הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

Summary

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

Abstract

interneurons המעכב GABAergic לשחק תפקיד מרכזי במעגלים עצביים במוח. Interneurons מהווה תת קבוצה קטנה של האוכלוסייה העצבית (10-20%), אך מראה רמה גבוהה של הטרוגניות פיזיולוגית, מורפולוגיות, וneurochemical, המשקף פונקציות המגוונות שלהם. לכן, חקירה של interneurons מספקת תובנות חשובות עקרונות הארגון ותפקוד של מעגלים עצביים. זה, עם זאת, דורש גישה פיזיולוגית וneuroanatomical משולב לבחירה וזיהוי של סוגים בודדים interneuron. כל תא תיקון מהדק הקלטה מפרוסות חריפות מוח של בעלי חיים מהונדסים, המבטאים חלבוני ניאון מתחת ליזמים של סמני interneuron ספציפי, מספק שיטה יעילה למקד וelectrophysiologically לאפיין מאפיינים פנימיים והסינפטי של סוגים ספציפיים interneuron. בשילוב עם תיוג צבע תאיים, גישה זו יכולה להתארך עם post hoc מוניתוח rphological וimmunocytochemical, המאפשר זיהוי שיטתי של נוירונים שנרשמו. ניתן להתאים שיטות אלה כדי שיתאימו למגוון רחב של שאלות מדעיות לגבי מאפיינים תפקודיים של סוגים שונים של תאי עצב בקליפת המוח.

Introduction

מעגלים עצביים בהיפוקמפוס כבר זמן רב את הנושא של בדיקה אינטנסיבית, לגבי שני אנטומיה ופיזיולוגיה, בשל תפקידם החיוני בלמידה ובזיכרון, כמו גם ניווט מרחבי בשני בני אדם ומכרסמים. באותה מידה, ארגון מינרית הבולט, אבל פשוט של ההיפוקמפוס עושה אזור זה נושא מועדף של מחקרי טיפול בתכונות מבניות ותפקודיות של רשתות קליפת המוח.

מעגלים בהיפוקמפוס מורכבים מתאים מעוררים עיקריים (> 80%) ו( 10-20%) קטנים יותר, אבל מחזור מגוון מאוד של interneurons המעכב ^1-3. Interneurons לשחרר חומצת γ-aminobutyric (GABA) מסופי האקסון הפועל בקולטני GABA ionotropic המהיר (GABA RS) _וGABA-B קולטני metabotropic איטי _(GABA-B RS) ^4. מנגנונים מעכבים אלה לאזן עירור ולהסדיר את הרגישות של תאים עיקריים, ובכךעיתוי ir ודפוס של שחרור. עם זאת, GABA שוחרר מinterneurons פועל לא רק על תאים עיקריים, אלא גם על interneurons עצמם ^5,6. קולטנים מראש וpostsynaptic לתווך רגולציה משוב ואינטראקציות הדדיות מעכבות בין הסוגים השונים של interneuron. מנגנונים המעכבים אלה ברשתות interneuron הם האמינו להיות מרכזיים לדור ועיצוב דפוסי פעילות האוכלוסייה, בתנודות מסוימות בתדרים שונים ^7.

הקלטת תיקון מהדק כל התא היא שיטה מבוססת היטב לבחינת מאפיינים הפנימיים ואינטראקציות הסינפטי של נוירונים. עם זאת, בשל גיוון הרב של סוגי interneuron, חקירה של interneurons המעכב דורשת זיהוי קפדני של התאים שנרשמו. כסוגי היפוקמפוס interneuron מתאפיינים בתכונות ייחודיות מורפולוגיים וביטוי סמן neurochemical, אנטומי בשילוב ודואר immunocytochemicalxamination יכול לספק אמצעי כדי לקבוע ^6,8,9 זהות interneuron מדויקות.

