פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

סיכום

דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV).

תקציר

נגיף אבעבועות רוח זוסטר (VZV) הוא גורם משמעותי לתחלואה ותמותה לאחר השתלת דם טבורי (UCBT). מסיבה זו, טיפול מונע antiherpetic מנוהל באופן שיטתי לנמעני UCBT ילדים כדי למנוע סיבוכים הקשורים לזיהום VZV, אבל אין הסכמה שמגדירה את משך הזמן האופטימלי שלו חזקה, המבוסס על ראיות. בגלל חסינות תא בתיווך T היא אחראית על הבקרה של זיהום VZV, הערכה מחדש של תגובות תא T הספציפיות VZV הבא UCBT יכול לספק אינדיקציות באשר לשאלה האם יש לשמור טיפול מונע או יכול להיות שהופסק. לשם כך, assay אינטרפרון גמא הספציפי VZV (IFN-γ) Immunospot צמוד אנזים (ELISPOT) פותח כדי לאפיין ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים מסוג T בתגובה לגירוי במבחנה עם חיסון VZV מוקרן חי מוחלש. assay זה מספק מדידה מהירה, לשחזור ורגישה של ג הספציפי VZVell תיווך חסינות מתאימה לניטור הכינון מחדש של חסינות ספציפית VZV בסביבה קלינית והערכת תגובה חיסונית לאנטיגנים VZV.

מבוא

בוצע לראשונה בשנת 1989, UCBT משמש יותר ויותר כחלק מהטיפול בהפרעות דם neoplastic וnonneoplastic שונות בילדים ^1. VZV הוא alphaherpesvirus אדם cytopathic אשר גורם לשתי מחלות שונות, אבעבועות רוח (לאחר הדבקה ראשונית) והרפס זוסטר (לאחר הפעלה מחדש). בעקבות זיהום ראשוני, VZV נמשך לאורך כל חייו של המארח המוגן בתוך עצבי תחושה של גרעיני שורש הגבי. אחד הסיבוכים זיהומיות המאיימים ביותר הבאים UCBT קשור VZV ^2-4. במרכז הקליני שלנו, בהעדר טיפול מונע VZV, ההיארעות המצטברת של מחלת VZV מחלה VZV לאחר 3 שנות postUCBT הייתה 46% ^2. בחולים אלה, דה זיהום נובו עם או הפעלתו מחדש של VZV קשור לעתים קרובות עם הפצה קרביים למערכת העצבים המרכזית, ריאות וכבד ^5-7. כטיפול מונע תוצאה מכך, acyclovir, valacyclovir או famciclovir מנוהל בדרך כלל UBמקבלי CT ^8,9. עם זאת, אסטרטגיית טיפול זו אינה מביאה בחשבון את הפוטנציאל ההגנתי של לימפוציטים מסוג T או VZV ספציפי קינטיקה של הכינון מחדש של תגובות תא T הספציפיות VZV. בעיות פוטנציאליות הקשורים לשימוש המתרחב של טיפול מונע antiherpetic לטווח ארוך כוללות טיפול יתר) מטופל; ב) ההתפתחות של עמידות לתרופות אנטי ^10,11; וג) ירידת ערך הכינון מחדש חיסוניים הספציפי VZV ^12,13. בגלל זיהוי של לימפוציטים מסוג T הפונקציונלי VZV הספציפי בקורלציה עם הנוכחות של הגנה לטווח ארוך מפני זיהום VZV ותוצאה קלינית משופר ^4,14,15, ניטור תגובות חיסוניים תא בתיווך המכוון נגד VZV במהלך התקופה לאחר ההשתלה עלול לגרום לשימוש מושכל יותר של נגיפים טיפול על ידי המאפשר רופאים כדי להבחין בין חולים שיפיקו תועלת מהטיפול מונע VZV מאלו שמערכת החיסון מסוגל לשלוט שכפול VZV ^4,13.

