מאמר שיטה

באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility

10.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51679

⸱

1 באוגוסט 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול כדי לזהות תאי T מסוג CD4 עצמי תגובתי במוח ולב על ידי צביעה ישירה עם הכיתה השנייה dextramers המורכב histocompatibility הגדול תואר בדוח זה. לניתוח מקיף, שיטה אמינה כדי למנות את התדרים של תאים מסוג CD4 + T אנטיגן הספציפי באתר היא גם המציאה.

תקציר

דוח זה מדגים את השימוש בדקסטרמרים מסוג II של קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרית (MHC) לזיהוי תאי CD4 T אוטו-ריאקטיביים באתרם בחלבון פרוטאוליפיד מיאלין (PLP) 139-151 המושרה על ידי דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE) בעכברי SJL ומיוזין לב כבד שרשרת α כבדה (Myhc) 334-352 הנגרמת על ידי דלקת שרשרת לב (EAM) בעכברי A/J. נעשה שימוש בשתי קבוצות של קוקטיילים של ריאגנטים דקסטרמרים, כאשר תאי דקסטרמרים + נותחו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (ספציפי)/אנטי-CD4 ו-IAs/Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (בקרה)/anti-CD4; ו-EAM, IAk/Myhc 334-352 דקסטרמרים/אנטי-CD4 ו-IAk/ריבונוקלאז בקר (RNase) 43-56 דקסטרמרים (בקרה)/אנטי-CD4. ניתוח LSCM של קטעי מוח שהתקבלו מעכברי EAE הראה נוכחות של תאים חיוביים לדקסטרמרים CD4 ו-PLP 139-151, אך לא דקסטרמרים TMEV 70-86, מה שמרמז על כך שהצביעה שהתקבלה עם דקסטרמרים PLP 139-151 הייתה ספציפית. כמו כן, חתכי לב שהוכנו מעכברי EAM חשפו גם נוכחות של Myhc 334-352, אך לא תאי RNase 43-56-dextramer+ כצפוי. יתר על כן, פותחה גם שיטה מקיפה לניתוח כמותי של התדרים של תאי CD4 T ספציפיים לאנטיגן בתמונות הסדרתיות 'Z'.

מבוא

השימוש מורכב histocompatibility הגדול (MHC) בכיתה השנייה tetramers לזיהוי של תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי כבר אתגר 1-7. כדי לשפר את רגישות זיהוי של MHC הכיתה השני tetramers, צוות המחקר יצר tetramers של הדור הבא, המיועד "dextramers" 8. Dextramers להכיל עמוד השדרה dextran בי moieties streptavidin-fluorophore המרובים מצומדת, כך שיכולים להיות מצורפים כמה, מונומרים MHC biotinylated פפטיד קשור למולקולת dextran אחד 9. לפיכך, אגרגטים גדולים של dextramers MHC שמכיל כמה מתחמי MHC-פפטיד יכולים לקיים אינטראקציה עם קולטנים מרובים תא T (TCRs).

קבוצה זו נוצרה בזמן אחרון dextramers לאנטיגנים עצמיים שונים והוכיחה כי רגישות זיהוי של dextramers הייתה כ פי חמש יותר מאשר tetramers 8. המערכות הניסיוניות כוללות Encephalomyelitis אוטואימוניות ניסיוני (EAE) מושרה עם חלבון proteolipid (PLP) 139-151 בעכברי SJL; EAE מושרה עם גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (MOG) 35-55 בC57Bl / 6 עכברים; ודלקת שריר הלב ניסויי אוטואימוניות (EAM) מושרה עם שרשרת α שרירן לב הכבד (Myhc) 334-352 בעכברים / י. מחקר זה מדגים את השימוש בPLP 139-151 - וMyhc 334-352 dextramers כדי לזהות תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי באתר עם ​​סגוליות ידי פיתוח פרוטוקול מכתים ישיר, ובכך מבטל את הצורך להגביר את האותות מבאמצעות נוגדני fluorophore, מתקרב מועסק בדרך כלל עם השימוש של tetramers. בנוסף, שיטה מקיפה של הערכת רקמות יש גם המציאה כדי למנות באופן מהימן את התדרים של תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי באתר 10. זיהוי של תאי T אנטיגן ספציפי באתר מאפשר תיחום של אירועים שנגרמו על ידי גירויי אנטיגני ספציפיים מאלה הנגרמים על ידי הפעלה עובר אורח. כמו כן, הטכניקה באתרו גם providהזדמנויות es כדי לעקוב אחר קינטיקה של חדירות תא T אנטיגן ספציפי באיברי המטרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה:

נהלי כל החיה שנערכו בהתאם להנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי אוניברסיטת נברסקה לינקולן, לינקולן, NE.