בעבודה הנוכחית אנו מתארים גישה ניסויית שבו הקלטות תיקון מהדק כל תא מתאי עצב בודד או זוגות synaptically מצמידים משולבות עם תיוג תאיים, ואחריו פוסט הוק-ניתוח צורני וimmunocytochemical, המאפשרים האפיון של איטי _GABA-B קולט תיווך השפעות מעכבות בinterneurons המזוהה. כדוגמא, אנו מתמקדים בסוג אחד עיקרי של interneuron, קבוצת משנה של מה שנקרא "תאי הסל" (BC), אשר innervates דנדריטים סומה והפרוקסימלי של מטרות postsynaptic ומאופיין ב" מתחזק מהר "(FS) פריקת דפוס, האקסון צפוף המכסה את שכבת גוף תא, וביטוי של parvalbumin מחייב סידן החלבון (PV) ^10,11. interneurons אלה להציג זרמים גדולים postsynaptic מעכבים, כמו גם טרום בולטיםאפנון הסינפטי של הפלט הסינפטי שלהם, בתגובה להפעלת _GABA-B R ^12. השילוב של טכניקות המתוארות כאן יכול להיות מיושם באופן שווה גם לחקור מנגנונים פנימיים או הסינפטי במגוון רחב של סוגי תאי עצב מזוהים אחרים.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל תחזוקת הנהלים ובעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות מוסדיים, הגרמני צער בעלי החיים החוק, המפורטות בהנחיה 86/609 / EEC הנוגע להגנה על בעלי חיים, והנחיות מהרשויות המקומיות (ברלין, T-0,215 / 11 )

.1 הכנת פרוסות חריפה-היפוקמפוס

1. קח חולדה מהונדס (17 עד 24 יום ישנה), המבטא את חלבון ונוס / YFP ניאון תחת אמרגן vGAT, אשר תוויות רוב interneurons המעכב בקליפת המוח ^13. לערוף את העכברוש. במהירות לנתח את המוח (<40 שניות) לתוך _{(2/5% 2} O 95% CO) נוזל semifrozen, carbogenated מבוסס סוכרוז מלאכותי השדרתי (סוכרוז-ACSF, איור 1 א).
2. להעריך את מוח החולדה גזור לקרינת ונוס / YFP עם 505 ננומטר מנורת LED ו515 מסנן פליטה, רכובה על זוג משקפי.
3. הסר את השליש הקדמי של קליפת המוח וcerebellum; לאחר מכן להפריד את האונות, כל עם אזמל. הסר את פני השטח הגבי של קליפת המוח כדי לספק משטח שטוח כדי להדביק את המוח, כפי שתואר קודם לכן ^14.
4. לחתוך פרוסות רוחביים (300 מיקרומטר) של ההיווצרות בהיפוקמפוס בvibratome, צריכה להיות מוקפות ההמיספרות עם semifrozen, carbogenated סוכרוז-ACSF (איור 1) ^14. הסר אזורים נוספים של קליפת מוח מקורי, המוח התיכון ובגזע המוח. העבר את כל פרוסה לתא החזקה שקועה המכיל סוכרוז-ACSF, אשר carbogenated וחימם ל35 ºC.
5. השאר את הפרוסות להתאושש ב35 ºC ל30 דקות מהזמן של הפרוסה האחרונה שנכנסה לACSF חימם. לעשות את זה כדי להפעיל מחדש את תהליכי חילוף חומרים ולהקל על הודבק המכתבים מחדש תהליכים עצביים לחתוך. לאחר מכן להעביר לטמפרטורת חדר לאחסון (איור 1 ג).

2 ייצור ומילוי של מטפטף הקלטה

1. פוטפטפות תיקון ll מנימי זכוכית, כך שהתנגדות פיפטה של ​​2-4 MΩ מושגת כאשר התמלאו מסונן (מסנן מזרק, נקבובית גודל: 0.2 מיקרומטר) פתרון תאיים המכיל biocytin% 0.1 (תיוג תאיים). שמור את הפתרון תאיים מקורר בקרח כדי למנוע פירוק של מרכיביו.
2. מלא טפטפות תיקון לזיהוי זרמי postsynaptic עם תמיסה המכילה Cl נמוך רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ^- ריכוז (E _{R (Cl-)} = -61 mV, ראה רשימת פתרון).
3. עבור הקלטות לזווג לזהות תגובות קולט תיווך presynaptic, למלא טפטפות תיקון עם פתרון תאיים עם קיבולת נמוכה Ca ^{2 +} חיץ כדי למנוע הפרעה לשחרור משדר presynaptically, כמו גם פי 4 Cl גבוה יותר ^- ריכוז (E _{R (Cl-)} = -20 MV) כדי לשפר את האות לרעש של iPSCs הנצפה ⁵ המאפשר הערכה מדויקת של שו"ת תרופתיonsiveness. שים לב ששינוי Cl ^- ריכוז יכול לשנות קינטיקה IPSC ^15.

