מאמר שיטה

Assay התנהגות פשוט לפונקציה של Visual בדיקה ב

DOI:

10.3791/51726

⸱

12 ביוני 2014

 , 
1Ophthalmology Department, Center for Vision Research, SUNY Eye Institute, Upstate Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus laevis ראשנים מעדיפים שחייה בצד הלבן של טנק בשחור / לבן. התנהגות זו מונחה על ידי החזון שלהם. בהתבסס על התנהגות זו, אנו מציגים assay פשוט כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידה של תפקוד הראייה בראשנים של הצפרדע, laevis Xenopus, מאפשרת הקרנה לעיוורון בבעלי חיים. תגובת optokinetic היא, התנהגות רפלקסיבית המבוסס על חזון שכבר נצפתה בכל בעלי החוליות שנבדקו. עיני ראשן הם קטנים כל כך התגובה להעיף זנב שימשה כאמצעי חלופי, שדורש טכנאי מיומן כדי להקליט את התגובה העדינה. פיתחנו assay התנהגות חלופי המבוסס על העובדה שראשנים מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק כאשר הוא ממוקם בטנק עם צדדים הן בשחור לבן. Assay שהוצג כאן מהווה חלופה זולה ופשוטה שיוצרת תגובה שנמדדת בקלות. ההתקנה מורכבת מחצובה, מצלמת האינטרנט וטנקים בדיקות מקוננות, זמינה ברוב מעבדות Xenopus. מאמר זה כולל סרט המראה את התנהגותם של ראשנים, לפני ואחרי ניתוק עצב הראייה. על מנת לבדוק את התפקוד של עין אחת, אנחנו גם כוללים ייצוגיםתוצאות sentative של ראשן שבו כל עיניים עברו axotomy רשתית בימים רצופים. מחקרים עתידיים יכולים לפתח גרסה אוטומטית של assay זה לבדיקת הראייה של ראשנים רבים בבת אחת.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

laevis Xenopus שימש כאורגניזם מודל ללמוד היווצרות עין. העיניים לפתח במהירות, הולכת וגדלה לפדיון בפחות משבוע לגנים או מסלולי בדיקה שיש להם השפעה על התפתחות ותפקוד ראייה. כדי לבדוק את התפקוד חזותי, תגובת optokinetic וoptomotor נעשתה שימוש בדג זברה וראשני Xenopus, בהתאמה 1,2. בגלל העיניים של ראשני Xenopus הן קטנות יחסית לדג זברה, assay זה מחייב שימוש בציוד מיוחד וצוות מיומן לזהות את הזנב להעיף ועיני תנועת התנהגות העדינה בXenopus. התנהגות חזקה יותר בXenopus היא ההעדפה לשחייה במכל עם רקע לבן, אשר מתואר במסמך 3. בעת ביצוע ראשן במחצית טנק שחור / חצי לבן, הראשן מראש מותמרים שוחה במהירות לצד הלבן של הטנק. אנחנו השתמשנו בעבר assay זה כדי לקבוע אם נגזר תאי pluripotentעיניים היו פונקציונליות 4. כאן אנו מדווחים גרסה מפורטת של assay זה, אשר יכול לשמש כדי לבדוק את תפקוד הראייה של ראשני Xenopus premetamorphic.

assay זה הוא פשוט יותר מאשר assay תגובת optomotor, שכן הוא רק דורש מצלמת וידאו מותקן דיגיטלית, תוכנת מצלמה דיגיטלית וציוד סטנדרטי המצוי ברוב מעבדות Xenopus. בנוסף, התגובה נרשמה לא דורשת הכשרה מיוחדת לתוצאות עולים בקנה אחד. תוצאות הנציג שלנו מראות כי אותה הקבוצה של ראשנים, שעברה axotomy כפול רשתית, לשחות באופן אקראי מסביב לטנק. כללנו גם את תוצאות assay ההתנהגות מראשן של נציג, המראה כיצד עין אחת יכולה להיבדק על תגובה חזותית. גיליון עבודה כבר כלול כך שניתן להוסיף מספרים שנרכשו במהלך assay ונותחו. גיליון עבודה זה יכול לשמש כדי לקבוע אם יש להם את הראשנים שנבדקו תגובה חזותית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בבעלי חיים

Xenopus laevis ראשנים השתמשו במחקר זה גדלו, גדלו וטופלו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי IACUC לרפואה של אוניברסיטת צפון מדינת והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה.