1. אינדוקציה של EAE

  1. כדי לגרום EAE, להכין תחליב פפטיד / adjuvant של פרוינד המלא (CFA), כפי שמתואר ב11 בשינויים הבאים: שלב 1.1:. להכין PLP 139-151 בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר בופר פוספט 1x (PBS) שלב 1.4:. להשתמש 200 μl של תחליב המכיל CFA של PLP 139-151 100 מיקרוגרם לכל חיה שלב 1.4.1: לחסן את עשרה בעלי חיים, להכין 2 מיליליטר של תחליב על ידי ערבוב 1 מיליליטר של PLP 139-151 (1 מ"ג / מיליליטר ב1x . PBS) ונפח שווה של CFA שלב 1.5: להזריק 200 μl של אמולסיה במינונים מפוצלים מתחת לעור בשני אזורים מפשעתי (~ 75 μl כל אחד) ואזור עצם חזה (~ 50 μl) של חמישה עד שישה שבועות בן FEMAעכברי le SJL / י. צעדים 1.7 ו1.8 אינם ישימים לזירוז של EAE.

2. ניקוד קליני עכברים EAE וקצירה של Cerebrums

  1. לפקח על בעלי החיים להופעת סימנים קליניים, ואת ציון המחלה החומרה יומית מpostimmunization 9 היום באופן הבא: 0 - בריא; 1 - הצליעה חולשת גפיים או זנב אחורית אבל לא את שניהם; 2 - הצליעה חולשת גפיים זנב ואחורי; 3 - שיתוק חלקי של גפיים אחוריות; 4 - שיתוק של גפיים אחוריות מלא; 5 - גוסס או מת 12.
  2. להרדים את העכברים כשהם מגיעים לציון נוירולוגית של 3 או 4 באמצעות CO 2. כדי להרדים את העכברים, מראש למלא את תא המתת חסד ראשון עם CO 2 על ידי הפיכת הרגולטור של טנק ה-CO 2 שלא יעלה על 6 psi ולאפשר חיות להישאר בתוך החדר למשך כ 5 דקות כדי להשיג חנק מוחלט. משרים את החיות מורדמים באלכוהול 70%. מייד, הנח את החיות על משטח סופג ובעזרת זוג סטרילי עבורפטריות לבנות ומספריים לחשוף את לבם על ידי חיתוך דרך חלל בית החזה. לנקב את auricles הנכון וינקב על ידי הזרקת 10 מיליליטר של 1x PBS הקר לתוך חדריו שמאלי של הלב.
  3. לחפור את הגולגולת על ידי לגזום את הגולגולת בצורה מעגלית באמצעות מספריים מעוגלים, ובזהירות, להעיף את עצמות גולגולת עם מלקחיים. לקצור את המוח על ידי להקהות נתיחה ובאמצעות אזמל נקי, מוח גדול נפרד מהמוח הקטן. מניחים את המוח בצינור המכיל קר 1x PBS ולהשאיר את הצינור על קרח עד לעיבוד.

