    6. דגירה תאים למשך התקופה מינימאלית של 5 דקות ב RT (20 מעלות צלזיוס).
    7. שטוף תאים: לדלל השעיה תא עם 9 מיליליטר של 20 ° CFCS 5% המכיל RPMI, משקעים ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatants על ידי שאיפה עם טפטפת העברה.
  5. פועם פפטיד ושטיפת תא
    הערה: לאחר התאים סומנו בתווית עם CTV וCFSE, הם פעמו עם MHC מעמד אני ו / או MHC ברמה השני פפטידים מחייבים (שהוכנו ב1.2). אחת מאוכלוסיות התאים חייב גם לא פעמה עם פפטיד (למשל. Nil בטבלה 1) ושימש כביקורת שלילית לחישוב של תגובות תא T.
    1. פועם פפטיד
      1. תאי resuspend בהיקף כולל של 250 μl של RPMI FCS המכיל 5%. הערה: בדרך כלל 50 μl של השעיה תא נשאר לאחר השאיפה של supernatant בסוף הצעד 2.4.7, ולכן להוסיף 200 μl של מדיום לתא גלולה.
      2. הוסף 250 μl של מניות פפטיד מראש מוכנות (כמו בלוח 5) לייעודיים כראוי צינורות (כמו בטבלה המס '1) ולהיות סורדואר לכלול צינור שליטה של ​​PBS הוסיף לבד בלי פפטיד כביקורת Nil.
      3. מערבבים השעיות תא עם מערבולת. שים לב: זה קריטי, כי כל epitope פפטיד וכל ריכוז הפפטיד מוקצה לצינור ויחיד זה שנרשם באופן ברור המבוסס על הקרינה הצפויה של התאים בצינור זה, שכן חתימת הקרינה של אשכול זה תגדיר הפפטיד הזה (כמו בטבלה 1 לדוגמא).
      4. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. שטיפת תא
      1. הוסף 5 מיליליטר של קרח קר (4 ° C) RPMI FCS המכיל 5% עד ההשעיה התא ותאי resuspend ידי היפוך צינור. בזהירות ביסוד ההשעיה התא עם 3 מיליליטר של קרח קר (4 ° C) FCS.
      2. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C. השתמש בהאצה ובלימה איטיות כדי להבטיח את הממשק של FCS ונשמר פתרון ההשעיה תא.
      3. בזהירות לשאוב את RPMI ולאחר מכןFCS עם טפטפת העברה, עוזב את כדורי תא נשטפו באין מפריע. שים לב: השימוש ביסוד FCS לשטוף תאים מסייע להבטיח כמה שפתרון פפטיד הוא להסיר את התאים ככל האפשר ובכך מגביל את החשיפה של אוכלוסיות תאים לפפטידים חופשיים מרובים כאשר תאים הם אספו.
      4. שטוף תאים שוב: Resuspend כדורי התא ב10 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס RPMI FCS המכיל 5%. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C. יוצקים את supernatants.
      5. בריכת כל אוכלוסיות התאים יחד לצינור אחד עם טפטפת באמצעות 6 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס RPMI FCS המכיל 5%. משקעים ונקווה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C. לשאוב את supernatant עם טפטפת העברה.
  6. תיוג תא CPD
    הערה: בשלב זה יכול להיות שנוצר שישה משכפל assay התוך ידי תאים פעמו פפטיד תיוג עם 6 ריכוזים שונים של CPD.
    1. הוספת 11.4 מיליליטר של 20 ° CRPMI FCS המכיל 5% לגלולה נקוותה סלולרי ו resuspend באמצעות פיפטה ביסודיות.
    2. הוספת 1.9 מיליליטר של השעיה תא 6, 10 מיליליטר צינורות שכותרתו AF, נזהרת שלא להרטיב את המחצית העליונה של החצוצרות.
    3. תווית תאים עם CPD, להסיר את כובע הצינור ולהניח את הצינור בצורה אופקית.
    4. הוספת 92 μl של PBS לחלק הלא הרטוב בחלקו העליון של הצינור, וזה מוסיף CPD מניות (ראה טבלה 4 לכמות של פתרון מניות שהוקצתה לכל צינור).
    5. שווי הצינור ולערבב את ההשעיה התא עם הצבע במהירות וביסודיות על ידי vortexing.
    6. . האם צעדי 2.6.3-2.6.5 עבור מניית הפתרונות של CPD בצינורות המיועדים המתוארים בטבלה 4 הערה: שלא כמו CFSE וCTV, ריכוז תיוג CPD הוא לא בדיוק ליניארי הקשורים לעוצמת הקרינה כתוצאה של תאים שכותרתו, ו כך ריכוז התיוג נעשה שימוש כדי להשיג פסגות ניאון במרחק שווה מכמה אוכלוסיות שכותרתו היהנקבע באופן אמפירי (ראה טבלה 4).
    7. דגירה תאים למשך התקופה מינימאלית של 5 דקות ב RT (20 מעלות צלזיוס).
    8. שטוף תאים פעמיים: תאי Resuspend ל10 מיליליטר עם 20 ° C RPMI FCS המכיל 5%. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 20 ° C. לשאוב את supernatant עם טפטפת העברה. חזור על פעולה.
    9. בריכה כל התאים יחד לתוך צינור יחיד באמצעות 8 מיליליטר 4 RPMI C ° FCS המכיל 5% עם טפטפת. משקעים ונקווה תאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 4 ° C ולשאוב את supernatant עם טפטפת העברה.
  7. תיוג תא (אופציונאלי) PKH-26
    הערה: אם FTAs ​​לא ניתן לבנות עם תאים המבטאים את הבדל allotypic CD45 לארח עכברים, הם יכולים להיות מתויגים עם PKH-26 לאפשר האפליה שלהם מתאי נמען.
    1. הוספת 2.9 מיליליטר של 20 ° C PBS לתא גלולה ונקווה ו resuspend ביסודיות עם טפטפת.
    2. הוסף השעיה תא לשוםn רטוב 10 צינור מיליליטר, נזהר שלא להרטיב את החלק העליון של הצינור.
    3. הסר את מכסה השפופרת ולהניח את הצינור בצורה אופקית.
    4. הוספת 58 μl של C diluent (בערכת הצבע PKH-26) לחלק הלא הרטוב בחלקו העליון של הצינור, וזה מוסיף 42 μl של מניית 1 מ"מ PKH-26.
    5. שווי הצינור ומערבבים פתרון תא עם הצבע באופן יסודי על ידי vortexing.
    6. דגירה תאים למשך התקופה מינימאלית של 10 דקות ב RT (20 מעלות צלזיוס).
    7. שטוף תאים פעמיים: תאי Resuspend ל10 מיליליטר עם 20 ° C RPMI FCS המכיל 5%. משקעי התאים על ידי צנטריפוגה XG 300 10 דקות ב 20 ° C. לשאוב את supernatant עם טפטפת העברה. חזור על פעולה.
  8. הזרקת FTAs ​​לבעלי חיים מארח
    הערה: כדי למדוד את תגובות תא T in vivo, FTAs מוזרקים לתוך בעלי חיים שיש להם תגובה חיסונית פעילה והשאירו באתר עד 24 שעה. זה קריטי, כי FTAs ​​גם מוזרקים לתוך בעלי חיים תמימים כביקורת שלילית.
    1. רוזן ו resuspend תאים ב2.5 x 10 8 תאים למ"ל ב-PBS. הזרק 200 μl של תאים דרך הווריד לעכברים מארח, לרבות בעלי חיים תמימים כביקורת.