Assay ELISPOT γ-IFN נעשה שימוש נרחב לתגובות החיסונית בתיווך תא ניטור במגוון רחב של מערכות ניסיוניות ומצבים רפואיים. כתמים נוצרים בעקבות המחשוף של מצע chromogenic, שהניבו משקע נראה לעין ויציב באתר של התגובה. כל נקודה בודדת ובכך מייצגת את טביעת הרגל של תא לייצור ציטוקינים בודד. IFN-γ ELISPOT מודד לא רק את היכולת של תאים בודדים vivo לשעבר לייצר IFN-γ בתגובה לגירוי במבחנה עם אנטיגן מאותו המקור, אבל זה גם מספק הערכה של התדירות מגיב תאים באוכלוסיית תא נתון ^16,17. בנוסף לרגישות הגבוהה שלו, IFN-γ ELISPOT הוא פשוט לביצוע, מה שהופך את השימוש בו אפשרי בהקשר של פרוטוקולים קליניים אישית שמטרה מנחה ייזום או הפסקה של טיפול אנטי. המפורטים להלן ההליך describes assay ELISPOT כי היא תוכננה במיוחד כדי לזהות ולמדוד את ייצור IFN-γ על ידי תאי הדם היקפיים mononuclear בעקבות גירוי במבחנה עם אנטיגנים VZV נגזרים.

פרוטוקול

פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי מועצת המנהלים המוסדית אתיקה סקירה של CHU Sainte-ג'סטין, מונטריאול, קוויבק, קנדה, שבה נערך המחקר. הסכמה מדעת שבקשה וקיבלה מכל משתתפי המחקר, הוריהם או אפוטרופוסים חוקיים. כל ההליכים שבוצעו בימים 1 ו 2 חייבת להתבצע בתנאים סטריליים (כלומר תחת הזרימה למינרית). נהלי בטיחות סטנדרטיים לטיפול בדם אדם צריכים להקפיד.

1. ציפוי צלחות

1. Permeabilize difluoride polyvinylidene קרומים (PVDF) בחלק התחתון של 96 גם צלחות ELISPOT הלבן Multiscreen IP על ידי הוספה היטב כל אחד 20 μl של 35% אתנול דקות 1. ממברנות צריכה להיות מעט שקופות.
2. מייד לשטוף את הבארות 3 פעמים עם 200 μl של בופר פוספט 1x (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na ₂ HPO _4, 2 מ"מ KH ₂ PO _4, pH 7.4) באמצעות מולtichannel פיפטה או מכשיר דומה. שלב זה הוא קריטי בהתחשב בכך ששאריות אתנול יכולות להשפיע על כדאיות תא והקשירה של נוגדן ללכוד. צלחות ELISPOT הן שבירות וצריכים להיות מטופל בזהירות: השימוש במכונת כביסה צלחת אוטומטית אינו מומלצת.
3. מעיל הבארות עם 10 μl של נוגדן ללכוד IFN-γ אנטי אנושי בעכבר מטוהר בדילול מלא ב1x PBS לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר. כסה את הצלחות עם ניילון נצמד רגיל ודגירת הלילה בשעה 4 ° C.

2. חסימת צלחות

1. רוקן את הבארות, הקשה עליהם יבשים, ולשטוף צלחות 5 פעמים עם 200 μl של 1x PBS.
2. מלא את הבארות עם 200 μl של מדיום RPMI 1640 מלא ודגירת צלחות לשעה 2 ב 37 ° C (חסימת צעד).
3. שטוף את צלחות 5x עם 200 μl של 1x PBS ולשמור על הבארות מלאה של 1x PBS עד תאים מוכנים להיות מצופה.

