Method Article

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

DOI:

10.3791/51697

⸱

August 27th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Battelle Center for Mathematical Medicine, The Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 2The Interdisciplinary Graduate Program in Biophysics, The Ohio State University, 3Department of Pediatrics, The Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיצוי DNA מרוק יכול לספק מקור זמין ל-DNA במשקל מולקולרי גבוה, עם מעט פירוק/פיצול. פרוטוקול זה מספק פרמטרים אופטימליים לאיסוף/אחסון רוק ומיצוי DNA כדי שיהיו באיכות ובכמות מספיקים לבדיקות DNA במורד הזרם עם דרישות איכות גבוהות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המקור המועדף ל-DNA במחקר גנטי אנושי הוא דם, או קווי תאים שמקורם בדם, מכיוון שמקורות אלה מניבים כמויות גדולות של DNA באיכות גבוהה. עם זאת, מיצוי DNA מהרוק יכול להניב DNA באיכות גבוהה עם מעט או ללא פירוק/פיצול המתאים למגוון בדיקות DNA ללא הוצאה של פלבוטומיסט ואף ניתן לרכוש אותו בדואר. עם זאת, נכון לעכשיו, לא הוצגו בספרות פרוטוקולי איסוף/מיצוי DNA של רוק לריצוף הדור הבא. פרוטוקול זה מייעל פרמטרים של איסוף/אחסון רוק ומיצוי DNA כך שיהיו באיכות ובכמות מספיקים לבדיקות DNA בסטנדרטים הגבוהים ביותר, כולל גנוטיפ מיקרו-מערך וריצוף הדור הבא.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קבלת DNA באיכות גבוהה עבור מחקרים גנטיים אנושיים היא חיונית בתהליך גילוי גנים למחלות. דם, אם כי דורש הליך פולשני וגם להיות יקר יותר מאשר אוסף רוק, הוא מועדף ליצירת שורות תאים הונצחו כמקור אינסופי של DNA, או iPSCs ללימודים פונקציונליים, ולפעמים DNA הדם משמש בעת שורות תאים אינן זמינות. עם זאת, קבלת דם דורשת phlebotomist מאומן ויש לו דם מחצית חיים קצרים יותר מאשר רוק 1. DNA מרוק הוא פחות יקר וקל יותר להשגה, שכן הוא יכול להיות שנאסף ונשלח באמצעות הדואר ללא הצורך בphlebotomist, ובכך להגדיל בריכות נושא הפוטנציאל הרבה מעבר לאגן ההיקוות של בתי חולים ומעבדות 2. הרשמה למחקר ניתן לשפר את האיכות יש לי נושאים האפשרות ש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לפני מתן דגימות רוק כל הנושאים נתנו הסכמה מדעת התואמת את הקווים המנחים לטיפול בבני אדם בבית החולים לילדים בפריסה ארצית.

.1 רוק איסוף ואחסון

  1. לפני אוסף רוק, להבטיח כי הפה של הנושא הוא ללא מזון או חומרים זרים אחרים על ידי בעל העניין לשטוף את פיהם במים והימנעות אכילה או שתייה במשך 30 דקות לפני איסוף הדגימה.
  2. פתח צינור צנטריפוגות 15 מ"ל עם 2.5 מ"ל של חיץ ייצוב DNA 2 והקפד להימנע מלגעת בחלק הפנימי של הכובע או צינור, ויש לי את הנושא ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים להפקה DNA סדרה של עקירות DNA מזווגות בוצעה. דגימת רוק אחת פוצלה וכל מנה שנבדקה עם אחד משני ערכים אפשריים עבור משתנה נתון. לפחות שמונה חזרות של כל בדיקה לזווג בוצעו (למשל, דגימת רוק אחת הייתה aliquoted לבדוק חילוץ עם או בלי הדגירה C ° 50 ראשונית). אופטימיזציה הייתה מבוססת על ארבעה מדדים סטנדרטיים: תשואה כוללת DNA, ערך 260/280, ערך 260/230, ובדיקה ויזואלית של DNA electrophoresed להעריך פיצול. לא כל הצירופים האפשריים של המשתנים הוערכו אינטראקציות.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליך הנוכחי הוא פרוטוקול מיצוי DNA מותאם שהשתפר במידה ניכרת תשואה של DNA משקל המולקולרי הגבוה בהשוואה לשיטות סטנדרטית, מבלי להתפשר על איכות DNA. השלב הקריטי עם ההשפעה הגדולה ביותר על התשואה ביותר היה צעד 5.2, הכולל צעד צנטריפוגה כבר במהלך משקעים אתנול מכל פרוטוקול שפורסם סקר כאן, חוץ מאחד שלא הופץ באופן נרחב 11. לא חל שינויים באיכות DNA הקשורים לצנטריפוגה עוד זה התגלו, המצביע על כך שרוב DNA הזמינים מאוסף רוק שלם הוא לא מושפל וגבוה משקל מולקולרי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 (DC009453 תמיכה ב-CWB).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 מ"ל צינורות צנטריפוגהפישר12-565-268
תמיסת ליזה תאיםQiagen158908
Proteinase KSigmaP6556
תמיסת משקעים חלבוןQiagen158912
IsopropanolFisherA416-4
גליקוגןEZ-BioResearchS1003
70% אתנולפישר04-355-305
Tris-EDTA (TE)FisherBP2473-1
NaClFisherAC194090010
Tris HClFisherBP1757-100
EDTA (0.5 מ') תמיסתFisher03-500-506
נתרן דודציל סולפטפישרBP166-100 
מערבולת אנלוגית מערבולתמיקסר פישר02-215-365
צנטריפוגה 5810Rאפנדורף5811 000.010

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
  2. Min, J. L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Saliva DNA ExtractionGenomic DNA IsolationCell Lysis SolutionRNA Removal StepProtein PrecipitationDNA PrecipitationEthanol WashSpectrophotometry AnalysisGel ElectrophoresisNext Generation Sequencing

Related Articles