הקלטת תיקון מהדק .3 תא כולו מFS-Ins

1. Carbogenate ACSF ולהאכיל באמצעות מערכת זלוף לתא ההקלטה, באמצעות משאבת peristaltic (שגם מסירה ACSF מתא ההקלטה דרך קו יניקה, איור 2 א). הפעל את כל הציוד על ההתקנה כהכנה להקלטה.
2. העבר את הפרוסה לתא ההקלטה ולהחזיק במקום עם טבעת פלטינה מתוחה עם סיבי משי יחידים. מקם את הפרוסה כך שpyramidale שכבה (str.) של CA1 עובר אנכי דרך שדה הראייה, המאפשר גישה עם 2 טפטפות לשני str. radiatum וstr. אוריין בו זמנית (2C דמויות ו4A).
3. מניחים את החדר להתקנה ולהתחיל זלוף של carbogenated והמחומם (32-34 ºC) הקלטהCSF בקצב זרימה של 5-10 מ"ל / דקה.
4. להעריך את איכות פרוסה תחת אופטיקה IR-DIC ב40X הגדלת מטרה, ולדמיין עם מצלמת CCD שנצפו בתצוגה. תניח איכות פרוסה טובה אם מספר גדול של תאים עגולים, בניגוד בינוני פירמידה CA1 (PC CA1) ניתן לראות בstr. pyramidale בעומקים של 20-30 מיקרומטר מתחת לפני שטח חלק וקל מכתשים (איור 2 ג). פרוסות באיכות ירודה מכילות מספר גדול של תאים בניגוד מאוד, מצומקים או נפוחות, עם פני השטח פרוס אחידים.
5. לזהות interneurons FS המשוער תחת תאורת epifluorescence כמו אלה מבטאים ונוס / YFP (איור 2), עם somata הקוטבי גדול או בסמוך str. pyramidale. בחרו את התאים באופן סביר עמוק בתוך פרוסה (50-100 מיקרומטר, איור 2C) על מנת לשמור על השלמות מורפולוגיים שלהם טובים יותר.
6. הר האלקטרודה ההקלטה במחזיק פיפטה על headstage; לאחר מכן אפליקציהly בלחץ נמוך, חיובי (20-30 mbar) דרך קו הצינור. מנמיכים את פיפטה אל פני השטח של הפרוסה, קיזז מעט למרכז נוירון שנבחר.
7. קבל את תצורת הקלטה כל התא כפי שתואר לעיל ^14,16 וגם ראה איורים 2 ד ו 2E:
   1. מקד את תא: להגביר את הלחץ ל70-80 mbar ומהירות להוריד את פיפטה באמצעות הפרוסה רק כדי מעל לסומה של התא הנבחר (איור 2 ד, למעלה).
   2. מתקרב לתא: לחץ על פיפטה נגד קרום התא כדי לייצר "גומת חן" על זה (איור 2 ד, למעלה). לבצע שלב זה במהירות, על מנת למנוע תיוג biocytin של תאי שכנים.
   3. ליצור חותם גיגה אוהם: שחרר את הלחץ ובו זמנית חל פקודת 20 מתח mV לפיפטה. חותם גיגה אוהם (1-50 GΩ; איור 2 ד, תחתון ואיור 2E אמצע) typicברית מתפתחת במהירות. ברגע שחתם, להחיל את הקרום הצפוי המנוחה הפוטנציאלית (בדרך כלל בין -70 ו-60 mV) כפקודת מתח.
   4. לפרוץ את התיקון: ברגע שחתם, קרע תיקון הקרום עם דופק קצר של לחץ שלילי; ובכך להשיג את התצורה כל התא (איור 2E, למטה).
8. לפצות קיבול כל התא והתנגדות סדרה _(S R). R _של בדרך כלל 5-20 MΩ ויציב עד 120 דקות. לנטוש את התאים אם פוטנציאל הממברנה (V _M) על פריצת דרך הוא יותר מאשר depolarized -50 mV; R _S הוא תחילה גדול יותר מ30 MΩ; או שינויי _S R על ידי יותר מ 20% במהלך ההקלטה.
9. לזהות FS-ins על ידי התגובה שלהם (במצב נוכחי מהדק) למשפחה של היפר לdepolarizing פולסים נוכחי (-250 ל+250 הרשות הפלסטינית, איור 2F, למעלה). FS-ins שיחסית depolarized V _M (בדרך כלל -50 to -60 mV), (<20 אלפיות שנייה) ולהגיב ל500 הרשות הפלסטינית depolarizing הזרקה נוכחית עם רכבת של פוטנציאל פעולה (APS) בתדרים> בזמן קבוע קרום קצר 100 הרץ ¹¹ (איור 2F, תחתון), שהם במידה ניכרת שונה מאלה בCA1 מחשבים (איור 2F, באמצע).

