מאמר שיטה

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

DOI:

10.3791/51763

⸱

12 באוגוסט 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אסטרוציטים מסוג פרא פנוטיפי ותאי גזע עצביים שנאספו מעכברים שהונדסו עם אללים אונקוגניים מותנים ומותנים ועברו טרנספורמציה ויראלית יכולים לשמש למודל פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה ובגוף החי על ידי הזרקה אורתוטופית של תאים שעברו טרנספורמציה למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים הנוכחיים של אסטרוציטומה מוגבלים ביכולתם להגדיר את התפקידים של מוטציות אונקוגניות בסוגי תאי מוח ספציפיים במהלך פתוגנזה של מחלה ואת התועלת שלהן לפיתוח תרופות פרה-קליניות. על מנת לתכנן מערכת מודל טובה יותר ליישומים אלה, אסטרוציטים קליפת המוח ותאי גזע עצביים (NSC) מסוג פרא פנוטיפי מעכברים מותנים מהונדסים גנטית (GEM) המכילים שילובים שונים של אללים אונקוגניים פלוקסים נאספו וגודלו בתרבית. רקומבינציה גנטית הושרה במבחנה באמצעות רקומבינציה בתיווך Cre אדנו-ויראלי, וכתוצאה מכך ביטוי של אונקוגנים מוטנטיים ומחיקת גנים מדכאי גידול. ההשלכות הפנוטיפיות של מוטציות אלו הוגדרו על ידי מדידת התפשטות, טרנספורמציה ותגובה לתרופות במבחנה. מודלים אורתוטופיים, לפיהם תאים מותמרים מוזרקים באופן סטריאוטקטי למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית, פותחו כדי להגדיר את תפקידן של מוטציות אונקוגניות וסוג התא על גידול in vivo. בניגוד לרוב תאי הגליובלסטומה האנושיים המבוססים, הזרקת אסטרוציטים בקליפת המוח שמקורם ב-GEM למוחם של חברים בעלי יכולת חיסונית יצרה אסטרוציטומות, כולל תת-הסוג האגרסיבי ביותר, גליובלסטומה, שסיכמה את סימני ההיכר ההיסטופתולוגיים של אסטרוציטומה אנושית, כולל פלישה מפוזרת לפרנכימה מוחית רגילה. הדמיה ביולומינסנציה של אלוגרפים אורתוטופיים מאסטרוציטים שעברו טרנספורמציה שהונדסו לבטא לוציפראז שימשה לניטור צמיחת גידול in vivo לאורך זמן. לפיכך, מודלים של אסטרוציטומה המשתמשים באסטרוציטים ו-NSC שנקטפו מ-GEM עם אללים אונקוגניים מותנים מספקים מערכת משולבת לחקר הגנטיקה והביולוגיה של התא של פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה וב-vivo ועשויה להיות שימושית בפיתוח תרופות פרה-קליניות למחלות הרסניות אלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrocytomas הוא הגידול השכיח ביותר העיקרי המוח וגליובלסטומה (GBM), אסטרוציטומה IV כיתה, הוא תת הסוג הנפוץ ואגרסיווי ביותר עם ​​חציון הישרדות של 12-15 חודשים 1,2. פלישה של astrocytomas המפוזר, במיוחד GBM, מונעת כריתה כירורגית מלאה, מגבילה את האפקטיביות של טיפולי אדג'ובנט, ומובילה בהכרח להישנות לאחר טיפול 3. חולים בתחילה הווה או עם דה נובו GBM (העיקרי) או עם astrocytomas ציון נמוך שאופן בלתי נמנע מתקדם לGBM (המשני) 4. GBM הוא genomically הטרוגניות ומאופיין במוטציות מוציאות ושיתוף המתרחש בגנים ששולטים בשלושה מסלולי ליבת איתות: מחסום מחזור תא G 1 / S (Rb), טירוזין קינאז רצפטור (RTK), וTP53 מסלולי 5-7. GBM מורכב מארבעה תת סוגים הגנומי עם פרופילי ביטוי שונים שדומים סוגי תאים שונים במוח, המצביע על כך תת סוג GBM הוא influמושפע מתאה של 6,8,9 מוצא. מודלים אסטרוציטומה טובים יותר נדרשים כדי להגדיר את התפקיד של שילובים מסוימים של מוטציות בסוגים מסוימים של תאים בפתוגנזה אסטרוציטומה. מינוף מודלים אלה לפיתוח תרופה פרה קליני יעיל יותר סופו של דבר לעזור לשפר את תוצאות מטופל. מודלים אסטרוציטומה הנוכחיים כוללים הוקמו שורות תאים אנושיות, xenografts חולה נגזר (PDX), האסטרוציטים אדם נורמלים מהונדסים גנטי ותאי גזע עצביים (המל"ל), ועכברים מהונדסים גנטי (GEM) 10-14. פיתחנו חלופי, GEM לא בתאי מין מודל (nGEM) 15 ניצול תאים ראשוניים במוח - קליפת המוח האסטרוציטים ומועצה לביטחון לאומית - שנקטפו מן GEM מחסה שילובים שונים של אללים שעור floxed. המטרה הייתה ליצור מודלים אסטרוציטומה עם תאים מוגדרים גנטי שיכולה להיות מאופיין phenotypically הן במבחנה in vivo ובאופן פוטנציאלי מנוצלים לפיתוח תרופות פרה קליני בiעכברי mmune-מוסמך.

שורות תאים אנושיות שהוקמו הן המודל הנפוץ ביותר של הפתוגנזה אסטרוציטומה ותגובת תרופה במבחנת in vivo. הם מבחינה טכנית ישר קדימה, זמינים באופן נרחב, והגדירו קינטיקה וtumorigenicity על xenografting orthotopic בעכברי immunodeficient 10,11,16-18 . החסרונות שלהם כוללים את חוסר היכולת ליצור שורות תאים הוקמו מastrocytomas בדרגה נמוכה, הגבלת הלימוד רק לastrocytomas בדרגה גבוהה; חוסר תא מוגדר של מקור; הנוכחות של חריגות הגנומי מורכבות, לעתים קרובות עם פרופילים גנומיים הנבדלים במידה ניכרת ממדגם החולה המקורי; ורגישות לפנוטיפי ולהיסחף genotypic במהלך התרבות סידורי בסרום 11,17,19-22. ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות בודדות בשורות תאי GBM הוקמו אנושיות יכולות להיות רעול פנים על ידי המון פגמים שהם בעצם הווה, שלעתים קרובות הוא מונע elucidation של השלכות גנוטיפ פנוטיפ ישירות.