3. בהכתמה באתרו של סעיפים מוחין עם MHC Class II (IA ים) / PLP 139-151 Dextramers

  1. כן 4% שנאגרו-PBS agarose התכה נמוכה, להמס על ידי חימום ב50 ° C ולהשאיר אותה באמבט המים C ° 40 עד לשימוש.
  2. מניחים את המוח בקלטת היסטולוגיה עובש בסיס עמוק חד פעמית שמר על קרח, ויוצקים agarose המותך (40 מעלות צלזיוס). באופן מיידי, לחץ על המוח בעדינותעם מלקחיים כדי להטביע את הרקמה. השאר את הקלטת על קרח למשך 15-20 דקות עד להתמצקות היא מוחלטת.
  3. מלא את האמבטיה vibratome עם מצונן 1x PBS. למלא את החלל סביב vibratome אמבטיה עם קוביות קרח כדי לשמור על הטמפרטורה של PBS בין 0 ל 2 ° C. תקן את סכין גילוח נקי לvibratome ולקבוע את זווית הלהב ל15 °.
  4. מיקום של רקמה בvibratome. Trim agarose עודף מכל הצדדים של הרקמה משובצת ומעט לחשוף את פני השטח הגחון של המוח הגדול.
    1. למרוח vibratome גוש רקמה עם דבק סופר ולהעביר את הרקמות מוטבעות agarose על פני השטח המודבק על ידי הנחת משטח הגחון החשוף של המוח הגדול על הדבק לחתך רוחבי. אל תזיזו את הרקמה, ברגע שהרקמה מוגדרת על הבלוק.
    2. מניחים את גוש vibratome המכיל רקמות מוטבעות agarose על קרח, ולאפשר לדבק להתייבש במשך 15 דקות.
  5. בינתיים, הנח את צ'אם הרקמהBers אחד לכל טוב של צלחת 24 גם. למלא את הבארות המכילות תאי רקמה עם 1 מיליליטר של 1x PBS הקר, ולהשאיר את הצלחת על קרח.
    1. הכן את תאי רקמות על ידי הצמדת ניילון דק רשת כדי לחתוך סוף פיפטה פוליפרופילן 25 מיליליטר באמצעות דבק סופר; לאחר זמירה הרשת העודפת סביב פיפטה, לחתוך את פיפטה אורך של 1 סנטימטר מהרשת.
  6. מנמיכים את להב vibratome לרמה של המשטח העליון של רקמות; להגדיר את מהירות vibratome ל0.22 מ"מ / השני ולהתחיל חתך עם תנועה קדימה לעשות 200 מיקרומטר חלקים עבים. העבר את הסעיף מוחי אחד לכל גם בעזרת מברשת רכה בצבעי מים לתאי הרקמה ממוקמים בתוך הבארות של צלחת 24 גם. שמור את הצלחת על קרח עד חתך הוא מלא על מנת למנוע ניוון רקמות. הערה: בצע את השלבים הבאים כדי להשיג בשלושה חלקים בסך הכל, לזווג משלושה אזורים שונים של מוח הגב אל פני השטח הגחון (איור 2). חלק אחד מכל זוג (בשלושה חלקים בסך הכל) ממוקם בשלושה תאי רקמה בודדים מיועדים לצביעה עם dextramers הספציפי (ים IA / PLP 139-151) ואנטי CD4. כמו כן, קבוצה נוספת של שלושה חלקים אשר ממוקמים בשלושה תאי רקמה בודדים מיועדות לצביעה עם dextramers שליטה (IA / שעות TMEV 70-86) ואנטי CD4.
  7. העבר את שלושת תאי רקמה המכילים את החלקים המיועדים לצביעה עם dextramers הספציפי לשלוש בארות בצלחת 24 גם עם תא אחד בכל טוב שבו, PLP 139-151 dextramers 300 μl של קוקטייל המכיל allophycocyanin (APC) מצומדות (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואנטי CD4-phycoerythrin (PE; 5 מיקרוגרם / מיליליטר) בחסימת פתרון (1x PBS עם 2% נסיוב עזים נורמלים) נוספו בעבר. מכסה את הבארות עם מכסה.
  8. בדומה לכך, להעביר את שלושת תאי רקמה המכילים את החלקים המיועדים לצביעה עם dextramers שליטה לשלוש בארות בצלחת 24 גם עם חדר אחד לכולנוll בי, 300 μl של קוקטייל המכיל TMEV APC-מצומדות 70-86 dextramers (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואנטי CD4-PE (5 מיקרוגרם / מיליליטר) בחסימת פתרון נוסף בעבר. מכסה את הבארות עם מכסה. הערה: עיין בMassilamany ואח', 8 להכנת dextramers, ומולקולות dextran להכין dextramers סופקו באדיבות על ידי Immudex, קופנהגן, דנמרק..
  9. לתייג את הבארות, ולעטוף את הצלחת עם נייר אלומיניום ומניח את הצלחת על פלטפורמת נדנדה להגדיר לסיבובים עדינים ל1.5 שעות בחושך ב RT.
  10. לאחר תקופת הדגירה, לשטוף חלקי רקמות על פלטפורמת הנדנדה, על ידי העברת תאי הרקמה טרי גם מכילה 1 מיליליטר של 1x PBS הקר, ולהימנע מכדרור את תוכנו של אחד גם לתוך השני. חזור על שטיפה שלוש פעמים, מה שמאפשר לפחות 10 דקות לכל לשטוף. להבטיח כי חלקי הרקמות לא מקבלים מיובשים כפי שהם יכולים להיצמד לדפנות של החדר.
  11. לתקן את הסעיפים על ידי העברת צ'אם הרקמהbers לתוך באר טרי בצלחת 24 גם מכילה 1ml של 4% paraformaldehyde המסונן נאגר-PBS (pH 7.4) על פלטפורמת נדנדה במשך שעה 2 עם סיבובים עדינים.
  12. חזור על שטיפה שלוש פעמים כמתואר בשלב 3.10.
  13. מניחים את החלקים המוכתמים וקבועים בשקופית מיקרוסקופית נקייה בעזרת מברשת רכה בצבעי מים. נגב את עודפי מים בלי לגעת בסעיף, ולעגן את הסעיף באמצעות הרכבה בינונית. כסה עם coverslip מיקרוסקופי ולאפשר את השקופיות לייבוש על RT O / N בחדר החשוך.
  14. אחסן את השקופיות בקופסא אחסון שקופיות אור ההוכחה ב 4 ° C.

