אנו מתארים כאן את השיטה של הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית סיבית (FCFM), המספקת מצב חדשני להבנת תופעות פיזיולוגיות ברמה התאית והתת-תאית בנבדקים בבעלי חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
סוגים מסוימים של כימותרפיה עלולים להפעיל שינויים בכלי הדם חריפים שעלולות להתקדם לתנאים לטווח ארוך החושף את החולה לסיכון מוגבר לתחלואת לב וכלי דם. ובכל זאת, אם כי הראיות קליניות ההרכבה, יש מיעוט מחקרים ברורים של רעילות של כלי דם, ולכן אטיולוגיה של קבוצה הטרוגנית של הפרעות לב וכלי דם לב וכלי דם / עדיין לא הובהר. יתר על כן, המנגנון שעשוי בבסיס רעילות של כלי דם יכול לגמרי שונה מהעקרונות של רעילות לבבית בעקבות כימותרפיה, אשר קשורה לכוון פציעת myocyte. הקמנו בזמן אמת, בפלטפורמת הדמיה המולקולרית vivo כדי להעריך את הרעילות של כלי דם אקוטי הפוטנציאל של טיפולים אנטי-סרטניים.
הקמנו פלטפורמה של in vivo, הדמיה מולקולרית ברזולוציה גבוהה בעכברים, מתאים להדמית כלי דם בתוך איברים מוגבלים וblo ההתייחסותכלי od בתוך אותו האנשים ואילו כל אדם לשמש כשליטה שלו. דפנות כלי דם היו לקויים לאחר מתן דוקסורוביצין, המייצגות את מנגנון ייחודי של רעילות של כלי דם שעשוי להיות האירוע המוקדם לפגיעה באיברי המטרה. במסמך זה, בשיטה של ההדמיה confocal fibered מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FCFM) המבוססת מתוארת, המספק מצב חדשני להבין תופעות פיסיולוגיות ברמה התאית ותת-תאית בנושאי בעלי חיים.
מבוא
עדויות קליניות מצביעות על כך שכמה כיתות של כימותרפיה לעורר מגוון רחב של פתולוגיות כלי דם המתבטאות בתופעת Raynaud, יתר לחץ דם, myocardialinfarction, התקפת כלי דם במוח, וVeno-occlusivedisease הכבד 1,2. "תרופות אנטי angiogenic 'בשוגג'" הוא מונח חדש יחסית, המתאר תרופות כימותרפיות קונבנציונליות הפועלות כמעכבי אנגיוגנזה אפשריים, למרות שהם לא פותחו במקור למטרה זו 3-5 אבל שנועדו לחסל את התאים סרטניים על ידי הטלת קטנה כמו "בטחונות נזק "לתאים נורמלים כמו 3 אפשריים. כמה טיפולי הכימותרפיה כבר משתמעים כvasculo-רעלים כפי שנצפו במחקרים קליניים באמצעות סמנים ביולוגיים בסרום. בין אלה אלקילציה סוכנים (כגון cyclophosphamide), תרכובות פלטינה (כגון ציספלטין) וanthracyclines 1,2,5-7.
סיבוכי לב וכלי דם חריפים עלולים להתרחש כresult של רעילות של כלי דם הנגרמת על ידי כימותרפיה. הם עלולים להתקדם למצבים כרוניים כמו טרשת עורקים וחשבון לעלייה בסיכון לתחלואת לב וכלי דם מאוחר. ובכל זאת, למרות ההרכבה ראיות קליניות, יש מיעוט מחקרים המיועדים תוך שימת דגש על המנגנון של רעילות של כלי דם, ולכן, דורש הבהרה נוספת של הפתוגנזה המדויקת שהם גורמים היא מוצדקת.
אתגר גדול בחושפים את המנגנון של רעילות של כלי דם בעקבות כימותרפיה נובע ממורכבות חקירת תפקוד כלי דם in vivo. אנו מתארים זאת פלטפורמה של רזולוציה גבוהה בהדמיה מולקולרית vivo בעכברים המאפשרת ללכוד את זרימת דם ואת המאפיינים של כלי. פלטפורמה זו מאפשרת זיהוי של תופעות של כלי דם הנוצר על-טיפול ישירים: בזמן אמת, כמו גם הקפדה עליהן על פני תקופה של זמן בתוך אותו האנשים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הצהרת אתיקה: כל הניסויים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. טיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות מוסדיות. עכברי ICR נקבה (7-8 שבועות; 25 - 30 גר ') שוכנו בממוזג, מתקני בעלי חיים אור מבוקר של הפקולטה לרפואה ע"ש סאקלר באוניברסיטת תל-אביב. בטווח, חיות היו מורדמים עם מנת יתר של חומרי הרדמה.
1. Fibred Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי כיול (FCFM)
- להפעיל את המכשיר.
- חבר את microprobe (mini0 / 30).
- לכייל את המכשיר בהתאם להוראות יצרן.
2. עכברים הכנת הדמיה
- להרדים על ידי הזרקה תת עורית של שני Ketaset (100 מ"ג / קילוגרם) וXYL-M2 (6 מ"ג / קילוגרם). לאשר הרדמה תקינה על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
- לחתוך את העור מתחת למפשעה כדי לחשוף את כלי דם הירך. שמור את אתר החתך לח עם מי מלח הבא חתך.