PDX נוצרים באמצעות מעבר תת עורית של תאי אסטרוציטומה מבודד מטופל בעכברי immunodeficient או דרך התרבות שלהם כspheroids שאינו חסיד שבהוגדר בינוני סרום ללא, לפני הזרקת orthotopic לתוך מוחם של עכברי immunodeficient 12,23. PDX בצורה מדויקת יותר לשמור על הנוף הגנומי של astrocytomas האנושי, אבל דומה לשורות תאים אנושיות שהוקמו, ההשפעה פנוטיפי של מוטציות סרטניות בודדות יכולה להיות רעול פנים בשל המורכבות הגנומי שלהם 19,24. כדי להגדיר את ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות ספציפיות, במיוחד בתגובה לטיפולים חדשניים, פנלים של קווים הוקמו תא אנושיים או PDX לעתים קרובות מנוצלים כדי להקים מתאמי גנוטיפ, פנוטיפ, להראות יכולת הכללה, ולמזער את הסבירות להשפעות של קו ספציפי תא. בעוד PDX במדויק לשחזר את סימני ההיכר histopathological של astrocytomas האנושי, including פלישה, xenografts orthotopic של שורות תאים אנושיות שהוקמו בדרך כלל לא 21,23,25. בנוסף, האסטרוציטים אדם נורמלים ומועצה לביטחון לאומית כבר מהונדסים גנטיים עם מוטציות סרטניות מוגדרות למודל יצירת גידולי אסטרוציטומה במבחנת in vivo 13,14,26. תאים אלה חסרים את המורכבות הגנומי של קווים הוקמו תא אנושיים וPDX ובאופן מדויק לשחזר היסטופתולוגיה אסטרוציטומה אנושית, אך דורשים xenografting במכרסמים immunodeficient in vivo. מכיוון שכל דגמי התא האנושיים דורשים מארחי מכרסמים immunodeficient למניעת דחיית xenograft בתיווך חיסונית, דגמים אלה אינם לשחזר את אינטראקציות גידולי סטרומה יליד מערכת syngeneic וחסרי מערכת חיסונית שלמה, הגבלת חקירה פרה קלינית של חיסון modulatory הממוקד סטרומה ו טיפול בעזרת 10,11.

בדיקת היתר GEM של ההשלכות פנוטיפי של שילובים קבועים מראש של muta שהעורמשא in vivo ביצירת גידולי אתר. והואיל ולGEM שאינו מותנה מוטציות בתוך כל הרקמות בפיתוח, GEM המותנה שfloxed אללים שעור המאפשרים מיקוד של מוטציות על ידי הגבלת רקומבינציה בתיווך Cre לסוגי תאים מסוימים באמצעות שימוש במקדמי הסוג ספציפי של תאי 10,11,15,18. GEM אסטרוציטומה המותנה כבר נוצל כדי להבהיר את התפקידים הפונקציונליים של מוטציות סרטניות בסוגים שונים של תאים בתוך מוח שלם 11. השירות פרה הקליני של בgliomagenesis אתר באמצעות GEM המותנה מוגבל על ידי מספר גורמים, כולל 1) חוסר לתאם במבחנה, 2) קושי ביצירת קבוצות גדולות של עכברים עם גנוטיפים מורכבים, 3) חביון ארוכה של בהתפתחות גידולים באתר , 4) וסטוכסטיים התקדמות גידול. כי באתרו יצירה גידולים חסר מודל מתאים במבחנה, בדיקות סמים במבחנה לא ניתן לבצע wמודלים ith קונבנציונליים מותנים GEM. בניגוד לסוגי סרטן אחר, מודלים GEM מותנים של astrocytomas מושרים לעתים רחוקות על ידי מוטציות סרטניות בודדות 11. כך, תוכניות רבייה מורכבות נדרשות כדי ליצור GEM המותנה עם מוטציות שעור מרובות. יתר על כן, ייזום אסטרוציטומה מתרחש עם חדירות משתנים לאחר תקופת חביון ארוכה במודלים אלה, תוך התקדמות לastrocytomas בדרגה גבוהה בדרך כלל מתרחשת בלא אחידה, צורה אקראית וסופו של דבר מביאה לגידולים עם נופים הגנומי מורכבים וקינטיקה צמיחה מהירה 27, 28. החדירות משתנים והטבע סטוכסטיים של התקדמות ממארת בדגמי GEM מותנים דורשים כי עכברים בודדים שיוקרנו על ידי הדמיה רדיוגרפית כדי לזהות את הנוכחות ומיקום של astrocytomas בדרגה גבוהה לפני גיוסם בניסויים פרה קליניים בסמים. יחדיו, מגבלות אלה לעכב את הדור ובדיקה של הקבוצות הגדולות של GEM המותנה הנדרש ליחסי ציבורבדיקות סמים eclinical.

מערכת GEM RCAS-רשות עמק טנסי, אשר מנצלת retroviral עופות וקטורים (RCAS) להדביק GEM שהונדס קולט הנגיפי (רשות עמק טנסי) על סוגי תאים עצביים ספציפיים, נוצלה בהרחבה למודל יצירת גידולי אסטרוציטומה 11. בניגוד לGEM המותנה, מערכת מודל זה מאפשרת כניסתה של מוטציות סרטניות מרובות בסוגים ספציפיים תאים ללא דרישה לתוכניות רבייה מורכבות. עם זאת, הוא מוגבל על ידי חדירות משתנים, הדרישה לפעילה חלוקת תאים להשיג אינטגרציה נגיפית, וההחדרה האקראית של transgenes לתוך הגנום המארח 29.