.4 תאי גירוי חשמלי לעורר תגובות בתיווך R _GABA-B

1. להתבונן עוררו תגובות synaptically, מקם אלקטרודה תאית גירוי (פיפטה תיקון מלאה ב2 M NaCl; התנגדות: .1-0.3 MΩ) בפרוסה בגבול של str. radiatum וstr. lacunosum-moleculare. מקם את האלקטרודה 200-300 מיקרומטר לרוחב לסומה כדי למנוע גירוי חשמלי ישיר של התאים ולמזער חפצי גירוי (איור 3 א).
2. ברגע שהאלקטרודה הגירוי ממוקמת, לקבל הקלטת כל התא שלהתא ובחר להעריך את הפנוטיפ הפיזיולוגי במצב נוכחי מהדק כאמור בסעיף 3.9 (איור 3 ב).
3. עם נוירון שנרשם במתח מהדק _(M V -65 mV), לספק גירוי חשמלי של אקסונים presynaptic ב50 V (~ גירוי 500 מייקרו-אמפר יעיל) בכל 20 שניות, באמצעות ממריץ קבוע מתח מבודד. השתמשו בגירויים בודדים (100 μsec משך, איור 3 ג, למעלה) כדי לצפות iPSCs תיווך _B R GABA, וInterleave עם רכבות של גירויים מרובים (ב200 הרץ) כדי לייצר שחרור משדר גדול יותר.
4. אמבט להחיל ionotropic יריבים קולט גלוטמט (קולטן AMPA: DNQX [10 מיקרומטר]; רצפטור NMDA: d-AP5 [50 מיקרומטר]) כדי לחשוף את monosynaptic IPSC (איור 3 ג, בינוני הגבוהים) המבודדים. נוסף לבודד את IPSC בתיווך R _GABA-B עם יישום של חוסם GABA R (gabazine [10 מיקרומטר]; איור 3 ג l אמצעower).
5. לאשר את התוצאה הנוכחי (איור 3 ג תחתון, מורחבים) האיטי כלפי חוץ כמו להיות בתיווך R _GABA-B על ידי היישום הבא של CGP-55845 [5 מיקרומטר] (איור 3 ג תחתון, underlain באפור)