3. נייד ציפוי וגירוי

1. הכן pתאי eripheral מונונוקלארים דם (PBMC) מדגימות דם ורידי אדם על ידי צנטריפוגה במילויי Ficoll-Paque באמצעות נהלים סטנדרטיים. לחלופין, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות, להפשיר aliquots של PBMC קפוא תחת חנקן נוזלי. לאחר צנטריפוגה, תאי resuspend האחרונים בריכוז סופי של 2 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר ו דגירה הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO ₂ באטמוספרת חממת מעיל מים.
2. הסר PBMC מן החממה וresuspend אותם בנפח סופי של 5 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 מלא.
3. דגירה PBMC בנוכחות 10 μl של endonuclease מהונדסת גנטי מmarcescens Serratia במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
4. הסרת aliquot 50 μl של PBMC ולערבב עם 50 μl של צבע הכחול trypan. ספירת תאים ולהעריך את הכדאיות% באמצעות haemocytometer ובדיקה מיקרוסקופית (שיטת הדרת צבע). שיטות אוטומטיות שונות לספירת תאים והערכה של אל פחית כדאיות תאכך לשמש. PBMC צריך להיות> 95% קיימא. בטל מדגם כאשר הכדאיות נמוכה מ95%.
5. צנטריפוגה PBMC ב700 XG במשך 5 דקות, supernatant קלפים שנזרקו, ותאי resuspend במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) בסרום מומת אנושי (שלו) בריכוז סופי של 2 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר. שמור על 37 ° C עד תערובות גירוי נוספות לצלחת.
6. הוסף לבארות, טיפה אחת בכל פעם, מתערובת הגירוי המתאימה 100 μl. יש להשתמש בשלוש תערובות גירוי כמפורט להלן:
   1. בינוני השימוש AIM-V בתוספת 2% (v / v) בסרום מומת אנושי (IHS) שליטה שלילית.
   2. השתמש בנוגדן אנטי CD3 חד שבטי (OKT3 שיבוט) בדילול מלא במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר שליטה חיובית).
   3. השתמש אנטיגן VZV, בצורה של שני מוקרן γ (10,000 Gy; זמן חשיפת 30 דקות) לחיות חיסון VZV מוחלש (יחידות 1,350 פלאק ויוצרים [PFU] / מיליליטר) diluטד 1:200 במדיום AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS) או 1 מיקרוגרם של תערובת equimolar של 67 פפטידים (15 שאריות חומצת אמינו) המסונתזת המבוסס על הרצף של VZV מייד מוקדם (phosphoprotein IE63) . לשלוט ביעילות על ידי ניטור קרינת העדר סימנים גלויים של תופעות cytopathic לאחר 4 ימים בתרבויות PBMC.
   4. הכן את כל הבארות בשני עותקים.
7. הוסף לבארות, טיפה אחת בכל פעם, של תאים מוכנים בשלב 5.4 לבארות המתאימות 100 μl. יש להשאיר שתי בארות ללא תאים (בקרה שלילית). דגירה של 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO ₂ באטמוספרת חממת מעיל מים. אין לטלטל, להעביר, או ערימת הצלחות על גבי זו במהלך דגירה.