מודלים GEM (nGEM) ללא בתאים מין, אשר מנצלים תאים שנקטפו מGEM, הם הופכים חשובים יותר ויותר, כי הם להתגבר על רב מהמגבלות של מערכות מודל אחרות 15. התפקיד של ייזום סוג תא ומוטציות שיתוף המתרחש בפתוגנזה אסטרוציטומה קשה להרתיעמכרה באמצעות הוקמה קווים אנושיים GBM תא או PDX כי הם נגזרים מגידולים בשלב סופי שהצטברו מוטציות גנטיות נרחבות בסוגים מוגדרים של תאים במהלך התפתחות ממארת. בניגוד לכך, כל הציונים של astrocytomas יכולים להיות מודל באמצעות nGEM ידי גרימה מוגדרת מוטציות גנטיות בתוך סוגי תאי המוח מטוהרים ספציפיים 11,30. לפיכך, ההשפעה של מוטציות גנטיות ספציפיות וסוג תא בפנוטיפים תאיים ומולקולריים ניתן לקבוע במבחנת in vivo. בדומה לשורות תאי GBM הוקמו אנושיות, במבחנה בדיקות סמים ראשוניות באמצעות nGEM יכולות לשמש כדי לתעדף תרופות לבדיקות במבחנה תוך שימוש באותם התאים. יצירת גידולים in vivo אז יכול להיות שנקבעו על ידי allografting תאי nGEM orthotopically למוחן של המלטת syngeneic חיסון מוסמכת 30. מודלים של שתל orthotopic אלה ולכן מאפשרים בבדיקת vivo לא רק של ציטוטוקסיות קונבנציונלייםnd ממוקד טיפולים, אבל חיסוני-modulatory וטיפולים ממוקדי סטרומה גם כן. לבסוף, תפקידה של microenvironment על התחלה של גידול והתקדמות יכול להיות נקבע על ידי השוואת תוצאות בין nGEM ודגמי GEM קונבנציונליים משתמשת באותו מוטציות באותו סוגי התאים.

אנו ואחרים פיתחו אסטרוציטומה nGEM באמצעות תאים ראשוניים - האסטרוציטים, המועצה לביטחון לאומי, או תאי אב oligodendrocyte (OPC) - שנקטפו מן GEM 30-34. הרציונל מאחורי הפיתוח של אסטרוציטומה nGEM היה ליצור מודל כדי לקבוע את ההשלכות פנוטיפי של מוטציות סרטניות בסוגי תאים מסוימים שעלולים לשמש לבדיקות סמים פרה קליניות במבחנת in vivo בבעלי החיים חיסון מוסמך. אנו נקטפנו האסטרוציטים phenotypically WT קליפת המוח ומועצה לביטחון לאומי שמאינו Cre להביע, GEM המותנה לקיים מ94% רקע C57 / BL6> עם מסלול RB floxed - RB1 loxP / loxP, או TgGZT121 - וfloxed מסלול RTK / RAS / PI3K - NF1 loxP / loxP, קראס G12D, PTEN loxP / loxP - גנים בשילובים שונים 35-39. אנו מושרה רקומבינציה הגנטית במבחנה באמצעות וקטורי adenoviral קידוד recombinase Cre. בגלל יבולי astrocyte קליפת המוח מכילים תערובת של סוגי תאים, השתמשנו וקטורי Ad5GFAPCre או transgenes שעור דומיננטי, כגון TgGZT 121 מונעים מאמרגן GFAP האנושי, להעשיר לGFAP + האסטרוציטים בקליפת המוח בתרבויות אלה. אנחנו הגדרנו את ההשלכות פנוטיפי של G 1 / S (Rb), MAPK, ומוטציות מסלול PI3K בהאסטרוציטים בקליפת המוח ומועצה לביטחון לאומית במבחנת in vivo. האסטרוציטים MAPK וG1-מופעל / PI3K S-פגום GBM מולקולרי חיקה אדם proneural ו, על הזרקת orthotopic, גידולים שנוצרו במיקום מוגדר מראש עם קינטיקה צמיחה אחידה, שיהוי קצר, והיסטופתולוגיותסימני ההיכר של בני אל 30 GBM. ניטור אורך של צמיחת גידול in vivo מסייע בדיקות סמים פרה קליניות דרך נורמליזציה של מחזורי טיפול וניתוח כמותי של צמיחת גידולים בתגובה לטיפול 40. אנחנו נקבע קינטיקה צמיחת גידול על ידי הדמיה פליטת אור אורך של עכברים שהוזרקו עם לוציפראז להביע האסטרוציטים בקליפת המוח. לכן, האסטרוציטים בקליפת המוח ומועצה לביטחון לאומי נגזרים מGEM המותנה לספק מערכת מודל צייתנית להגדרה של השלכות תפקודיות של המוטציות הקשורים אסטרוציטומה ומערכת מודל פוטנציאל לפיתוח תרופות פרה קליני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