4. אינדוקציה של EAM ואוסף לבבות

  1. לגרום EAM כמתואר בהתייחסות 11.
  2. להרדים את העכברים בpostimmunization יום 21 באמצעות חדר נקי מצויד עם CO 2 בלון גז, ולהשרות את בעלי החיים באלכוהול 70%. מייד, הנח את החיות על משטח סופג ובעזרת זוג מלקחיים ומספריים לחשוף את הלבים על ידי חיתוך דרך חלל בית החזה. לנקב את auricles הנכון וינקב על ידי הזרקת 10 מיליליטר של 1x PBS הקר לתוך חדריו שמאלי של הלב. לאסוף את לבם ואת המקום בצינורות המכילים קר 1x PBS.

5. בהכתמה באתרו של מדורים לב עם MHC Class II (k IA) / Myhc 334-352 Dextramers

  1. הכן 4% שנאגר PBS נמוך היתוך agarose, להמס על ידי חימום ב50 ° C ולהשאיר אותה ב40   ° C אמבט מים עד לשימוש.
  2. מניחים את הלב בקלטת היסטולוגיה חד פעמית עמוקה עובש בסיס כל הזמן על קרח, ויוצקים מותכת 40 מעלות צלזיוס עד agarose הרקמות שקועות לחלוטין כמתואר בשלב 3.2.
  3. בצע את השלב 3.3.
  4. Trim agarose עודף מכל הצדדים של הרקמה משובצת ומעט לחשוף את הבסיס של הלב. למרוח vibratome גוש רקמה עם דבק סופר ולהעביר את הרקמות מוטבעות agarose על פני השטח המודבק על ידי הנחת המשטח החשוף שללב על הדבק. אל תזיזו את הרקמה, ברגע שהרקמה מוגדרת על הבלוק.
    1. מניחים את גוש vibratome המכיל רקמות מוטבעות agarose על קרח, ולאפשר לדבק להתייבש במשך 15 דקות.
  5. בצע את פעולות 3.5 ו3.6.
  6. להעביר את חלקי לב באמצעות מברשת רכה בצבעי מים לתאי הרקמה ממוקמים בתוך הבארות של צלחת 24 גם. שמור את הצלחת על קרח עד חתך הוא מלא כדי למנוע השפלה של רקמה. הערה: בצע את השלבים הבאים כדי להשיג בסך הכל, שמונה סעיפים לזווג מהקודקוד לבסיס של הלב (איור 2). מניחים את כל הסעיפים בתאי רקמה, הקצאה של עד 3 חלקים לכל תא. סעיף אחד מכל זוג (בשמונה חלקים בסך הכל) מיועד לצביעה עם dextramers הספציפי (IA k / Myhc 334-352) ואנטי CD4. כמו כן, קבוצה נוספת של שמונה סעיפים מיועדות לצביעה עם dextramers שליטה (IA k / RNase 43-56) ואנטי CD4.
  7. העברשלושה תאי רקמה המכילים את החלקים המיועדים לצביעה עם dextramers הספציפי לשלוש בארות בצלחת 24 גם עם תא אחד בכל טוב שבו, 300 μl של קוקטייל המכיל Myhc 334-352 dextramers APC-מצומדת (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ו אנטי CD4-PE (5 מיקרוגרם / מיליליטר) בחסימת פתרון נוסף בעבר. מכסה את הבארות עם מכסה.
    1. בדומה לכך, להעביר את שלושת תאי רקמה המכילים את החלקים המיועדים לצביעה עם dextramers שליטה לשלוש בארות בצלחת 24 גם עם תא אחד בכל טוב שבו, 300 μl של קוקטייל המכיל RNase APC-מצומדות 43-56 dextramers (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואנטי CD4-PE (5 מיקרוגרם / מיליליטר) בחסימת פתרון נוסף בעבר. מכסה את הבארות עם מכסה.
  8. לתייג את הבארות, ולעטוף את הצלחת עם נייר אלומיניום ומניח את הצלחת על פלטפורמת נדנדה להגדיר לסיבובים עדינים ל1.5 שעות בחושך ב RT.
  9. בצע את הפעולות, 3.10-3.11
  10. thr חזור כביסהקרח כמתואר בשלב 3.10.
  11. מניחים את החלקים המוכתמים וקבועים (עד שלושה חלקים / שקופיות) בשקופית מיקרוסקופית נקייה בעזרת מברשת רכה בצבעי מים. נגב את עודפי מים בלי לגעת בחלקים, ולעלות את החלקים באמצעות הרכבה בינונית. כסה עם coverslip מיקרוסקופי ולאפשר את השקופיות לייבוש על RT O / N בחדר החשוך.
  12. אחסן את השקופיות בקופסא אחסון שקופיות אור ההוכחה ב 4 ° C.