3. Cytometry הזרימה

  1. 18-24 שעות לאחר הזרקת דם FTA קציר או טחול (או רקמות אחרות של עניין) מעכברים מארחים.
  2. הכן את ההשעיה תא בודדת מרקמות על ידי רסוק דרך 70 מיקרומטר התעמק מסננת עם בוכנת מזרק 5 מיליליטר.
  3. Resuspend תאים במהירות של עד 65 x 10 6 תאים / מיליליטר PBS המכיל BSA .0.1%.
  4. לוותר 100 aliquots μl של השעיה תא לתוך בארות של צלחת microtitre לתיוג נוגדן.
  5. תאי תווית עם נוגדני fluorochrome כותרת ובדיקות כדאיות ניאון עם הקרינה ספקטרלית תואמת לCFSE, CTV ועלות לכל היום. הערה: נוגדנים ל-B סמני תא כגון B220 וסמני הפעלה כגון CD69 חיוניים למדוד הפעלת תא B אם באמצעות FTכדי למדוד את תגובות תא T H 2. כולל נוגדן לCD45.1 ו / או CD45.2 אם יש לי FTAs ​​ועכברי מארח הבדל allotypic CD45.
  6. הוספה של פתרון 2x המניה של צבעי נוגדנים / כדאיות 100 μl (PBS המכיל BSA 0.1%) ל100 aliquots μl של תאים, ומערבב היטב ולדגור על קרח (4 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות.
  7. שטוף תאים: תאי משקעים ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר supernatant. Resuspend תאים ב200 μl של PBS המכיל BSA 0.1%, תאי משקעים ידי צנטריפוגה XG 300 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר supernatant.
  8. תאי resuspend בהיקף כולל של 400 μl של PBS המכיל BSA 0.1%, תאי סינון דרך רשת 70 מיקרומטר ולנתח ידי cytometry זרימה בזרימה cytometer מסוגל לאתר צבעי ניאון הרלוונטיים וconjugates. לאסוף עד 3 x 10 6 אירועי הלימפוציטים על מנת לפתור כל אשכול תא FTA ולהשיג מספיק תאים לstatistiניתוח קאל. הערה: ודא כי כל הפקדים הטיפוסיים (כגון פקדים צבעוניים יחיד) עבור cytometry זרימה הם מועסקים. בדרך כלל, CFSE דורש עירור ממקור כחול לייזר (בדרך כלל ב488 ננומטר) וזיהוי עם מסננים לעבור להקה במרכז מעל 520 ננומטר; CTV דורש עירור ממקור סגול לייזר (בדרך כלל ב405 ננומטר) וזיהוי עם מסננים לעבור להקה במרכז מעל 450 ננומטר; וCPD דורש עירור ממקור לייזר אדום (ננומטר בדרך כלל ב633 או 640 ננומטר) וזיהוי עם מסננים לעבור להקה במרכז מעל 670 ננומטר.

