איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

סיכום

מיצוי DNA מרוק יכול לספק מקור זמין ל-DNA במשקל מולקולרי גבוה, עם מעט פירוק/פיצול. פרוטוקול זה מספק פרמטרים אופטימליים לאיסוף/אחסון רוק ומיצוי DNA כדי שיהיו באיכות ובכמות מספיקים לבדיקות DNA במורד הזרם עם דרישות איכות גבוהות.

תקציר

המקור המועדף ל-DNA במחקר גנטי אנושי הוא דם, או קווי תאים שמקורם בדם, מכיוון שמקורות אלה מניבים כמויות גדולות של DNA באיכות גבוהה. עם זאת, מיצוי DNA מהרוק יכול להניב DNA באיכות גבוהה עם מעט או ללא פירוק/פיצול המתאים למגוון בדיקות DNA ללא הוצאה של פלבוטומיסט ואף ניתן לרכוש אותו בדואר. עם זאת, נכון לעכשיו, לא הוצגו בספרות פרוטוקולי איסוף/מיצוי DNA של רוק לריצוף הדור הבא. פרוטוקול זה מייעל פרמטרים של איסוף/אחסון רוק ומיצוי DNA כך שיהיו באיכות ובכמות מספיקים לבדיקות DNA בסטנדרטים הגבוהים ביותר, כולל גנוטיפ מיקרו-מערך וריצוף הדור הבא.

מבוא

קבלת DNA באיכות גבוהה עבור מחקרים גנטיים אנושיים היא חיונית בתהליך גילוי גנים למחלות. דם, אם כי דורש הליך פולשני וגם להיות יקר יותר מאשר אוסף רוק, הוא מועדף ליצירת שורות תאים הונצחו כמקור אינסופי של DNA, או iPSCs ללימודים פונקציונליים, ולפעמים DNA הדם משמש בעת שורות תאים אינן זמינות. עם זאת, קבלת דם דורשת phlebotomist מאומן ויש לו דם מחצית חיים קצרים יותר מאשר רוק ^1. DNA מרוק הוא פחות יקר וקל יותר להשגה, שכן הוא יכול להיות שנאסף ונשלח באמצעות הדואר ללא הצורך בphlebotomist, ובכך להגדיל בריכות נושא הפוטנציאל הרבה מעבר לאגן ההיקוות של בתי חולים ומעבדות ^2. הרשמה למחקר ניתן לשפר את האיכות יש לי נושאים האפשרות של מתן דגימת רוק במקום דם ^{3, 4.} חששות לגבי הכמות והאיכות של DNA מרוק יכולים להיות המוגבלים הנרחבדואר למרות מחקרים שנעשה לאחרונה מחקרים רבים המראים את התאמתו של כל רוק, עם ממוצע של 4.3 x 10 ⁵ תאים למיליליטר, לבדיקות DNA על פני שיטות מטליות buccal המבוגרות שלא לקבל כמויות משמעותיות של רוק ^{2, 3, 4, 5, 6.} בעוד ספרות צנועה קיימת מראה את ההתאמה של DNA רוק השלם נגזר עבור יישומי גנוטיפ כולל שיטות המבוסס על microarray ^{8, 9,} רצף ^10, אין מחקרים בחנו הדור הבא (NGS). המטרה לייעול פרוטוקול חילוץ זה כל DNA הרוק הייתה למקסם את הכמות ואיכות עבור יישומי גנטיקה בדרך יעילה עלות שמיושמת בקלות במעבדות עם חומרים כימיים וחומרים נפוצים.

מיצוי DNA מרוק דורש מספר הליכים: 1) איסוף ואחסון, טיפול RNase 2) תמוגה תא, 3), 4) ממטרים חלבון, 5) משקעים אתנול, 6) להחזרת נוזלי DNA. פתרון DNA ייצוב הצפת, שתוארבעבר ^2, פונקציות כראוי ללא שינוי. שום ניסיון לייעל את טיפול RNase וצעדים להחזרת נוזלי DNA נעשה. לכל שלב שנותר, מספר משתנה שיכול להשפיע על תשואה זוהו. כל אחד ממשתנים היו מניפולציות באופן אישי ושיפור בתפוקה ואיכות הוערך סטטיסטי. עבור משתנים שהוצגו כדי לשפר את התשואה ו / או איכות DNA, הערכים אופטימליים נכללו בפרוטוקול הסופי.