.5 מותאמות הקלטות של synaptically יחד FS-IN ומחשבי CA1

1. להעריך שליטת presynaptic תיווך R _GABA-B של שידור סינפטי המעכב עם הקלטות בו זמנית, שבוצעו בין זוגות ובמחשב synaptically מצמידים כפי שיתואר להלן.
2. ראשית, להקים הקלטת כל התא של interneuron presynaptic (כאמור בסעיף 3) ולאשר את הפנוטיפ FS (איור 4 א).
3. לאחר מכן תיקון CA1 מחשב השכן (20-100 מרחק מיקרומטר, איור 4 א) ולהחיל suprathreshold הקצר depolarizing פולסים נוכחי (1 משך msec, משרעת Na 1-5) לIN presynaptic (שנערך במצב נוכחי מהדק) כדי לעורר נקודתי גישה. אם שיתוף הסינפטיnnection הוא הווה, נקודתי גישה בתוצאה בiPSCs בCA1 המחשב, שנערך במתח מהדק (לפצות _S R לכ -80%).
4. במידת צורך, למלא אלקטרודה חדשה הקלטה ולהקליט ממחשבים CA1 נוספים עד שחיבור נמצא.
5. ברגע שנוצר חיבור, לעורר זוגות של נקודתי גישה בFS-IN presynaptic להעריך הן את התגובה הסינפטית האחידה והתנהגות דינמית. השתמש בפרוטוקול לזווג דופק אופייני של 2 גירויי depolarizing עם מרווח אלפיות 50 (איור 4).
6. לאסוף עקבות שליטה בתנאים בסיסיים. לאחר מכן, החל baclofen סלקטיבית _GABA-B אגוניסט R (10 מיקרומטר) לACSF המרוסס, כך שהפעיל _GABA-B Rs, ואחריו אנטגוניסט CGP-55845 (5 מיקרומטר), לחסום באופן מלא את השפעות קולט בתיווך. לאסוף ~ 50 עקבות במצב יציב של כל תנאי בסמים (איור 4 וC).
7. ברגע שההקלטה היא שלמה, לאטום את הקרום סומטיים על ידי יצירת outsidדואר יוצא תיקון: לאט לאט למשוך את פיפטה מהגוף התא בV-מהדק וככל שעולה _S R, להפחית את _M V ל-40 mV. עושה זאת כדי להקל על היווצרות של התיקון מחוץ החוצה; לאחר מכן להסיר את פיפטה מהאמבטיה.

.6 ניתוח של מאפייני אלקטרו

1. הערה: מספר רב של חבילות תוכנה שונות זמין לרכישת נתונים אלקטרו. כאן, WinWCP, משמשת תכנית Windows בחבילת Strathclyde תוכנת אלקטרופיזיולוגיה החופשית, המאפשרת הקלטה של ​​עד 16 ערוצי כניסה אנלוגיים ופלט של 10 אותות דיגיטליים.
2. מסנן נמוך לעבור את כל הנתונים ב5-10 kHz ומדגם ב20 kHz.
3. לנתח נתונים פיסיולוגיים עם חבילת ניתוח off-line.
   הערה: Stimfit, חבילת תוכנות קוד פתוח הכוללת מעטפת פייתון, משמשת במקרה זה; עם זאת חלופות אחרות יכולות לשמש בקלות במקום.
   1. לנתח p קרום הפסיביroperties של נוירונים שנרשמו, שנרכש במהדק נוכחי, מפוטנציאל מנוחה קרום.
   2. מדוד את פוטנציאל הממברנה הממוצעת נח מנקודת ההתחלה של תגובות שנרשמו מתחילת ההקלטה.
   3. חישוב התנגדות קלט, באמצעות חוק אוהם, מתגובת המתח לפולסים הקטנים ביותר hyperpolarizing הנוכחיות (≤ -50 הרשות הפלסטינית). כדי לשפר את יחס אות לרעש, עקבות מרובות ממוצעת. הערה: דוגמאות שלנו הן בדרך כלל ממוצעים של 10-50 מטאטא בודד.
4. להעריך את זמן הקרום לכאורה קבוע על ידי התאמת עקומת monoexponential לדעיכה של התגובות לפולסים הנוכחי hyperpolarizing הקטן ביותר.
5. ניתוח צורת גל פוטנציאל פעולה כדי לקבוע סף, משרעת (סף לשיא) ומשך (רוחב נמדד בחצי גובה) שהושרו על ידי רמת סף depolarizing פולסים נוכחי.
6. לנתח _GABA-B R iPSCs תיווך מהקלטות מהדק מתח. מסנן עקבות off-line ב500 הרץ (מסנן גאוס) ולהעריך את המשרעת השיא והשהיה של התגובה בתיווך _GABA-B R (בממוצעים של לפחות 10 עקבות).
7. זיהוי ההשפעה של _GABA-B Rs על התפוקה המעכבת של אח"י כשינוי במשרעת שיא של iPSCs תיווך R GABA נמדד בין השיא ונקודת התחלה שקדמה. חשב את המשרעת הממוצעת מ≥50 עקבות לתקופה השליטה והמצב היציב של כל העידנים תרופתיים.