6. ניתוח Dextramer + (+ dext) CD4 + T תאים על ידי סריקת הלייזר Confocal מיקרוסקופ (LSCM) (משותפים למוח ומדורי לב שני)

  1. השתמש במערכת מיקרוסקופ confocal 90i ניקון A1-Eclipse לסריקה ולרכישת תמונות שבשגרה. כדי להתחיל לחץ פתוח, תוכנת ש"ח האלמנטים AR (גרסת 4.13).
    1. בחר "TRITC" וערוצים "Cy5" מהלוח. אורכי גל העירור / פליטת בהתאמה לערוצי TRITC וCy5, 561.5 ננומטר / 553-618 ננומטר ו640.7 ננומטר / 663-738 ננומטר מופיעים כברירת מחדל.
    2. הקצה את pseudocolors "ירוק" ו "אדום" לTRITC (CD4-PE) וCy5 ערוצים (dextramer-APC), בהתאמה.
    3. מניחים את השקף כדי להיבחן על הבמה המיקרוסקופית ולהתמקד באופן ידני תחת הגדלה של X100. הגדר את "HV" ל110 וקזז ל "0". לחץ על "פוקוס" ולהתאים את "המתח" כדי לייעל את הלייזרים.
    4. לחץ על "פוקוס"; לסרוק את הסעיף מלמעלה עד למטה, ולהגדיר את הרמה "Z" לרכישת תמונה. לחץ על "סדרת CH" ולרכוש את רצף התמונה. זהה dext + CD4 + T תאים המופיעים תאי punctate צהובים כמבוססים על שיתוף לוקליזציה של אותות שנוצרו משני האדום (dextramers) והירוק (CD4) ערוצים.
  2. השתמש במיקרוסקופ confocal FV500-BX60 אולימפוס לספירה כמותית קלה של תאים + CD4 + T dext. כדי להתחיללחץ פתוח, תוכנת FluoView (גרסת 4.3).
    1. בחר את הצבעים "Cy3" ו "Cy5" מהתפריט הנפתח, ולחץ על "חלים" כדי לטעון את הלייזרים, בהתאמה. הערה: אורכי גל עירור / פליטה לCy3 (543 ננומטר / pseudocolored "ירוקים"; CD4-PE) וCy5 (633 ננומטר / pseudocolored "אדום"; dextramer-APC) ערוצים.
    2. מניחים את השקף כדי להיבחן בשקופית המיקרוסקופית, ולמקד אותה באופן ידני בהגדלה נמוכה (4X או 10X). לחץ על "פוקוס", ואילו לייזר Cy3 הוא על, ולהתמקד ההתמקדות הדלקתית.
    3. לשנות את המטרה להגדלת 100x. הגדר את גודל קובץ ל" 512/512 "מהתפריט הנפתח. לחץ על "פוקוס" ולהתאים את הערכים עבור "PMT", "רווח" ו "אופסט" פרמטרים כדי לייעל את הלייזרים בנפרד עבור Cy3 וCy5.
    4. לחץ על "שלב Z" ולאחר מכן לחץ על "פוקוס", ואילו את שני הלייזרים נמצאים. ערכההעובי של "שלב Z" על ידי לחיצה על "למעלה" וחצים "למטה". הגדר את המרווח "Z" ל2 מיקרומטר.
    5. לחץ על "עצור", ובחר באפשרות "Seq123". לאחר מכן, לחץ על "XYZ" ולהתחיל לרכוש תמונות סדרה "Z" לאזור שנבחר בתוך המוקד דלקתי. שמור את "תמונות סידורי Z" כקבצי AVI. כדי לשמור קבצי תמונה, בחר את התמונה מ" התמונה סידורי Z ", ולאחר מכן לשמור כפורמט" ריב ".
  3. בחן את שלושה חלקים לזווג מהמוח הגדול שבו קבוצה אחת של שלושה חלקים הייתה מוכתמת בים IA / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 והסט האחר של שלושה חלקים עם של IA / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 לבצע ניתוח כמוני.
    1. באופן דומה, לנתח שמונה סעיפים לזווג ללב, שבו, סט אחד משמונה קטעים היה מוכתם בIA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 ואחר set של שמונה חלקים עם RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. לבחון 10-15 מוקדים דלקתיים לכל סעיף במוח גדול, ובכל פוקוס, לרכוש סט של 15-25 תמונות ברצף סדרתי.