.1 Culturing בקליפת מוח האסטרוציטים מעכברים בילוד

  1. הכנה
    1. לקמט 2-3 רקמות משימה עדינות ומניח בתחתית של בקבוק המכיל אתנול 70%. מניחים לנתח מספריים, מלקחיים מעוקלים ו2 זוגות המלקחיים מיקרו ישר לתוך הבקבוק הזה. הרקמות משמשות כדי למנוע כיפוף המלקחיים מיקרו.
    2. הוסף 1 מ"ל של HBSS לצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ. הכן צלחת נפרדת לכל בעלי חיים ולשמור על מנות על קרח.
    3. הרדימי בעלי חיים על פי תקנות מוסדיות.
    4. חם 7 מ"ל של DMEM עם 10% בסרום שור עוברי ופניצילין, סטרפטומיצין 1% (DMEM המלא) לכל חיה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הערה: לקבלת 5 עכברים, על שלבים 1.1.1-1.1.4 ייקחו ~ 15 דקות.
  2. רקמת קציר
    1. להקריב את העכבר בילוד (יום 1-3) לinstitutiתקנות onal.
    2. הסר מספריים לנתח מאתנול, לאפשר להם לטפטף יבשים, ולעשות חתך sagittal בעור מעל הגולגולת מחוט השדרה לאף.
    3. לעשות חתך בגולגולת לאורך תפר sagittal, החל מחוט השדרה והארכת עבר נורות חוש הריח. תשמור על עצמך כדי לשמור על הטיפים המספריים ליד המשטח הפנימי של הגולגולת כדי למזער את ניזק לרקמות מוח.
    4. באמצעות מלקחיים מעוקלים, לקלף בעדינות כל חצי הכדור של הגולגולת רוחבית מן המוח.
    5. בעזרת מלקחיים מיקרו ישר, בעדינות קמצוץ משם את החלק הגבי של אונה כל קליפת המוח ולמקם אותו לתוך צלחת תרבית רקמה המכילה HBSS. תשמור על עצמך, כדי למנוע את המוח הקטן ונורת חוש הריח. אל תיקח את כל רקמה מתחת לכפיס המוח.
    6. באמצעות מיקרוסקופ לנתח ו2 זוגות מלקחיים מיקרו, בעדינות להסיר את קרומי המוח מאונה כל קליפת המוח. להחזיר את צלחת תרבית רקמה לקרח עד תחילת homogenizatio רקמהn.
    7. חזור על השלבים 1.2.1 באמצעות 1.2.6 עבור כל חיה נוספת. הערה: לקבלת 5 עכברים, על שלבים 1.2.1-1.2.7 ייקחו ~ 30 דקות.
  3. Homogenization רקמה
    1. באמצעות סכין גילוח נקי, דק קוביות ההמיספרות בקליפת המוח ולהעביר את הצלחת למכסת מנוע בתרבית רקמה.
    2. העברת הרקמה חתוכה לקוביות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי. לשטוף את הצלחת עם 1 מ"ל של HBSS הקר כקרח ולהעביר לצינור המכיל רקמות.
    3. חכה עד שהרקמה תשקע לתחתית של התחתית, ולאחר מכן להסיר בזהירות HBSS העודף באמצעות פיפטה.
    4. הוסף 2 מ"ל של טריפסין טמפרטורת חדר / EDTA. פיפטה ~ 10x עם טפטפת מ"ל 1 לנתק נוספת תאים.
    5. דגירה ההשעיה התא בC ° 37 15 - 20 דקות. לערבב בזהירות על ידי היפוך כל 5 דקות.
    6. הוסף 3 מ"ל של DMEM המלא לעכב טריפסין. פיפטה ~ 10x עם טפטפת מ"ל 1 לערבב הפתרון.
    7. צנטריפוגה ב XG 200 למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
    8. הסרsupernatant עם טפטפת מ"ל 1. אל לשאוב את המדיום בגלל גלולה עשויה להיות רופפת.
    9. Resuspend גלולה ב4 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס להשלים DMEM. מעבירים את ההשעיה התא ל75 סנטימטר לדפוק בקבוק תרבות רקמה עליון. הערה: לקבלת 5 עכברים, על שלבים 1.3.1-1.3.9 ייקחו ~ 50 דקות.
    10. כ 16 שעות לאחר קציר astrocyte, לשטוף את הבקבוק עם 4 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס HBSS, ולאחר מכן להוסיף 4 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס להשלים DMEM. לשמור על האסטרוציטים קליפת המוח על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. הערה: לשטוף את השלב חשוב להסרת של תאים שאינם חסיד ופסולת מצלחת התרבות.
    11. כאשר התרבות היא ~ 95% ומחוברות, לנער לילה בשעה 37 ° C ב 5% CO 2, להסיר את המדיה המכילה את התאים מנותקים, ולאחר מכן לשטוף את הבקבוק עם 4 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס HBSS. הוסף 4 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס להשלים DMEM ולשמור על תאים ב37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. הערה: שלב זה חשוב כדי להעשיר תרבויות להאסטרוציטים בקליפת המוח, כמו זיהום מיקרוגלים ותאי אב oligodendrocyte לנתק עם הליך זה ויוסרו מן התרבות 41.
    12. חזור על שלבים 1.3.1-1.3.11 עבור כל חיה.
  4. אינדוקציה של רקומבינציה הגנטית
    1. 24 שעות לאחר שסיים את שלב 1.3.11, להחליף את המדיום עם 2 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס להשלים DMEM. הוסף 1 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס SCM המכיל 1 μl של> 10 10 / מ"ל pfu של Ad5CMVCre או Ad5GFAPCre. דגירה של 6 שעות ב32 ° C ב 5% CO 2 .CAUTION: אדנווירוס רקומביננטי אמצעי בטיחות השימוש BSL2 בעת הטיפול.
    2. הסר את המדיה המכילה וירוס ולהוסיף 37 ° DMEM מלא C ללא וירוס להאסטרוציטים בקליפת המוח. זהירות: אמצעי בטיחות השימוש BSL2 בעת טיפול adenoviruses רקומביננטי וזורקים המכילים תקשורת הווירוס לתקנות מוסדיות. הערה: לקבלת 5 תרבויות astrocyte, על השלבים 1.4.1 - 1.4.3 ייקח ~ 15 דקות ללא הדגירה 6 שעות.
    3. להרחיב תרבויות astrocyte קליפת המוח במבחנה ובאפיון vivo. הערה: קביעת הנוכחות של מוטציות הבאות Cre-רקומבינציה ידי PCR עם פריימרים ספציפיים לגן recombined או על ידי immunoblots לאו חלבון שעבר מוטציה הספציפית או השלכות האיתות שלה. הזמן הנדרש לייצוב פנוטיפי של תרבויות astrocyte קליפת המוח לאחר Cre-רקומבינציה יהיה תלוי במוטציות מנוצלות, ויש לקבוע באופן אמפירי (איור 2).