.7 ויזואליזציה וImmunocytochemistry של FS-Ins

1. בעקבות ההקלטות, לתקן את הפרוסות על ידי טבילה בparaformaldehyde 4% עם 0.1 M חיץ פוספט O (PB, pH = 7.35) / N ב 4 ° C..
2. אם ניתן להעביר פרוסות צורך PB ולאחסן עד ~ 1 שבוע לפני העיבוד.
3. פרוסות לשטוף בנדיבות בPB הטרי ולאחר מכן ב0.025 M PB עם 0.9% NaCl (PBS, pH = 7.35).
4. כדי להפחית את הנוגדן הלא ספציפי מחייב, לחסום את פרוסות FOשעה r 1 ב RT בתמיסה המכילה 10% עזים בסרום נורמלי (NGS), 0.3% Triton-X100 (חומר ניקוי לpermeabilize ממברנות) ו0.05% ₃ NaN, מורכב בPBS.
5. תווית עבור ביטוי PV, להשתמש נוגדן חד שבטי עכבר אנטי PV בדילול מלא בתמיסה המכילה 5% NGS, 0.3% Triton-X100, 0.05% NaN _3, בPBS. דגירה נוגדנים ראשוניים ל2-3 ימים על 4 מעלות צלזיוס ^12. יש לשטוף את פרוסות ביסודיות בPBS.
6. החל נוגדנים משני אנטי עכבר ניאון (למשל AlexaFluor-546.) יחד עם streptavidin ביוטין מחייב החלבון, מצומדת לfluorochrome (למשל, AlexaFluor-647); דגירה בתמיסה המכילה 3% NGS, 0.1% Triton-X100, 0.05% NaN _3, בדילול מלא PBS ודגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
7. בנדיבות לשטוף פרוסות 2-3x עם PBS ואחרי 2-3 השטיפות בPB. הר פרוסות בשקופיות זכוכית. השתמש spacer אגר 300 מיקרומטר כדי למנוע פרוסה מהקריסה. פרוסות כיסוי להחליק עם fluoresבינוני אחוזים הרכבה וחותם עם ציפורניים לכה.

.8 הדמיה ושחזור Visualized FS-Ins

1. דמיין פרוסות באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקה, עם כתב fluorochome נרגש עם קו הלייזר המתאים (לייזר דיודה 635 ננומטר לAlexaFluor-647; הליום ניאון ננומטר 543 לAlexaFluor-546 תיוג לPV וארגון 488 או 515 ננומטר עבור ונוס / YFP).
2. קח את התמונות ברזולוצית Z-מתאימה (בדרך כלל 0.5-1 מיקרומטר צעדים, באמצעות מטרת 20X) כדי לייצר Z-ערימה של כל התא. ערימות מרובות נדרשו בדרך כלל לתמונת התא השלם, שבו ניתן תפור דיגיטלי off-line באמצעות פיג'י / תוכנת ImageJ (איור 5 א).
3. לשחזר את התא מהערימה התמונה תפורה בשיטת עקיבה האוטומטית למחצה (תוסף neurite Tracer פשוט בפיג'י / ImageJ חבילת תוכנת ^17, תרשים ג).
4. לבסוף, להעריך את PV-immunoreactivity של interneuron עם עדשה אובייקטיבית צמצם מספרי גבוה (סיליקון טבילה 60X, NA = 1.3). להפוך את תמונות של סומה, דנדריטים הפרוקסימלית והאקסון הפרוקסימלי, או לחלופין מסופי האקסון אם כישלון גופני של PV הוא חזק מדי. תאים נחשבים immunoreactive עבור PV אם חיסוני תיוג נראה ליישר עם מבני שכותרת biocytin (איור 5).

Results

תנאי איכות הפרוסה שהיא טובה במידה ניכרת, הקלטה משני מחשבי CA1 וFS-ins ניתן להשיג עם קושי מינימאלי. שורת החולדה המהונדס מבטא ונוס / YFP תחת אמרגן vGAT ¹³ לא באופן חד משמעי לזהות FS-ins, או אכן BCS. עם זאת הקלטות מתוספות בתוך ומסביב str. pyramidale, שבו הצפיפות של FS-ins היא בדרך כלל גבוהה ^1, תוצאות בהסתברות גבוהה של בחירת FS-ins (איור 2). ניתן להבחין FS-ins על ידי המאפיינים הפיסיולוגיים האופייניים שלהם שונים מאלה של שני מחשבי CA1 וRS-...

