Method Article

Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

DOI:

10.3791/51702

⸱

August 7th, 2014

 , 
1The Rowland Institute, Harvard University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלטפורמת electroporation סייע מערבולת microfluidic פותחה למסירה רציפה של מולקולות מרובות לתוך אוכלוסיות תאים זהות עם שליטה מדויקת ובלתי תלויה מינון. electroporation צעד טיהור תא המטרה שקדמו מבוסס גודל של המערכת סייע לשפר את יעילות אספקה ​​מולקולרית וכדאיויות תא מעובד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electroporation זכתה לתשומת לב הולכת וגובר בשנים האחרונות, כי זה הוא טכניקה חזקה מאוד להחדרה פיזית בדיקות מולקולריות אקסוגני שאינו permeant לתוך תאים. עבודה זו מדווחת פלטפורמת electroporation microfluidic מסוגל לבצע משלוח מולקולה מרובה לתאי יונקים עם שליטה מדויקת ומולקולרית תלויה פרמטר. היכולת של המערכת לבודד את התאים עם התפלגות גודל אחידה מאפשרת פחות וריאציה ביעילות electroporation לעוצמת שדה חשמלית נתון; מכאן משופר כדאיות מדגם. יתר על כן, תכונת ההדמיה תהליך שלה מאפשרת להתבוננות בתהליך הניאון המולקולרי הספיגה בזמן אמת, המאפשר התאמות פרמטר מסירה מולקולריות מהירה באתר לשיפור יעילות. כדי להראות את היכולות עצומות של הפלטפורמה דיווחה, מקרומולקולות עם גדלים שונים ומטענים חשמליים (למשל, Dextran עם MW של 3,000 ו -70,000 Da) היהנמסר לתאי סרטן השד גרורתי עם יעילות גבוהה משלוח (> 70%) עבור כל המולקולות שנבדקו. הפלטפורמה שפותחה הוכיחה את הפוטנציאל שלה לשימוש בהרחבה של תחומי מחקר שבו טכניקות electroporation יכולות להיות על שבב מועילות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, השימוש בפולסים חשמליים כדי להקל על משלוח cytosolic של מולקולות תאיים הפך אמצעי אטרקטיבי של מניפולציה תאי יונקים. 1 תהליך זה, המכונה גם electroporation, הפיך permeabilizes קרום התא, המאפשר למולקולות בלתי חדירים קרום מטבע כדי לקבל גישה לסביבה תאית של התאים. כי כמעט כל מולקולה יכולה להיות מוחדר cytosol באמצעות הנקבוביות שנוצרו זמניות בקרום של כל סוג של תאים באמצעות electroporation, הטכניקה דווחה כיותר לשחזור, ישים באופן אוניוורסלי, ויעיל יותר מאשר שיטות אחרות, כוללים וירוס בתיווך, כימי וגישות אופטיות. 2-3 טכניקה זו נוצלה להציג את מולקולות ניאון, 4 תרופות 5 וחומצות גרעין <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 תא הכנה