2 בתאי גזע עצביים Culturing מעכברים בילוד

  1. הכנה
    1. לפני שתתחיל בנתיחה, להכין 4 מ"ל פתרון עיכול למוח על ידי הוספת 3.1 פפאין מ"ג ו1.3 ציסטאין מ"ג עד בינוני דיסוציאציה 4 מ"ל - 98 מ"מ Na 2 SO 4, 30 מ"מ K 2 SO 4, 5.8 מ"מ MgCl 2, 0.25 מ"מ CaCl 2 , 1 HEPES מ"מ (ממניות 1 M HEPES pH 7.4) 20 גלוקוז מ"מ, 0.001% פנול האדום, ו0.125 מ"מ NaOH. תוספת של פפאיןוציסטאין למדיום הניתוק יהפוך צהוב הפתרון.
    2. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לערבב מעת לעת על ידי היפוך.
    3. הוספת 0.1 ירידת M NaOH חכם עד פתרון עיכול חוזר לאור אדום.
    4. בשכונת תרביות רקמה, סינון סטרילי פתרון העיכול באמצעות מסנן מזרק (0.22 מיקרומטר גודל נקבובית). שמור את פתרון העיכול על קרח.
    5. הכן 50 מ"ל של תאי גזע בינוני (SCM) על ידי ערבוב 44.5 מ"ל המל"ל בסל בינוני, 5 מ"ל תוסף המל"ל, 0.5 מ"ל פניצילין, סטרפטומיצין, הפרין 50 μl 0.2%, 10 μl 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​EGF, ו10 μl 100 מ"ל מיקרוגרם / bFGF. SCM הוא יציב לשבוע 1, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס.
    6. הכן HBSS המלא (cHBSS) על ידי ערבוב 50 מ"ל של 10x HBSS, 1.25 מ"ל 1 M HEPES (pH 7.4), 15 מ"ל 1 M D-גלוקוז, 5 מ"ל 100 מ"מ CaCl 2, 5 מ"ל 100 מ"מ MgSO 4, ו -2 מ"ל 1 M NaHCO 3. תביא את הנפח הכולל 500 מ"ל עם DDH 2 O.
    7. סנן לעקר שנינות cHBSSחה מסנן 0.2 מיקרומטר הנקבובית גודל ולאחסן ב 4 ° C..
    8. לקמט 2-3 רקמות משימה עדינות ומניח בתחתית של בקבוק המכיל אתנול 70%. מניחים לנתח מספריים, מלקחיים מעוקלים, ו2 זוגות המלקחיים מיקרו ישר לתוך הבקבוק הזה. הרקמות משמשות כדי למנוע כיפוף המלקחיים מיקרו. הערה: לקבלת 5 עכברים, על שלבים 2.1.1-2.1.8 ייקחו ~ 45 דקות.
  2. רקמת קציר
    1. להקריב (1-3 ביום) עכברים בילוד פי תקנות מוסדיות.
    2. הסר מספריים לנתח מאתנול 70%, לאפשר להם לטפטף יבשים, ולעשות חתך sagittal בעור מעל הגולגולת מחוט השדרה לאף.
    3. לעשות חתך בגולגולת לאורך תפר sagittal, החל מחוט השדרה והארכת עבר נורות חוש הריח. תשמור על עצמך כדי לשמור על הטיפים המספריים ליד המשטח הפנימי של הגולגולת כדי למזער את ניזק לרקמות מוח.
    4. באמצעות מלקחיים מעוקלים, לקלף בעדינות כל חצי הכדור של הגולגולת רוחבית מןמוח.
    5. הוצא בעדינות את כל המוח והמקום בcHBSS קר כקרח.
    6. שימוש במיקרוסקופ לנתיחה, להסיר בזהירות קרומי המוח מהמוח עם כלים לנתיחה קנס.
    7. מניחים את המוח על המשטח התחתון שלה ולהסיר המוח הקטן / המוח האחורי ונורת חוש הריח / קליפת מוח קדמית עם אנכי (העטרה) חותך עם סכין מנתחים גודל 11.
    8. סובב את המוח שנותר על ידי 90 ° למקם אותו על חלק הזנב, ובכך לייצר מבט העטרה של המוח. אתר את החדרים לרוחב.
    9. לגזור סעיף דמוי קובייה המכיל את אזור subventricular (SVZ).
    10. העבר את SVZ המכיל רקמה לצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ עם cHBSS קרח טרי קר ורקמת בשר טחון עם גודל 11 אזמל.
    11. העברת הרקמה הטחון לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי. מניחים את הצינור על קרח.
    12. שטוף את צלחת פטרי עם cHBSS הקר 1-2 קרח מ"ל. מעבירים את הפתרון לשטוף לצינור המכיל רקמות.
    13. חזור על שלבים 2.2.1-2.2.12 עם neonata נוסףעכברי l במידת צורך. העבר את כל 15 מ"ל הצינורות למכסת מנוע בתרבית רקמה לשארית הפרוטוקול. הערה: לקבלת 5 עכברים, על השלבים 2.2.1 - 2.2.13 תיקח ~ 45 דקות.
  3. Homogenization רקמה
    1. מניחים את פתרון העיכול (מוכן בשלב 2.1.1) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. כמו כן, SCM 2 מ"ל החם לכל מוח באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    2. מוציא בזהירות את supernatant של הרקמה הטחון עם טפטפת מ"ל 1. אל לשאוב.
    3. הוסף פתרון עיכול 2 מ"ל 37 מעלות צלזיוס ל15 צינור מ"ל ומערבבים היטב על ידי היפוך.
    4. דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מערבבים על ידי היפוך כל 5 דקות.
    5. להוסיף עוד 2 מ"ל של 37 מעלות פתרון עיכול C לכל שלב צינור וחזור על 2.3.4.
    6. אפשר התאים להתיישב לחלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה, לאחר מכן להסיר את supernatant מהרקמה מתעכלת באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
    7. הוסף 2 מ"ל של 10 מיקרומטר E-64 מדוללים בcHBSS ומערבבים בזהירות על ידי היפוך.
    8. דגירה של 3 דקות בטמפרטורת חדר.
    9. אפשר התאים להתיישב לחלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה, לאחר מכן להסיר את supernatant מהרקמה מתעכלת.
    10. הוסף 1 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס cHBSS וhomogenize עם טיפ 1 מ"ל פיפטה (~ 20 משיכות). הימנע מהזרקת בועות אוויר במהלך הומוגניזציה רקמה.
    11. לעבור את homogenate רקמת דרך מסננת תא גודל נקבובית 40 מיקרומטר, ולאחר מכן לשטוף את המסננת עם 5 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס cHBSS.
    12. צנטריפוגה homogenate הרקמות ב125 XG למשך 5 דקות.
    13. הסר 95% מsupernatant עם טפטפת מ"ל 1 מבלי להפריע גלולה התא. גלולה גלולה בזהירות תא ב200 μl 37 מעלות צלזיוס SCM עם קצה פיפטה 200 μl.
    14. הוספת SCM C 1.8 מ"ל 37 מעלות ולהעביר את ההשעיה התא היטב של צלחת גם סטרילי 6. הערה: לקבלת 5 עכברים, על שלבים 2.3.1-2.3.14 ייקחו ~ 75 דקות.
  4. תרבית תאי גזע עצבי
    1. לחדש הבינוני לאחר 3 ימים על ידי הוספת 2 מ"ל 37 מעלות אחרתC SCM.
    2. לאחר 7 ימים, להעביר את neurospheres לצינור 15 מ"ל ולתת neurospheres להתיישב על ידי כוח הכבידה ל> 5 דקות.
    3. הסר את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל 37 מעלות צלזיוס SCM.
    4. העבר את neurospheres לבאר חדשה של צלחת 6 היטב.
    5. הוסף 2 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס SCM כל 3-4 ימים, ולשנות בינוני לחלוטין כל 7 ימים.
    6. אם neurospheres היא בקוטר> 100 מיקרומטר, לנתק בזהירות עם פתרון ניתוק תאי גזע וreplate המל"ל בצפיפות התאים הרצוי.
  5. אינדוקציה של רקומבינציה הגנטית
    1. הוסף 1 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס SCM המכיל μl 1 של> 10 10 / מ"ל pfu של Ad5CMVCre או Ad5GFAPCre ל2 מ"ל של SCM כיום בתאים. זהירות: אמצעי בטיחות השימוש BSL2 בעת טיפול אדנווירוס רקומביננטי.
    2. דגירה של 6 שעות ב32 ° C ב 5% CO 2.
    3. העבר את SCM עם neurospheres לתוך צינור 15 מ"ל ולתת תחומים להתיישב על ידי כוח הכבידה למשך 5 דקות.
    4. הסר את supernatant ראשון עם טפטפת מ"ל 1, ולאחר מכן עם טפטפת 200 μl. זהירות: אמצעי בטיחות השימוש BSL2 בעת טיפול adenoviruses רקומביננטי וזורקים המכילים תקשורת הווירוס לתקנות מוסדיות.
    5. הוסף 2 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס SCM בלי הווירוס למועצה לביטחון הלאומי, ולאחר מכן להעביר לצלחת 6 היטב. הערה: לקבלת 5 תרבויות המל"ל, על שלבים 2.5.1-2.5.5 ייקחו ~ 15 דקות ללא הדגירה 6 שעות.
    6. למחרת, חזור על שלבים 2.5.1-2.5.5, ואחריו passaging neurosphere בעת צורך. עכשיו ניתן להרחיב את התחומים ל2-3 מעברים לפני אפיון במבחנה והזרקת orthotopic במוח עכבר in vivo. הערה: קביעת הנוכחות של מוטציות הבאות Cre-רקומבינציה ידי PCR עם פריימרים ספציפיים לגן recombined או על ידי immunoblots לאו חלבון שעבר מוטציה הספציפית או השלכות האיתות שלה. הזמן הנדרש לייצוב פנוטיפי של תרבויות המל"ל לאחר Cre-רקומבינציה יהיה תלויעל המוטציות מנוצלות, ויש לקבוע באופן אמפירי (איורים 2 ו -3).