פרוטוקול

הערה: לפני מתן דגימות רוק כל הנושאים נתנו הסכמה מדעת התואמת את הקווים המנחים לטיפול בבני אדם בבית החולים לילדים בפריסה ארצית.

.1 רוק איסוף ואחסון

1. לפני אוסף רוק, להבטיח כי הפה של הנושא הוא ללא מזון או חומרים זרים אחרים על ידי בעל העניין לשטוף את פיהם במים והימנעות אכילה או שתייה במשך 30 דקות לפני איסוף הדגימה.
2. פתח צינור צנטריפוגות 15 מ"ל עם 2.5 מ"ל של חיץ ייצוב DNA ² והקפד להימנע מלגעת בחלק הפנימי של הכובע או צינור, ויש לי את הנושא לירוק 2.5 מ"ל של רוק לפתרון החיץ. שים לב: איסוף יותר מ 2.5 מ"ל של רוק יכול להוביל להשפלת מדגם מיחס מספק של מדגם לחיץ ייצוב DNA. איסוף רוק מעט מדי יפחית תשואות הצפויות מהפרוטוקול. כדי להעריך את היקפי גבייה, להשתמש במעברי הצבע הממוספרים בצד של tהוא הצינור.
3. להחליף כובע ומערבבים על ידי היפוך עד לקבלת התערובת הומוגני. טלטול נמרץ הוא לא הכרחי. אחסן את הדגימות ב RT עבור אחסון לטווח קצר או 4 ° C לאחסון לטווח ארוך (> 3 חודשים).

2 הכנות ראשוניות ותמוגה תא

1. לפני תחילת ההפקה, לחמם אמבט מים ל37 מעלות צלזיוס, ולהכין דלי קרח. שלושה 15 צינורות מ"ל צנטריפוגות חרוטי יהיה צורך עבור כל דגימה שחולצה. שלושה צינורות ישמשו כדי להחזיק את התא גלולה וחלבון, gDNA חילוץ הסופי, וsupernatants isopropanol ואתנול.
2. להשיג דוגמאות קרקע מאחסון, ודגימות הפכו כמה פעמים ואז מערבולת במהירות בינונית במשך 15 שניות.
3. לוותר 2.5 מ"ל של מדגם לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ"ל, ולהוסיף 5 מ"ל של תא תמוגה פתרון. מערבבים את המדגם 50 פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך 30 דקות.

הסרת .3 RNA

1. הוסף 40 μl של RNase סולution ב100 מ"ג / מ"ל, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
2. הסר את המדגם מאמבט המים 37 מעלות צלזיוס ומגניבה על קרח למשך 3 דקות.
   1. לאחר הדגירה RNase, להעלות את הטמפרטורה של המים באמבטיה ל65 מעלות צלזיוס למשך הצעד להחזרת נוזלי DNA של הפרוטוקול.

.4 חלבון והסרת שומנים

1. הוסף 50 μl של proteinase K פתרון ב20 מ"ג / מ"ל, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות. הערה: זוהי נקודת השהיה אפשרית לפרוטוקול. לאחר התוספת של proteinase K הפתרון, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד ליכול להסתיים החילוץ. האחסון בC ° 4 עד 24 שעה לא הוצג להיות השפעה משמעותית על תשואות מיצוי או איכות DNA. אחסון לטווח ארוך, בשלב זה לא נבדק.
2. הוספת 1.7 מ"ל של פתרון משקעים חלבון, מערבולת במרץ ל20 שניות במהירות גבוהה, ומניחים על קרח עבור 10 דקות.
3. ברגע שהדגימות התקררו על קרח עבור 10 דקות, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 3,000 XG ו4 מעלות צלזיוס. החלבונים זירז חייבים ליצור גלולה חזקה להמשיך. אם גלולה היא לא חזקה או הפתרון הוא עדיין מעונן, יכולות להיות מקוררות על דגימות קרח למשך 5 דקות נוספות וצנטריפוגה חוזרת ונשנית. הדגימות חייבות להיות כל הזמן על קרח כדי להבטיח גלולה הדוקה.