    1. לבחון כולל של 20 מוקדים דלקתיים מכל שמונה הסעיפים של לב ומכל מוקד לרכוש 10-15 תמונות סידורי ברצף. קח תמונות סדרתי "Z" על ידי סריקת השקופיות בתנועה 'אופקית אנכית מעלה אופקית אנכית כלפי מטה ", כך שהחזרה של סדרה" Z "בתוך אותו המוקד הוא התחמקה.
    2. ברגע שתמונות סדרתי "Z" הם כבשו, תנו שם לקבצים על ידי זיהוי מספרי שקופיות, שמו של החלקים, ומספר תמונות סדרתי "Z" שצולמו.
      1. השתמש בתוכנת 'ImageJ' לספור תאים + CD4 + T dext ביחס למספר הכולל של תאי CD4 + T. בחר את "הסוג של דלפק 'ב' ImageJ, לבדוק ו# 8216; להציג את כל 'ולהתחיל לספור על ידי לחיצה על מרכזו של כל תא וימשיך לספור בשונות', 'תמונות סידורי Z באמצעות חצים בצד. לאחר ספירת כל תאי T מסוג CD4, לבחור סוג אחר של דלפק ולספור CD4 + dext + תאי T. לחץ על כרטיסיית התוצאות כדי לקבל את המספר הכולל של תאים נספרו עם שני מונים שונים.
      2. כדי לקבל את המספר הכולל, להוסיף את מספר התאים בכל תמונות סדרתי "Z" המייצגות את כל שלושה חלקים במוח, או בכל חלקי לב שמונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בדו"ח זה, באיתור באתרו של אנטיגן ספציפי, תאי T מסוג CD4 אוטוריאקטיבים ידי צביעה ישירה עם כיתת MHC II dextramers מתואר. חלקים במוח שנכרתו זה נגזרו מעכברי EAE ומוכתם עם קוקטיילים המכילים PLP 139-151 (ספציפי) או TMEV 70-86 dextramers (שליטה) ואנטי CD4. הלוחות העליונים באיור 1 מציג ניתוח LSCM סעיפים מוחין costained עם PLP 139-151 dextramers (אדום) ונוגדנים מסוג CD4 (ירוק), שבו התאים כפולים חיוביים הופיעו צהובים. כגון תכונה נעדרה בסעיפים מוכתמים בTMEV 70-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלא כמוני tetramers כיתת MHC, השימוש בMHC הכיתה השני tetramers ליישומים שיגרתי ממשיך להיות מאתגר, במיוחד כדי למנות את תדרי המבשר של תאים בעלת זיקה נמוכה אוטוריאקטיבים T מסוג CD4, נובעים בחלקו תלות ההפעלה שלהם 6,15-17. לאחרונה, בעיה זו נעקפה על ידי יצירת הדור הבא של tetramers, שנקרא "dextramers", המאפשרת לנו לזהות תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי למספר autoantigens, כגון 139-151 PLP, MOG 35-55 וMyhc 334 - 352 8. בדו"ח זה, בפעם הראשונה, את השירות של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי האינטרסים הוכרזו.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי והקרן לילדים קרדיומיופתיה (SDG2462390204001), והמכון הלאומי לבריאות (HL114669). CM הוא נמען של מענק מלגת מחקר פוסט דוקטורט הוענק על ידי קרן דלקת שריר הלב, ניו ג'רזי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
CFASigma Aldrich, סנט לואיס, חנות MO5881ב-4 & #176; ג
MTB  תמצית H37Rv מעבדות דיפקו, דטרויט, מישיגן231141ב-4 & #176; C
PTList מעבדות ביולוגיות, קמפבל, קליפורניה181חנות ב 4 & #176; C
1x PBS חנות קורנינג, מנסס, וירג'יניה21-040-CVבכתובת 4 & #176; C