  1. צלחת 1 × 10 5 / מ"ל תאים של שורת תאי סרטן שד גרורתי מד"א-MB-231 בנפח של 10 מ"ל לבקבוק T75 בתרבית רקמה בשל ליבוביץ L-15 בינוניים בתוספת 10% (v / v) בסרום שור העובר ו1 פניצילין, סטרפטומיצין%.
  2. דגירה מד"א-MB-231 תאים בחממה humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 0% CO 2 בסביבה.
  3. קציר תאים לניסויים 2 ימים לאחר זריעה על ידי טיפול בתאים עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 2 דקות ולהשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין על ידי הוספת ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electroporator microfluidic המקביל פיתח נמסר מקרומולקולות עם גדלים מגוונים ומטענים חשמליים לתוך תאי חיים סרטן השד גרורתי. משלוח מולקולרי מוצלח נקבע איכותי על ידי מעקב אחר שינויים בעוצמת ניאון של electroporated תאים המקיפים באתר ואושר על ידי מדידות כמותיות באמצעות ניתוח cytometry זרימה. איור 4A מראה כי 90% מתאים שטופלו ספיגים dextran הניטרלי דה 70,000. לניתוח הסטטיסטי, סף עוצמה עבור כל fluorophore הוקם כך שהרוב (> 99%) של תאי חיים לא מעובדים נספר מתחת ל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם הפלטפורמה החדשה parallelized electroporation, השיפור של פי 10 בתפוקה ויעילות של משלוח מרובה מולקולה הושגה, בנוסף לכל היתרונות שהמערכת אחת קאמרית שפותחה בעבר מספקת. 18 יתרונות זמינים בעבר כוללים (i) לפני טיהור יעד תאים עם התפלגות אחידה גודל לשיפור כדאיות, (ii) שליטת מינון מולקולרית מדויקת ופרטנית, וכן (iii) זרם חשמלי תפעולי נמוך. Fluorescently dextrans שכותרתו נבחר כמולקולות של עניין, כי הם זמינים במגוון רחב של משקלים מולקולריים, סוגים מצומדות fluorophore, ומטענים חשמ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי תכנית רולנד Junior העמית. המחברים מבקשים להביע את תודה למדענים ואנשי צוות במכון רולנד בהרווארד: כריס סטוקס על עזרתו בפיתוח, ההתקנה שהותקן בסיוע מחשב בקרת לחץ, דיאן Schaak, Ph.D. עבור קלטה לטיפול מדגם ביולוגי, וינפילד היל לפיתוח ההתקנה החשמלית, Alavaro סאנצ'ז, Ph.D. למתן גישה לזרימת cytometer, סקוט בוויס, קני ספנסר ודון רוג'רס לעיבוד רכיבי צנרת מכאניים הנדרשים להתקנת הלחץ. אדוני microfluidic היו מפוברקים במרכז למערכות ננו (CNS) באוניברסיטת הרווארד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MDA-MB-231 קו תאי סרטןאוסף תרביות סוג אמריקאי (ATCC)HTB-26
לייבוביץ' s L-15Medium Cellgro, Mediatech, Inc.10-045-CV
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco, Life Technologies16000-044
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'P4333
תמיסת מלח פוספט חוצץ (DPBS) של DulbeccoCellgro, Mediatech, Inc.21-030
TrypsinGibco, Life Technologies25200-056
Flow Cytometer easyCyteHT Millipore0500-4008
מנקה פלזמה חמצןMicro-RIE
Dektak 6M פרופיל משטחVeeco
KMPR 1050Microchem
SYLGARD 184 סיליקון אלסטומר KITDow Corning
גז חנקן דחוסAirgasNI 300
רגולטור בלחץ גבוהMcMaster-Carr6162K22
רגולטור במורד הזרםMcMaster-Carr4000K563
סעפת שסתום 3/2way-8 במהירות גבוההFesto
שסתום סימון מוטבעIdex בריאות ומדעCV3320
5/32 אינץ' OD x 3/32 אינץ' ID צינורות פוליאוריתןPneumadynePU-156F-0
1/4 אינץ' OD X 0.17 אינץ' ID צינורות פוליאוריתןPneumadynePU-250PB-4
1/16 אינץ' צינורות PEEKFestoP1533
1/32 אינץ' צינורות PEEKIdex בריאות ומדעP1569
איגודי צינורות PEEKIdex בריאות ומדעP881
מחולל דופקHP8110A
חוט אלומיניוםבוב מרטין חברה6061 ALUM
אוסילוסקופAgilentDSO3062A
50 מ"ל צינורות צנטריפוגהVWR21008-178
צינור צנטריפוגה 15 מ"לVWR21008-216
T75 בקבוק תרבותVWR82050-862
דקסטרן, טטרמתילרודמין, 3,000 מגה-וואט, גיבקו אניוני, Life TechnologiesD3307
דקסטרן, טטרמתילרודמין, 70,000 מגה-וואט, ניטרלי Gibco, Life TechnologiesD1819
Dextran, טקסס אדום, 3,000 MW, גיבקו ניטרלי, Life TechnologiesD3329
טכניקת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
  2. Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
  3. Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ElectroporationSequential Molecular DeliveryVortex assisted ElectroporatorCell TrappingFlow CytometryElectric Pulse ApplicationMolecular UptakeBreast Cancer CellsDextran DeliveryPneumatic Flow Control

Related Articles