4. ספוט פיתוח ואיתור

1. מחק את התאים ולשטוף את הצלחות 10x עם 1x PBS בתוספת 0.05% (v / v) Tween 20 (PBST). Tween 20 מסייע לנתק את התאים שדבקו PVDFmbrane הבא דגירה הלילה.
2. בעזרת פיפטה רבה, להוסיף 0.5 מ"ג 100 μl / מיליליטר ביוטין מצומדות נוגדן חד שבטי אנטי IFN-γ (שיבוט 4S.B3) בדילול מלא ב1x PBS המכיל 0.5% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA). דגירה צלחות במשך שעה 2 בטמפרטורת חדר.
3. לשטוף את הבארות 6x עם PBST ולהוסיף גם כל conjugatd streptavidin 100 μl עם phosphatase אלקליין בדילול 1:1,000 ב 1x PBS המכיל 0.5% (w / v) ארגון ה-BSA. כסה את הצלחות ודגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
4. שטוף את הצלחות 3x עם PBST ו3x עם 1x PBS. הוספה של פוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl (BCIP) / פתרון מצע כלוריד tetrazolium הכחול (NBT) ניטרו 100 μl ודגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר.
5. שטוף את הצלחות תחת זרם מים מזוקקים. הסר את החלק התחתון של צלחת ELISPOT ולשטוף את שני הצדדים של הקרום במים מזוקקים. אוויר יבש הצלחות.
6. לבחון את הבארות ולמנות את הכתמים באמצעות ד סטריאוסקופיתמיקרוסקופ issection או לסרוק את הצלחות באמצעות דלפק מקום אוטומטי. שמור על הצלחות במרחק של אור אם הם לא יכולים להיבחן באותו היום.
   1. ממוצע המספרים של כתמים נספרו בבארות כפולות מקבילה ולהחסיר את מספר הנקודות נספרו בבארות בקרה השליליות (אין תאים) ממספר הנקודות נספרו בבארות הבדיקה.
   2. להביע את ייצור IFN-γ כמו מספר היחידות להרכיב-spot (אוניברסיטת סן פרנסיסקו) לכל 10 ⁶ PBMC.
   3. קח בחשבון שדגימות הבדיקה הן חיוביות, אם המספר של אוניברסיטת סן פרנסיסקו הוא> 50 ל10 PBMC ⁶ ו 2 סטיות תקן (SD) שמעל לפקד השלילי (בינוני + תאי AIM-V בתוספת 2% (v / v) IHS).
   4. השתמש בשווי של 400 אוניברסיטה סן פרנסיסקו לכל גם כאשר כתמים רבים מכדי לספור.
7. בדוק אם נתוני ELISPOT מופצים בדרך כלל או לא באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב. כאשר נתונים בדרך כלל מופצים, לבצע השוואות סטטיסטיות באמצעות tes t של הסטודנטלא (2 קבוצות) או ניתוח שונה ולאחר בדיקת Bonferroni (השוואות מרובות). אם הנתונים אינם מתפלגים נורמלי, להשתמש במבחן מאן ויטני U (2 קבוצות) או במבחן קרוסקל-ארהב ולאחר המבחן של דאן (השוואות מרובות).

תוצאות

פרוטוקול ELISPOT γ-IFN שפורט לעיל פותח ומותאם במעבדה שלנו כדי למדוד את הגודל והאיכות של תגובות תא בתיווך חיסונית המכוונות נגד VZV ^4. מקורות שונים של אנטיגן VZV יכולים לשמש לשלב הגירוי. אלה כוללים: א) תמציות מומתים חומר ניקוי זמין מסחרי מVZV נגועים תאי Vero ^18; ב) בריכות חופפות פפטידים סינטטיים מחלבונים ספציפיים VZV מקודד, כולל ¹⁵ IE63 וORF4 ^19; ג) חי חיסון אבעבועות רוח זוסטר מוחלש ^20; וד) הכנות מומתים UV של VZV אנטיגנים מsuper...

דיון

שינויים ופתרון בעיות: מבחני IFN-γ ELISPOT שימשו כדי לבחון תגובות חיסונית בתיווך תא המכוון נגד מגוון רחב של חיידקים פתוגנים, כוללים סוג וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV-1) ^24,25, וירוס הפטיטיס C (HCV) ^{26, 27,} ושחפת Mycobacterium ^28,29, רק כדי שם כמה. כאן אנו תיארתי את ההתפתחות של assay ELISPOT γ-IFN למדוד חסינות תאית נגד, עם התקווה של הגדרת קושרת של הכינון מחדש חיסוניים ספציפי VZV במתאושש מקבלי UCBT ילדים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שפופרת לויקוספ	VWR	89048-936/89048-932	ניתן להשתמש בשפופרות של 12 מ"ל או 50 מ"ל בהתאם לנפח הדם.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	הגן מפני אור.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	שמור על -20 °C.
MultiScreenHTS-IP צלחת סינון	Millipore	MSIPS4W10	סטרילי עם גודל נקבוביות של 0.45 µm.
עכבר אנטי-אנושי IFN-γ לכידת נוגדנים	BD Biosciences	551221	שיבוט NIB42.
פפמיקס VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	ממיסים את התוכן של בקבוקון אחד ב-40 μ l של DMSO. יש להשתמש תוך 6 חודשים.
נוגדן חד-שבטי מצומד לביוטין BD	Biosciences	554550	שיבוט 4SB3.
סטרפטווידין מצומד עם פוספטאז אלקליין	Bio-Rad Life Science	170-3554	יש לדלל לשימוש באותו היום.
BCIP/NBT	Bio-Rad מדעי החיים	170-6432	יש להגן מפני אור.