1. התקנה טרום התנהגות: ראשנים

  1. השג עוברי Xenopus מופרים ממקור זמין באופן מסחרי או במבחנה להפרות ביציות, כפי שתואר לעיל 6.
  2. הנח blastula לעוברי שלב צלחת עצביים ב18 ˚ C ב60 מ"מ צלחות פטרי המכילות 0.1X MMR [10 מניית רינגר הפתרון (MMR) השתנה של X מארק (10 מ"מ MgCl 2; 20 מ"מ KCl; 20 מ"מ CaCl 2; 50 HEPES מ"מ; 1 M NaCl; מותאם pH 7.5, autoclaved ומאוחסן ב RT)] עם האנטיביוטיקה גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר. שינוי 0.1X MMR בכל יום ולהסיר כל עוברים מתים.
  3. ברגע שעובר להגיע לשלב Nieuwkoop ופייבר ~ 27-30 יולי, לעבור העוברי דואר ל0.1X MMR ללא אנטיביוטיקה כדי לאפשר התפתחות חיידקי מעיים.
  4. לגדל את הראשנים עד שהם מגיעים לשלב ההאכלה (שלב 45) ולהעביר אותם ל100 מ"מ צלחות פטרי מלא ב0.1X MMR. להאכיל אותם supernatant אבקת סרפד כל יום אחר במשך שבוע, שינוי MMR 0.1X ביום שחלף.
  5. אחרי שבוע אחד בצלחת פטרי 100 מ"מ, להעביר חיות למחצית טנקי גלון מלאים במי צפרדע [אוקיינוס ​​מיידי 0.5 גר '/ ליטר ו -2 dibasic פוספט מ"מ נתרן (Na 2 HPO 4: MW 141.96) pH 6.8]. להאכיל אותם כמו בשלב 2.4, אבל לשנות את המים רק 2-3 פעמים בשבוע, כאשר המים עכורים. לשמור על בעלי החיים במחזור אור הכהה light/12 שעות 12 עם אורות ההפעלה ב -6 בבוקר.
  6. הנח את המכל חצי ליטר עם נושאי בדיקה על משטח לבן כמו underpad מעבדה ספסל, O שעה לפחות 12 / N, לפני הבדיקה.
  7. ראשני מבחן בשלבי 45-50 כמתואר בשלב 3 להלן.

. 2 התקנה טרום התנהגות: Equipmenלא

  1. מניח בצד על שטח של המעבדה עבור assay ההתנהגות. זה צריך להיות באזור עם תאורת ניאון סטנדרטית שקט, עם תנועה נמוכה.
  2. הכן את טנקי בדיקות לבעלי החיים.
    , טנקי בדיקות חצי ליטר מקונן מורכבים משני חלקים: מיכל פנימי שיחזיק מים וראשנים; ומכל חיצוני עם הגירוי ויזואלי.
    1. למכל הפנימי, לעשות סימן קטן בפינות בחוץ עם נוכל, 5 סנטימטר מהחלק התחתון; זה קו המים (איור 1 א, קו מקווקו ירוק).
    2. כמו כן, למכל הפנימי, למלא divets במכל (בפינות והמרכז) עם מתחם אינרטי, כמו אלסטומר Sylgard. הערה: הראשנים להשתהות באזורים אלה אם הם לא מלאים פנימה
    3. למכל החיצוני, לכסות את המחצית בדיוק אחד מחוץ לטנק אחד עם סרט שחור חשמלי ואת החצי השני עם 1B איור נייר הטישו הלבן.
  3. מקם את הטנקים עליחסינו פטיפון.
  4. התקנת מצלמות הרשת / חצובה, כך שהוא נמצא מעל למכלי הבדיקה. כוון את המצלמה כדי לאפשר הדמיה של אזור הבדיקה, כפי שמוצג באיור 1 ג.
  5. חבר את מצלמת האינטרנט למחשב עם תוכנת QuickTime Player המותקנת 5. הפעל את המצלמה. בQuickTime Player, תחת קובץ, בחר "חדשה סרט הקלטה." התקנת assay ההתנהגות תהיה גלויה במחשב מייד.
  6. לעטוף בבד כותנה קלה על כל ההתקנה כדי להפחית סימנים חיצוניים שיכול להשפיע על התנהגות ראשן, כמו גם, להפחית את האור מוחזר על פני השטח של המים.
  7. ודא שעוצמת ההארה באמצעי הבד בין 35-50 cd / m 2.