Discussion

אנו מתארים שיטה המשלבת טכניקות אלקטרו וneuroanatomical לאפיין פונקציונלי נוירונים morphologically- וneurochemically המזוהים במבחנה; בפרט הסוגים השונים של תוספות מעכבות בקליפת המוח. היבטים מרכזיים של ההליך הם: (1) מיון מוקדם של אח"י הפוטנציאלי; הקלטה תאית והדמית תא עצב (2); ולבסוף ניתוח צורני וimmunocytochemical של אח"י נרשם (3). למרות שמחקר זה התייחס PV-ins בפרט, הפרוטוקול המתואר יכול לשמש להקלטות דומות מכל interneuron או סוגים אחרים עצביים, עם שינוי מינימאלי.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
		vGAT-ונוס טרנסגניות	ראה Uematsu , et al., 2008
משקפי ונוס (515 ננומטר)	BLS בע"מ, הונגריה
כלי נתיחה	כלומר FST		להסרת מוח
Vibratome	Leica		VT1200S או ויברטום מתקדם אחר עם תנודה אנכית מינימלית
אחיזת פרוסה תאים			בהתאמה אישית במעבדה
מיקרוסקופ IR-DIC זקוף	אולימפוס, יפן	BX50WI	עם מערכת מיקרומניפולטור; כלומר Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD מצלמה	Till Photonics	VX55
505 nm מערכת LED	Cairn Research	מערכת OptiLED	או מנורת כספית או מערכת LED אחרת כלומר CooLED.
מולטי מהדק 700B	Axon Instruments		לחלופין 2x מגברי Axopatch 200B
ניתן להשתמש בתוכנת רכישה של WinWCP	ג'ון דמפסטר, אוניברסיטת		בכל תוכנת רכישה איכותית, כלומר EPHUS, pClamp, Igor וכו'
חולץ אלקטרודות	Sutter	P-97	בשימוש עם זכוכית
פיפטה בורוסיליקט	הילגנברג, גרמניה	1405020	2 מ"מ חיצוני, קוטר פנימי של 1 מ"מ, ללא נימה
משאבה פריסטלטית	Gilson	Minipuls	ניתן להשתמש במשאבות אחרות או בהזנת כוח הכבידה במקום
מדחום			בהתאמה אישית
דיגיטלי	בהתאמה אישית Supertechהונגריה
ממריץ מתח קבוע מבודד	Digitimer Ltd.	DS-2A
Biocytin	Invitrogen	B1592	הידוע גם בשם ε-Biotinoyl-L-Lysine
DL-AP5(V) מלח דיסודיום	Abcam Biochemicals	ab120271
DNQX מלח דיסודיום	Abcam Biochemicals	ab120169	לחלופין NBQX או CNQX
Gabazine (SR95531)	Abcam Biochemicals	ab120042	לחלופין bicuculline methiodide
R-Baclofen	Abcam Biochemicals	ab120325
CGP-55,845 hydrochloride	Tocris	1248
Streptavidin 647	Invitrogen	S32357
נוגדן חד שבטי נגד PV עכבר	Swant, שוויץ	235	ריכוז עבודה 1:5,000-1:10,000
נוגדן משני נגד עכברים	Invitrogen	A11030	אם משתמשים במכרסם ונוס או GFP באמצעות תעלה אדומה (כלומר 546 ננומטר).
מעבדות וקטור סרום עיזים רגילות		S-1000
שקופיות			כל כיסויי
			בדרך כלל 22 x 22 מ"מ
מרווחי			בלוק אגר, חתוכים על ויברטום ל 300 μ m
מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר	אולימפוס, יפן	Fluoview FV1000	או מערכת דומה אחרת
פיג'י (פיג'י היא רק ImageJ)http://fiji.sc/Fiji			ראה Schindelin et al., 2012