3 הזרקת orthotopic של תאי recombined לתוך המוח של עכברים Iimmunocompetent נמען

  1. הכנה של 5% תאית מתיל
    1. ממיסים 5 גרם של 15 תיל הצלולוזה CPS במים ללא יונים לנפח סופי של 50 מ"ל ב100 מ"ל בורג בקבוק כובע. מוסיף את האבקה לאט תוך ערבוב על 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע התקבצות. זה יכול לקחת עד 24 שעה של ערבוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך כל התאית מתיל להיכנס פתרון.
    2. לשקול את הבקבוק ולהקליט את המשקל.
    3. החיטוי פתרון תיל הצלולוזה 5%. ברגע שautoclaved, תיל הצלולוזה תהפוך ג'ל מוצק למחצה.
    4. לשקול את הבקבוק ולחשב את המשקל שאבד במהלך מעוקר.
    5. סביבה נקיה מחיידקים להוסיף 1 מ"ל של מים סטריליים לכל גרם של משקל שאבד.
    6. מניחים על קרח ולהוסיף 50 מ"ל של קרח קר 2x DMEM.
    7. לערבב בין לילה באמצעות stirrer מגנטי על 4 מעלות צלזיוס. השתמש בטכניקה סטרילית לחלק את פתרון תיל הצלולוזה 5% ל20 aliquots מ"ל. aliquots חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים או עד DMEM 2x יפוג. הערה: הכנה של 5% פתרון תאית מתיל בצעדים 3.1.1-3.1.7 ייקח ~ 2.5 ימים.
  2. הכנה של קליפת מוח האסטרוציטים להזרקה
    1. האסטרוציטים קציר קליפת המוח כאשר ~ ומחוברות 90%.
    2. למסוק, DMEM המלא לשאוב ולשטוף צלחות עם נפח שווה של 37 מעלות צלזיוס HBSS.
    3. הוסף מספיק טריפסין כדי לכסות את הצלחת. בעדינות להטות ולהקיש על הצלחת עד תאים מתחילים לנתק.
    4. להשבית טריפסין עם נפח שווה של 37 מעלות צלזיוס להשלים DMEM.
    5. העבר את התאים לצינור חרוטי 50 מ"ל ולשטוף את הצלחת עם אותו הנפח של 37 DMEM המלא ° C בשימוש ב3.2.4.
    6. העבר את התקשורת לשטוף לצינור המכיל תאים. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 3 דקות.
    7. לשאוב יםתאי upernatant והגלולים ב 1 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס להשלים DMEM.
    8. לספור את ההשעיה התא באמצעות hemocytometer או אחר דלפק תא מתאים כדי לקבוע מספר תאים / μl.
    9. העבר את המספר הרצוי של תאים לצינור חרוטי 15 מ"ל חדש. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 3 דקות.
    10. תאים גלולים ב800 μl של 37 מעלות צלזיוס להשלים DMEM. לקבוע את עוצמת הקול של התא גלולה (נפח כולל של השעיה תא - 800 μl). הערה: זה חיוני כדי להשיג ריכוז תא מדויק להזרקה. לפיכך, ההיקף של התא גלולה צריך להיקבע בשלב זה על מנת לחשב את הנפח של 5% מתיל צלולוזה כדי להוסיף בשלב 3.2.12.
    11. העבר את התאים לצינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל ואז צנטריפוגות ב XG 200 במשך 3 דקות.
    12. supernatant לשאוב מהתא גלולה וresuspend האסטרוציטים בקליפת המוח בנפח המתאים של 5% מתיל צלולוזה קר כקרח (רצוי נפח כולל - נפחהתא גלולה) כדי לקבל את המספר הרצוי של תאים / μl.
    13. מקום תאים על קרח עד הזרקה.
    14. מניחים מזרק זכוכית 250 μl לAntigen Dispenser חוזר לאחר מכן למקם מחט G 18 בוטה על המזרק.
    15. למשוך את הבוכנה לאט עם המחט בהשעית astrocyte קליפת המוח; יהיה בועת אוויר מעל התאים שיש להסירו, שכן בועות אוויר תהיה לדחוס ולצמצם את הנפח מוזרק למעשה לתוך המוח.
    16. החזק את קצה המחט בדיוק מעל ההשעיה astrocyte קליפת המוח ולדחוף את הבוכנה במהירות. בועת האוויר תנוע מהר יותר מאשר ההשעיה התא ובעיקר להיות מגורשת.
    17. חזור על שלב 3.2.16 עד שכל בועות האוויר יוסרו מהמחט.
    18. מלא את המזרק כ ~ 200 μl, לאחר מכן החזק את המחט ולמשוך את הבוכנה חזרה, עד שייעצר. בועות אוויר קטנות ניתן להסיר על ידי לחיצה על הקצה עד המחט ומהירות דוחפת את הבוכנה בכ -50 μl אז נסוג לאט לכושר מלא.
    19. לשמור על הקצה זקוף וחזור על שלב 3.2.18 4-5x.
    20. מחק את מחט 18 מד ולהתאים מחט 27 G על המזרק.
    21. לחץ על הכפתור על מתקן אנטיגן עד הנוזל גורש מהמחט. הערה: לקבלת קו תאי astrocyte 1, על שלבים 3.2.1-3.2.21 ייקחו ~ 60 דקות.
  3. הכנה של המועצה לביטחון לאומי להזרקה
    1. כאשר neurospheres הן> 100 מיקרומטר בקוטר, להעביר ל15 צינורות מ"ל ולתת neurospheres להתיישב על ידי כוח הכבידה ל> 5 דקות.
    2. הסר את supernatant ולנתק את neurospheres עם מגיב ניתוק עדין, כגון פתרון ניתוק תאי גזע או Accutase על פי הוראות היצרן או עם% 0.05 טריפסין-EDTA כפי שתואר 42.
    3. לעכב את ריאגנטים הניתוק לפי הוראות היצרן, בלי לחשוף את המועצה לביטחון לאומי לסרום. צנטריפוגה ב100 XG למשך 5 דקות.
    4. לשאוב supernatant, אז resuspend התאים 1 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס cHBSS ליצור השעיה תא בודדת.
    5. ספירת התאים באמצעות hemocytometer או אחר דלפק תא מתאים כדי לקבוע את מספר תאים / μl.
    6. העבר את המספר הרצוי של המועצה לביטחון לאומי לצינור חרוטי 15 מ"ל חדש. צנטריפוגה ב100 XG למשך 5 דקות.