3. Assay ההתנהגות

  1. מלא את מיכל הבדיקה הפנימי לסימן המים 5 סנטימטר נעשה בשלב 1.2.1 עם מים צפרדע.
  2. שימוש ברשת קטנה, בעדינות להזיז את בעל החיים לתוך טנק בדיקות הפנימי.
  3. Q הפתוחuickTime תוכנה במחשב, ושימוש במכל החיצוני כמדריך, ודא שהמצלמה היא מסוגלת לדמיין ולהקליט את אזור הבדיקה.
  4. כתוב את שם החיה, תאריך ושעה על פיסת נייר ולהקליט עם המצלמה.
  5. הנח את מיכל הבדיקה למכל החיצוני עם הצד השחור של הטנק לאיור מימין 2.
  6. להתחיל להקליט את הסרט מייד לאחר הסדרת הטנק ולהגדיר טיימר למשך 2 דקות.
  7. כאשר צפצופי טיימר, להסיר את מיכל הבדיקה הפנימי, לסובב את המכל החיצוני 180 מעלות ומניחים את מיכל הבדיקה הפנימי בתוך הטנק החיצוני. הפעל את שעון העצר. הערה: בצד השחור צריך עכשיו להיות בצד השני.
  8. חזור על שלב 3.7, שמונה פעמים יותר עבור סכום כולל של עשרה ניסיונות. השתמש באיור 2 כמדריך, בודק את כל ניסוי.
  9. חזור על assay ההתנהגות בשני ימים נפרדים.

4. רשתית Axotomy

  1. הניחו לבעלי חיים בtricaine 0.02% עד שהם לא מגיביםלקמצוץ זנב עם # 3 מלקחיים.
  2. להמס agarose 1% ב0.1X MMR ולאחר מכן להוסיף לצלחת פטרי 60 מ"מ. לאחר המצונן, להפוך divot מלבני קטן בagarose ולהוסיף את הראשן לdivot עם tricaine 0.02% קטנים, כדי שבעל החיים הוא שקוע בחלקו בנוזל.
  3. פירס העור בזווית של 45 תואר מאחורי אזור הגב של העין עם מחט 25 G, בעוד מרענן החיה נגד מלקחיים בצד השני.
  4. נזהר שלא לגזור את הווריד, הנמצא בסמוך לעצב הראייה, להגיע בזהירות לתוך החור עם # 5 מלקחיים, לגזור את עצב הראייה ולהעיף החוצה את דרכו. אם יש דימום חמור בשל טעות לגזום את העורק, ואז למקם את מהירות של בעלי החיים בtricaine 2% להרדים. זהירות: 2% פתרון tricaine יכול לגרום לחוסר תחושה בבני אדם. פתרון זה צריך להיות מטופלים עם כפפות.
  5. כדי לשחזר את בעלי החיים לאחר ניתוח, למקם את בעלי החיים ב100 מ"מ צלחת פטרי עם 0.7x MMR ו50 גנטמיצין מיקרוגרם / מיליליטר עבור 20 דקות. NeXT, ראשן העברה להחלמה מיכל עם מים צפרדע. בואו O / נ שאר בעלי החיים
  6. למחרת בבוקר, לבדוק את תפקוד הראייה כפי שתואר לעיל (שלבים 3.1-3.9).

5. לנתח את התוצאות

  1. לאחר הניסויים שתסיימו, למדוד את כמות הזמן שהראשן נשאר בצד השחור של הטנק.
    1. באופן ידני להציג את קטעי הווידאו באמצעות תוכנה המציגה את השעה ומאפשרת השהיה תכופה. תסתכל על זמן תצוגת וידאו. רשום את תחילת המשפט של שתי דקות, וזה כאשר המכל הפנימי מקנן בהצלחה בתוך הטנק החיצוני והוא בריבוע בתצוגה של המצלמה.
    2. השתמש במיקום של העיניים של הראשן להגדיר באיזה צד של טנק החיות שוחות ב. הגדר חוצה את הגבול מצד אחד של הטנק האחר רק כאשר שני העיניים חצו את הקו השחור / לבן.
  2. רשום את ההתחלה ואת הסוף של כל מרווח זמן (בשניות) שהחיה מבלה בצד השחור. השהה ומחדשבסופו של הווידאו כדי להבטיח דיוק. סה"כ שניות בתוך כל ניסוי.
  3. קלט מספרים אלה לתוך גיליון ההתנהגות המצורפת. הגיליון יהיה לחשב את היחס בין הזמן שהחיה בילתה בצד הלבן על ידי הפחתת המשך הזמן על הצד השחור של הטנק מהמשפט הכולל 120 שניות ולחלק את הסך כל הזמן בשניות [(120 - שניות בסך הכל בילו על הצד השחור) / 120 שניות]. ממוצעי גיליון יחס זה על כל 10 הניסויים.
  4. השתמש במבחן t של סטודנט, לזווג, הפצת שני זנב כדי לקבוע אם הניסויים בין הימים הם משמעותיים (P ≤ 0.05).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיווחים קודמים הראו כי ראשני Xenopus premetamorphic מעדיפים לשחות בצד הלבן של טנק בשחור / לבן וקראו assay זה, assay העדפות צבע רקע 3 שינינו assay זה על מנת לבדוק את תפקוד הראייה של שני עיניים של ראשנים ב פחות משבוע. בדרך זו, ניתן לאסוף את עיניהם לבדיקה היסטולוגית.