- מחממים את הזנב על ידי שימוש בשקית (או כפפה) מלאים במים חמים (לא חם מדי לגעת) למשך כ -30 שניות. הכן (IV) מחלף תוך ורידי לממשל של dextran FITC (חומר ניגוד) ושל שני מלוחים או סוכן כימותרפיות, על ידי החדרת מחט (30 G, 1/2 אינץ ') לוריד הזנב והצמדת מזרק 1 מ"ל לזה . להבטיח את הווריד פתוח על ידי הזרקת תמיסת מלח.
הערה: ממשל IV של dextran FITC (משקל מולקולרי גבוה; 100 μl; 10 מ"ג / מיליליטר; 2,000 KDA) מקל לדמיין את נימי דם הירך על ידי FCFM. דוקסורוביצין (100 μl; 8 מ"ג / קילוגרם, אדריאמיצין) או מלוח גם להינתן IV לוריד הזנב המחומם מראש מאוחר יותר. - מקם את עכבר supinely על במה קלקר. לאבטח את העכבר למשטח ולשמור על מעמדה באמצעות סרט דביק כירורגי.
הערה: מיקרוסקופ confocal fibered שימש במחקר זה מורכב משתי יחידות: (1) microprobe (mini0 / 30). (; אורך גל nm 488 LSU-488) יחידת סריקת לייזר (2).
- לבצע את כל זמן הקפות ניתוחים באמצעות הלייזר באורך גל nm 488 LSU.
הערה: גלאי היחידה הראשיים מזהה מסוננת - הקרינה (500 650 ננומטר) הנפלטת. התמונות שנרכשו משוחזרות לאחר מכן ומוצגות בשיעור של 12 מסגרות / sec. - נתק בקפידה את המזרק מהמחט ולצרף מזרק חדש המכיל dextran FITC. לנהל של dextran FITC (IV) 100 μl.
- Shift microprobe (mini0 / 30) לשדה מתאים של תצוגה ולקבע אותו, לאחר ההתאמה לZ- הציר, על מנת לקבל את התמונה המקבילה. מחכה לסימן הראשוני לדעוך עד איתות ברורה וממוקדת הוא Visible.
- להקליט את זרימת דם בנקודת ההתחלה לתקופה קצרה ייצוב (~ 30 שניות). לאחר מכן חבר למחט מזרק נוסף, המכיל גם דוקסורוביצין או מלוח. IV לנהל דוקסורוביצין μl 100 או מלוח.
- לפקח על זרימת FITC-dextran מוזרק ברציפות במשך 20 דקות. על התוכנה הקשורים FCFM, להשתמש בלחצן הקוטר על הסרגל העליון כדי למדוד את כלי הדם ולקטלג אותם כקטן (<15 מיקרומטר) או גדול (> 15 מיקרומטר).
- להרדים את החיה עם מנת יתר של חומרי הרדמה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בהדמיה רציפה vivo בזמן אמת
מנגנון ההדמיה משמש כאן הוא בחדות גבוהה, מיקרוסקופ confocal fibered, מצוידת בבדיקה המאפשרת הדמיה של כלי דם ותגובתה לגירויים שונים כמו כימותרפיה. שיטה זו היא פולשנית מאז למרות שהיא עשויה להקל על הדמיה של כלי איבר או עמוקים, זה דורש חתך קטן לבדיקה. חבילות הבדיקה מורכבות מעשרות אלפי סיבים, אופטיקה מיקרוסקופ ומחבר דיוק קניינית. ייצוג סכמטי מוצג באיור 1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הערכת רעילות של כלי דם בעקבות כימותרפיה היא מאתגרת בשל הקושי בלדמיין את הדינמיקה של כלי דם בתגובה לגירויים בזמן אמת. מחקרים קליניים רבים שמעורבים שכמה טיפולי הכימותרפיה לגרום לפגיעה בכלי הדם ישירה, עדיין המנגנון והמאפיינים של רעילות זה עדיין לא הובהרו. הקמנו בזמן אמת, בפלטפורמת הדמיה המולקולרית vivo להערכת הרעילות של כלי דם הפוטנציאל של כימותרפיה בעכברים הכוללים מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal fibered כפי שתואר כאן 8-10. הדמיה מולקולרית זה ברזולוציה גבו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| הרדמה כללית | Fort Dodge Animal Health, IA, ארה"ב ומעבדות Biove, צרפת | 100 מ"ג/ק"ג קטסט ו-6 מ"ג/ק"ג XYL-M2 | |
| קרם אפילציה (Veet) | ReckittBenckiser, בריסטול, בריטניה | ||
| 30 גרם, מחט 1/2 אינץ' מחוברת למזרק | |||
| FITC דקסטרן (10 מ"ג/מ"ל; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μ l נפח |
| דוקסורוביצין | טבע, ישראל | 8 מ"ג/ק"ג, אדריאמיצין | |
| פקליטקסל | תרו, ישראל | 1.2 מ"ג/ק"ג, תמיסת | |
מקורות
- Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).
- Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).
- Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).
- Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).
- Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).
- Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).
- Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8 (9), e7515(2013).
- Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).
- Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6 (9), e23492(2011).
- Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).
- Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).
- Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).
- Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).
- Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