    7. Resuspend תאים ב800 μl של 37 מעלות צלזיוס HBSS. לקבוע את עוצמת הקול של התא גלולה (נפח כולל של השעיה תא - 800 μl). הערה: זה חיוני כדי להשיג ריכוז תא מדויק להזרקה. לפיכך, ההיקף של התא גלולה צריך להיקבע בשלב זה על מנת לחשב את הנפח של 5% מתיל צלולוזה כדי להוסיף בשלב 3.3.9.
    8. להעביר את תאי צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל סטרילי ואז צנטריפוגות ב100 XG למשך 5 דקות.
    9. לשאוב supernatant ויסיים להכין את התאים להזרקת orthotopic כמו ב3.2.12-3.2.21. הערה: לקבלת קו תאי NSC 1, על השלבים 3.3.1-3.3.9 ייקחו ~ 60 דקות.
  4. הכנת העכבר להזרקה
    1. להרדים את החיה הנמען באמצעות הזרקת IP של 250 מ"ג / קילוגרם Avertin (2,2,2 Tribromoethanol) או 100 מ"ג / קילוגרם קטמין פלוס 10 מ"ג / קילוגרם xylazine, בהתאם להנחיות IACUC מוסדיות. הערה: בשימוש במסמך זה הן עכברים ב3-6 חודשים של גיל כמארחים של שתל. עכברים בגילים שונים עשויים להיות מנוצלים כדי לחקור את השפעת microenvironmental של גיל מוח התפתחותית ביצירת גידולים.
    2. לגלח את הקרקפת על אתר החתך עם קוצץ או מספריים.
    3. לעקר את האתר כירורגית עם 3 ספוגיות לסירוגין של 70% אתנול ו בבטאדין.
    4. החל משחה עיניים לעיניים כדי למנוע כל נזק כתוצאה מאובדן רפלקס מצמוץ.
    5. להעריך עומק ההרדמה על ידי נסיגת דוושת רפלקס (קמצוץ הבוהן). הערה: לקבלת 5 עכברים, על שלבים 3.4.1-3.4.5 ייקחו ~ 15 דקות.
  5. השרשה Orthotopic
    1. אבטח את בעלי החיים במסגרת stereotaxic.
    2. Makדואר חתך מעל תפר sagittal ארוך כ 0.5 סנטימטר בין האוזניים והעיניים.
    3. אתר את הצומת של תפרי העטרה וsagittal (גבחת), כמו גם את הצומת של תפרי lambdoid וsagittal (למבדה). ודא שגבחת וLambda נמצא באותו המישור אופקי.
    4. צרף את המזרק המכיל את ההשעיה התא וחוזר מנפק אנטיגן למסגרת stereotaxic על הראש. להביא את קצה מחט 27 G במגע עם גבחת. זהו המקור שישמש למניפולציה של שלוש קואורדינטות ממדיות.
    5. הרם את המחט מעט את פני השטח הגולגולת ולהעביר 2 מ"מ לרוחב ומקורי 1 מ"מ מגבחת.
    6. מנמיכים את המחט בזהירות דרך הגולגולת לגחון מ"מ יעד 4 מגבחת. הערה: אנו מנוצלים קואורדינטות stereotactic אלה, כדי לייעד הגרעינים הבזליים. קואורדינטות stereotactic שונות עשויים להיות מנוצלים כדי לחקור את ההשפעה של microenvironmental שונהאזורים במוח ביצירת גידולים.
    7. הזרק 5 μl של ההשעיה התא על ידי הפעלת מתקן אנטיגן החוזר פעם אחת. השאר את המחט במקום למשך 2 דקות כדי לאפשר ללחץ תוך גולגולתי לאזן.
    8. למשוך את המחט על פני תקופה של 30 שניות לאט. השתמש במטלית כותנה כדי להפעיל לחץ על כל דימום שעלול להתרחש.
    9. משוער קצות פצע ולסגור את החתך באמצעות דבק רקמות. לנהל 20 μl של תת עורי לידוקאין באתר החתך. הערה: לקבלת 5 עכברים, על שלבים 3.5.1-3.5.9 ייקחו ~ 50 דקות. UNC IACUC אישר את השימוש לאחר הניתוח בהרדמה מקומית בלבד. התייעצות עם IACUC המוסדי המקומי מומלצת בנוגע לדרישות לשימוש במשככי כאבים לאחר ניתוח לאחר הליך זה.
  6. טיפול לאחר ניתוח
    1. מניחים את החיות בכלוב נקי, חם להתאושש. בעלי חיים לא צריכים להיות ממוקמים ישירות לתוך כלי המיטה, כמו שאיפה מקרית עלולה להתרחש.
    2. שים לבבעלי חיים לחידוש התנהגות נורמלית כגון טיפוח, אכילה, והפרשת צואה. הערה: חידוש של התנהגות נורמלית יכול לקחת ~ 60 דקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו מערכת מודל nGEM עם האסטרוציטים בקליפת המוח ומועצה לביטחון לאומי שנקטפו מחסת GEM ילוד floxed אללים מותנים שבעור שיכול להיות מאופיין phenotypically במבחנת in vivo (איור 1). על מנת לחקור את ההשלכות של מוטציות סרטניות במיוחד בקליפת מוח האסטרוציטים במבחנה, זה קריטי לראשון להעשיר להאסטרוציטים. יבולי astrocyte קליפת המוח מכילים תערובת של מיקרוגליה, האסטרוציטים, oligodendrocytes, OPC, ותאי עצב, אלא בשיטות מכאניות וגנטיות יכולות לסייע בהעשרת astroc...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים הקריטיים ביותר כדי להבטיח קציר ותרבות של האסטרוציטים בקליפת המוח הם 1) ראויים שיחתכו את הקליפה מבלי לקחת רקמה מתחת לכפיס המוח, 2) כדי להסיר את קרומי המוח, 3) כדי לנתק באופן יסודי את התאים, ו4) להעשרה לGFAP + האסטרוציטים. למרות שאנו משמשים מכאנית (רעד) וגנטית (הגבלה של רקומבינציה הגנטית עם וקטור Ad5GFAPCre או ניצול של transgene הפיכה דומיננטי (TgGZT 121) תחת שליטת אמרגן GFAP) שיטות להעשרה לGFAP + האסטרוציטים, טכניקות אחרות כב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM הוא חוקר קליני של דיימון ראניון-ג'ננטק. עבודה זו נתמכה, בחלקה, על ידי מענקים ל-CRM מהקרן לחקר הסרטן של דיימון ראניון (CI-45-09), משרד ההגנה (W81XWH-09-2-0042) והקרן לחקר הסרטן של אוניברסיטת צפון קרוליינה (UCRF). המחברים מבקשים להודות לדניאל רוט על הסיוע בגידול עכברים. המחברים מבקשים גם להודות להאנה צ'יי, קרטר מקורמיק, דמי קאנוטס, סטפני ג'ילט וסוזנה קרום על תרבית רקמות וסיוע אימונופלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