אנחנו מראים כאן איך התגובה היא עקב רמזים חזותיים. בסרט 1, הראשנים בלוחות השמאל וימין הם אותם בעלי החיים. בצד השמאל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדווחים כאן assay מודרך חזון פשוט התנהגותיים שניתן לבצע בקלות בשבוע על ידי אנשי מעבדה מינימאלי מאומנים. בעוד מבחני אחרים דורשים ציוד מיוחד ומומחיות בהתנהגות בעלי חיים, assay זה מאפשר בדיקה מהירה כדי לקבוע תפקוד ראייה. עוד assay התנהגותיות, assay ההימנעות החזותי, פותח כדי לקבוע כיצד tectum תורם לתפיסה חזותית בXenopus 10. כוונון זה אמצעי assay במרחב וברגישות לקונטרסט בתגובה להעברה לעומת רקע יציב, ובכך, יכול למדוד התנהגות מבוססת ראיה מיוחדת יותר מ assay הפשוט ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות: EY015748, EY017964 (MEZ), וEY019517 (ASV). עבודה זו נתמכה גם על ידי המחקר למניעת העיוורון החופשי גרנט למחלקת העיניים והאריות של מרכז ניו יורק. כמו כן, אנו רוצים להודות לטכנאים שלנו בעלי החיים, מתיו Mellini, לטיפולו מצוין של בעלי החיים ולדריכה בלככב בסרטון זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1/2 ליטר Flex-Tank עם כיסויeNascoSB19271Mגודל: 5-3/8 אינץ' x 7 אינץ' x 3-3/4 אינץ'
סרט
שחור נייר
פטיפון חיסון גדולVWR50809-022גודל: קוטר 114.3 x  גובה 76.2 מ"מ (4 1/2  x  3 אינץ')
Durasorb underpadVWR82004-836גודל: 43.2 x 60.1 ס"מ (17 x 24 אינץ')
KimwipeKrackeler Scientific, Inc.1945-34155-CS
חצובהמצלמת
מצלמת אינטרנטאפלM8817LL/Aטוב לראשנים גדולים יותר אבל קטנים קשה לראות
מחשב ניידאפל / מחשבשוניםהשתמשנו ב- MacBook 13 אינץ', 2 GHz Intel Core 2 Duo המריץ MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV מצלמת וידיאו מצלמת וידאוSONYDCR-HC42מחובר באמצעות Firewire למחשב עם 6 מוליכים ו-4 מוליכים אלפא FireWire 400 
תחנת HandycamSONYDCRA-C121זה יכול לשמש לחיבור חוט אש למצלמה
תוכנת QuickTime PlayerQuicktimeגרסה 10.1
26 G מחט (אורך 5/8 אינץ')VWRBD305115
Dumont #5 מלקחייםFine Science Tools11295-10
חד פעמי
Gentamicin sulfate [50 מ"ג/מ"ל]Fisher Scientific17-528Zמאוחסן ב-RT
Sylgard 184 אלסטומר סיליקוןFisher ScientificNC9644388-Instant
OceanDoctors Foster and SmithCD-116528תמיסת מלאי = 100 גרם/ליטר מאוחסן ב-RT
נתרן פוספט די-בסיסיSigma AldrichS0876תמיסת מלאי = 0.4 M מאוחסן ב-RT
In vitro עוברים מופריםeNascoLM00490MX100 עוברים ליחידה
חשמליטישו לבן סטנדרטית iSight או

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
  2. Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
  3. Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
  5. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
  6. Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
  7. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  8. Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
  9. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
  10. Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  11. Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
  12. De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XenopusXenopus Laboratories

מאמרים קשורים