עכברי A/J נקבה מעבדות ג'קסון, בר הרבור, ME646
עכברי SJL/J נקבותמעבדות ג'קסון, בר הרבור, ME686
Leur-lok סטרילי 1 מ"ל סירינגBD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי309628
לור-לוק סטרילי 3 מ"ל סירינגBD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי309657
מחט סטרילית, 18 גרםBD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי305195
מחט סטרילית, 27 1/2 גרםBD, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי305109
עצירה תלת כיוונית סמיתס מדיקל ASD, בע"מ דבלין, אוהיוMX5311L
גלילי תחבושת גזה קרליקס Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Agarose, נקודת התכה נמוכה, תאגיד Promega בדרגה אנליטית, מדיסון, WIV2111
סרום עיזים רגיל ImmunopureThermo Scientific, Waltham, MA31873חנות ב -20 & #176; C
CD4 נגד עכבר מצומד עם צבע PEeBioscience, סן דייגו, קליפורניה חנות 12004185ב-4 & #176; C
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA19202חנות ב 4 & #176; C
Faramount Aqueous Mounting MediumDako, Carpinteria, CA10073021
צינור חרוטי (15 מ"ל)BD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה352099
צינור חרוטי (50 מ"ל)BD Biosciences, סן חוזה, CA352070
24 בארות צלחות תרבית רקמות עם תחתית שטוחהBD Biosciences, סן חוזה, קליפורניה356775
צבע מים #2 מברשותצ'ארלס לאונרד, בע"מ Hauppauge, NY73502
שקופיות מיקרוסקופ רגילות, גודל: 3 אינץ' x 1 אינץ' x 1.2 מ"מפישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה1255010
זכוכית כיסוי פרימיום, 22 x 22-1פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה12548B
קלטות היסטולוגיה חד פעמיות של עובש בסיס עמוקייצור מעבדה, רוצ'סטר, ניו יורקM-475-10
דבק סופר לוקטיטHenkel Corporation, Westlake, OH1471879
סכיני גילוחGillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MAStore at 4 & #176; C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)ניאופפטיד, קיימברידג', חנות MAב 4 & #176; C
MHC Class II/IAs PLP 139-151 או TMEV 70-86 dextramers מצומדים עם חנות צבעב-4 & #176; C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  או RNase 40-56 dextramers מצומדים עם חנות צבעב-4 & #176; C
Dextran מצומד SA-APCImmundex, קופנהגן, חנות דמרקב-4 ° C
מספריים ומלקחיים כירורגיים סטרילייםכלי INOX תאגיד
תנור מיקרו GEHealthcare, פיטסובורג, פנסילבניה
Leica VT 1200 VibratomeLeica Microsystems, Inc. באפלו גרוב, IL
אולימפוס BX 60  מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזראולימפוס אמריקה, בע"מ סנטר ואלי, פנסילבניה
ניקון A1-Eclipse 90i מיקרוסקופ קונפוקליNikon Inc. מלוויל, ניו יורק
חנות APC APC

מקורות

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654(2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11(2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MHC class IITZ stack

מאמרים קשורים