ניתן לרכוש Cellgro,

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
את מדיום הנשר המותאם (DMEM) (1X) Invitrogen 11995065 DMEM של Dulbeccoמספקים אחרים כולל GIBCOSigma
וסרום בקר עובריRegular Cellgro35-010-CV
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
מספריים חיתוך מחודדיםפישר סיינטיפיק08-395
מלקחיים אגודל סחוס, CurvedFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Style 1 מלקחיים בסגנון תכשיטן, עדין, 4Miltex17-301
אתנול (200 הוכחה)Decon Labs2710
סכיני גילוחVWR55411-050
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) (1x), נוזלInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), פנול אדוםInvitrogen12605-010פתרונות טריפסין אחרים מתאימים גם לאסטרוציטים בקליפת המוח ולתרבות
צלחת תרבית, 60 x 15 מ"מתומאס סיינטיפיק9380H77
15 מ"ל צינורותBD Biosciences352096
50 מ"ל צינורותBD Biosciences352070
מלאי אדנו-וירוסהעברת גנים Vector Core, U. IowaAd5CMVCreStore ב-5 ומיקרו; l aliquots ב-80 °C. מסוכן. השתמש באמצעי זהירות Bsl2
נתרן גופרתי (Na2SO4) סיגמא-אולדריץ' 238597
אשלגן גופרתי (K<תת>2SO4)Sigma-Aldrich221325
מגנזיום כלוריד (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
סידן כלורי (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
מלחHEPES אשלגןסיגמא-אולדריץ'H0527
D-(+)- גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270 
פנול אדוםסיגמא-אולדריץ'P3532
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'S5881
פפאיןוורת'ינגטוןLS003127
L-ציסטאין-HClמסנן מזרק סיגמא-אולדריץ'C1276
(0.22 ומיקרו; m גודל נקבוביות)ערכת התפשטות MilliporeSLGP033NS
Neurocult, עכברStemcell Technologies5702ערכה זו מכילה את NeuroCult NSC Basal Medium ותוסף NeuroCult NSC הדרושים לתרבית NSC
0.2% תמיסת הפריןStemcell Technologies7980
EGF InvitrogenPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
מגנזיום גופרתי (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132צור מלאי של 10 מ"מ ב DMSO, יש לאחסן ב-20 מעלות; C
צלחות 6 בארותפישר סיינטיפיק07-200-83
מסננת תאים (40 ומיקרו; m גודל נקבוביות)Corning352340
תמיסת דיסוציאציה של תאי גזעStemcell Technologies5707לחלופין, השתמש בתמיסות אנזימים עדינות כגון Accutase
Methyl cellulose 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-Bלהכנת תמיסת מתיל תאית 5
% 1.7 מ"ל Snap Cap צינור מיקרוצנטריפוגהקורנינג3620
מזרק המילטון, 250 ומיקרו; l LT ללא מחטפישר סיינטיפיק14-815-92
PB600-1 מתקן אנטיגןהמילטון  83700
חד פעמי 18 גרם מחטיםפישר סיינטיפיקNC9015638
27 ga 1/2 אינץ' מחט קצה לוארפישר סיינטיפיק14-826-48
2,2,2-טריברומו-אתנול (אברטין)סיגמא-אולדריץ'T48402
בטדיןפישר סיינטיפיקNC9386574
Puralube משחה אופטלמיתפישר סיינטיפיק
NC9689910 דגם 900 מסגרת סטריאוטקסיתKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 דבק רקמות 
לידוקאין ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous מבחן התפשטות תאים עם פתרון אחד (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
ארנב פוליקלונלי חלבון חומצי סיבי אנטי גליאלי (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerלהדמיה in vivo הדמיה
D-Luciferin - K+ מלח Bioluminescent SubstratePerkinElmer122796עבור in vivo הדמיה ביולומינסנציה
ערכת הדמיה EdUInvitrogenC10340
MSCV Luciferase PGK-hygroAddgene18782

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, suppl 5 1-49 (2012).
  2. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  3. Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
  4. Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
  5. Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), Cancer Genome Atlas Research Network. 1061-1068 (2008).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  8. Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
  9. Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
  10. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  11. Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
  14. Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
  15. Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
  16. Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
  17. Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
  18. Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
  19. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  20. Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
  21. Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
  22. Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
  23. Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
  24. Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
  25. Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
  26. Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
  27. Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
  28. Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
  29. Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
  30. Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
  31. Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
  32. McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
  33. Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
  34. Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
  35. Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. van, Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
  36. Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
  37. Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
  38. Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
  39. Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
  40. Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
  41. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  42. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  43. Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
  44. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  45. Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522(2011).
  46. Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638(2009).
  47. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
  48. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  49. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  50. Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
  51. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
  52. Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
  53. Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
  54. Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
  55. Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
  56. Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cre

מאמרים קשורים