.5 בידוד וטיהור של gDNA

1. לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ"ל, pipet 5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל ו8 μl של טהור גליקוגן פתרון ב20 מ"ג / מ"ל.
2. יוצקים את supernatant המכיל gDNA משלב 4.3 לתוך הצינור המכיל האלכוהול איזופרופיל וגליקוגן פתרון, והותיר אחריו את כדור החלבון זירז. ברגע שsupernatant נוסף, לערבב בעדינות המדגם 50 פעמים על ידי היפוך וצנטריפוגות במשך 30 דקות ב 3,000 XG ו4 ° C..
3. יוצקים את supernatant לאט לתוך צינור 15 מ"ל נקי. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 1 מ"ל של אתנול 70% ללשטוף את הכדור על ידי נדנדה לאט ובעדינות נעו אתנול על גלולה זירז כמה פעמים. שמור אתנול בצינור.
4. לאחר השטיפה הראשונית, צנטריפוגות המדגם 1 דקות ב2,000 XG ו20 מעלות צלזיוס. ניתן לעשות צעד צנטריפוגה זה ברמת 4 מעלות צלזיוס או 20 מעלות צלזיוס. אין השפעה משמעותית של טמפרטורה הוכחה בשלב זה.
5. , בעקבות לשטוף וצנטריפוגה הראשוניות של גלולה לשפוך לאט לשטוף אתנול מהצינור וזורקים, ולאחר מכן לבצע לשטוף את השני על ידי חזרה על שלבי 5.3 ו5.4.
6. לאחר הסרת supernatant מלשטוף את השני, לאפשר את גלולה לייבוש באוויר במשך 15 דקות.
   1. אם המדגם לא התייבש לחלוטין, אוויר יבש לעוד דקות 15.

.6 Rehydration של gDNA

1. לאחר המדגם התייבש, להוסיף 300 μl של טריס-EDTA לרעננות גלולה gDNA המיובש.
2. מערבולת המדגם במשך 5 שניות במהירות בינונית ומניחים באמבט מים חמים 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
3. הסר את הדגימות מאמבט המים ודגירת O / N ב RT.
   הערה: כל מוצרים וחומרים כימיים המשמשים מפורטים בלוח חומרים, כמו גם לוח 4.

תוצאות

כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים להפקה DNA סדרה של עקירות DNA מזווגות בוצעה. דגימת רוק אחת פוצלה וכל מנה שנבדקה עם אחד משני ערכים אפשריים עבור משתנה נתון. לפחות שמונה חזרות של כל בדיקה לזווג בוצעו (למשל, דגימת רוק אחת הייתה aliquoted לבדוק חילוץ עם או בלי הדגירה C ° 50 ראשונית). אופטימיזציה הייתה מבוססת על ארבעה מדדים סטנדרטיים: תשואה כוללת DNA, ערך 260/280, ערך 260/230, ובדיקה ויזואלית של DNA electrophoresed להעריך פיצול. לא כל הצירופים האפשריים של המשתנים הוערכו אינטראקציות...

דיון

ההליך הנוכחי הוא פרוטוקול מיצוי DNA מותאם שהשתפר במידה ניכרת תשואה של DNA משקל המולקולרי הגבוה בהשוואה לשיטות סטנדרטית, מבלי להתפשר על איכות DNA. השלב הקריטי עם ההשפעה הגדולה ביותר על התשואה ביותר היה צעד 5.2, הכולל צעד צנטריפוגה כבר במהלך משקעים אתנול מכל פרוטוקול שפורסם סקר כאן, חוץ מאחד שלא הופץ באופן נרחב ^11. לא חל שינויים באיכות DNA הקשורים לצנטריפוגה עוד זה התגלו, המצביע על כך שרוב DNA הזמינים מאוסף רוק שלם הוא לא מושפל וגבוה משקל מולקולרי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה	פישר	12-565-268
תמיסת ליזה תאים	Qiagen	158908
Proteinase K	Sigma	P6556
תמיסת משקעים חלבון	Qiagen	158912
Isopropanol	Fisher	A416-4
גליקוגן	EZ-BioResearch	S1003
70% אתנול	פישר	04-355-305
Tris-EDTA (TE)	Fisher	BP2473-1
NaCl	Fisher	AC194090010
Tris HCl	Fisher	BP1757-100
EDTA (0.5 מ') תמיסת	Fisher	03-500-506
נתרן דודציל סולפט	פישר	BP166-100
מערבולת אנלוגית מערבולת	מיקסר פישר	02-215-365
צנטריפוגה 5810R	אפנדורף	5811 000.010