4. ניתוח נתונים

  1. ניתוח cytometry זרימת הנתונים באמצעות תוכנת cytometry הזרימה סטנדרטית (ראה תוצאת נציג לדוגמא לסוג של אסטרטגית gating המועסק).
  2. ל% הרג ספציפי, לחשב את מספר התאים בכל אשכול תא FTA פעמו עם פפטידים אני מחייב ברמה MHC ואשכולות FTA שלא פעמו פפטיד ("אפס") ושימוש בנוסחה הבאה לחישוב% הריגה ספציפית.
    % הריגה ספציפית figure-protocol-1
    הערה: בנוסחא לעיל "דרוכה" מתייחסת למטרות מבעלי חיים שהם חשבו שיש תגובה חיסונית נגד פפטידים היעד, "נאיביים" מתייחס למטרות מבעלי חיים תמימים, "פפטיד" מתייחס למטרות פעמו עם פפטידים ו" אפסי " מתייחס למטרות לא פעמו עם כל פפטידים.
  3. להפעלת תא B כמדד לפעילות H T, לחשב את עוצמת הקרינה הממוצעת הגיאומטרית (GMFI) של הקרינה נוגדן CD69 על FTA תאי B פעמו עם פפטידים MHC ברמה השנייה מחייבים בבעלי חיים "דרוכים" ומתוך זה להחסיר GMFI של ביטוי CD69 על תאי B FTA המקבילים בבעלי חיים "נאיביים" לתת מידה של פעילות H T.
  4. מהסטטיסטיקה שנוצרה בשלבי 4.2 ו4.3, שימושניתן למצוא את תוכנת גיליון אלקטרוני מתמטית כגון GraphPad פריזמה לחישוב פרמטרים כמותיים ואיכותיים אחרים, כגון אזור תחת עקומה ו50 EC (בעומק תיאור של איך חישובים אלה מבוצעים עבור AUC ב
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, ולEC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדוגמא לשימוש של assay FTA, עכבר BALB / ג היה חוסן בנגיף רקומביננטי vaccinia (VV) להביע HIV-אני אפיטופים (VV-HIV) ותגובות לאפיטופים HIV-CTL, Gag, mut איסור הפרסום, Env ופול, VV CTL אפיטופים F2L וmut F2L, וepitope HIV-T H התא, Gag ה (כפי שמתואר ב2) הוערכו באמצעות assay FTA 252 פרמטר (איור 1). גרסאות Epitope של Gag (mut איסור פרסום) וF2L (mut F2L) אינן באות לידי ביטוי בוקטור VV-HIV ולכן תגובות נגד אפיטופים אלה הן שיקוף של תגובות תא T תגובתי צלב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

היתרון של מבחני מבוססי FTA הוא שהם מאפשרים אפליה מ> 250 אוכלוסיות תאי יעד קיימא ומתפקד באופן מלא מבעלי חי מארח אחד על ידי cytometry זרימה. זה מספק רמת המורכבות לin vivo מבחני מבוססים cytometry זרימה שלא היו אפשרי בעבר. זה מודגש בניסויים בבעלי החיים 2 הראו לעיל, שבו תגובות ל7 אפיטופים נגיפיים מובחנים בשעה 6 בריכוזים יכולים להיות במעקב במשכפל של 6 בו זמנית בחיה אחת המאפשרת פרמטרים כגון AUC ו50 EC שייקבעו לתגובות תא T in vivo .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענקים # 1010395 (CP BQ ו) ו# 525,431 (CR), ותכנית # גרנט 455,395 (CP) מהמועצה למחקר הבריאות והרפואה הלאומית של אוסטרליה, מרכז אוסטרלי לצהבת והאיידס וירולוגיה EOI 2012 מענק (CR וRJJ) ומענק מטעם קרן גורדון וגרטל רועת הדובים (BQ ו CR). ברצוננו להודות Harpreet Vohra ומיכאל Devoy לתחזוקה שלהם המעולה של המעבדה JCSMR FACS, המתקן האוסטרלי לחקר סרטן קרן Biomolecular המשאבים, JCSMR, ANU, לסינתזת פפטיד, וד"ר דוד בויל, מעבדות CSIRO לבריאות בעלי חיים, ילונג, אוסטרליה למתן מניות חיסון הורה ה-HIV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RPMISigmaR8758
סרום עגל עובריSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 סגול מבריק 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
צנטריפוגהאפנדורף
(Fortessa או שווה ערך עם מקור לייזר כחול, אדום וסגול)BD Bioscience
ציטומטר זרימה

מקורות

  1. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
  2. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
  3. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
  4. Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
  5. Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
  6. Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
  7. Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
  8. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
  9. Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
  10. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
  11. Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
  13. Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
  14. Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
  15. Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
  16. Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
  17. von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
  18. Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
  19. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  20. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
  21. Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MHCCellTrace VioletCFSECPDIn vivo
השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.