בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

תקציר

התימוס הוא איבר חיוני להתפתחות לימפוציטים T. של תאי סטרומה הרתי, תאים הרתי אפיתל (Tecs) הם קריטיים במיוחד בשלבים שונים של התפתחות תא T: מחויבות T תא, סלקציה חיובית וסלקציה שלילית. עם זאת, הפונקציה של Tecs בבלוטת התימוס נשארה הבינה באופן חלקי. במאמר, אנו מספקים שיטה לבודד תת TEC מבלוטת התימוס עכבר טרי באמצעות שילוב של הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. השיטה מאפשרת לתאי סטרומה הרתי וthymocytes להשתחרר ביעילות מתאי תאים וחיבורי מטריצת תאים תאיים וכדי ליצור השעיה תא בודד. שימוש בתאים המבודדים, cytometry זרימת פרמטרים המרובה יכול להיות מיושם על זיהוי ואפיון של Tecs ותאים דנדריטיים. בגלל Tecs הוא אוכלוסיית תאים נדירה בבלוטת התימוס, אנחנו גם לתאר דרך יעילה להעשרה ולטהר Tecs ידי כלה thymocytes, סוג התא הנפוץ ביותר בבלוטת התימוס. Folloאגף ההעשרה, זמן מיון התא יכול להיות ירידה כל כך אובדן של כדאיות תא ניתן למזער במהלך הטיהור של Tecs. תאים מטוהרים מתאימים לניתוחים במורד הזרם שונים כמו Real Time-PCR, כתם מערבי ופרופיל ביטוי גנים. הפרוטוקול יהיה לקדם את המחקר של פונקצית TEC וכמו גם את הפיתוח של במבחנה הכינון מחדש של תאי T.

מבוא

בשלב מוקדם בהתפתחות תא T, אבות multipotent מח עצם גזע hematopoietic שמקורן בתאים מגויסים לקליפה של בלוטת התימוס, עובר מחויבות לשושלת T ולהיות מבשרי תא T ^1. בקליפת המוח, השלילי כפול thymocytes מבשר תא T מסוג CD4 ו CD8 (DN) להרחיב ולהתמיין CD4 לא בוגר וthymocytes החיובי כפול CD8 (DP), ויצר מאגר גדול של אבות עם קולטני תא T משתנה מאוד ^1. רק קבוצת משנה מוגבל-MHC נבחרת של תאי DP יהפוך החיובי יחיד thymocytes CD4 או CD8 (SP), לעבור למדולה של התימוס, ולהתמיין לתאי T בוגרים מבחינה תפקודית המוסמכים, אירוע שנקרא סלקציה חיובית ^{כ2 6.} בניגוד לכך, שיבוטים של thymocytes האוטומטי-reactive עוברים סלקציה שלילית ויוסרו באמצעות אפופטוזיס, יומרו לתאי T רגולטורים לסובלנות עצמית, או מופנים לימפוציטים intraepithelial למטרות שאינן ברורים עדיין ^3,7-10.

בבלוטת התימוס, תאי סטרומה הרתי ליצור microenvironment ייחודי המספק אותות לאלה גורלות פיתוח תאים השונים T ^5,11,12. תאי סטרומה הרתי מורכבים מתאי אפיתל הרתי (Tecs) - כולל Tecs קליפת המוח (cTECs) וTecs הלשדי (mTECs), תאים דנדריטיים, מקרופאגים, פיברובלסטים, תאי אנדותל, pericytes המופק מרכס העצבי ותאי mesenchymal אחרים ^13-15. בין אלה, Tecs הם קריטיים בשלבים השונים של פיתוח תאי T ^1,2,16,17. עם זאת, חוסר דרך חזקה כדי לבודד Tecs עכב הבנה מקיפה של הפונקציות שלהם ^16. בפרט, cTECs, אשר יוצר רשת תלת ממדים המקיפה את האבות בקליפת המוח, חיוני לסלקציה חיובית ^13,18,19 מסיבות שאינן ברורים עדיין. מחקרים קודמים סיפקו רמזים לגבי ההטרוגניות והתפקיד של Tecs, בעיקר להסתמך על כלים מורפולוגיים והיסטולוגית ¹³ . לאחרונה התפקידים הייחודיים של תת TEC טופלו על ידי גישות גנטיות בעכברי מודל ^12,20. דרך חזקה ושחזור כדי לבודד Tecs היא יסוד להשגת אפיון משוחד של תת TEC, הערכה כמותית ואיכותית של פונקציות TEC, והבהרה של מנגנונים איך cTECs יתמוך בבחירה חיובית.

בשל הנדירות של Tecs בבלוטת התימוס והאינטראקציות הדוקות הם יוצרים באיבר שלם, הבידוד של Tecs היה מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על תגליות קודמות, כיום ריאגנטים זמינים, טכניקות, ואת הידע של מבנה בלוטת התימוס והרכב סטרומה. לפני כמעט שני עשורים, כמה נהלים דווחו לdisaggregate רקמות בלוטת התימוס ^21-27, שבו אנזימים שונים שמשו במהלך עיכול, כולל טריפסין, Collagenase וDispase. אפור et al. לעומת אלה אנזימים בprecedure ^28, ודיווח ספיד משופרod עם עיכול מרובה צעד של קוקטיילים אנזים ²⁹ שהפכו בשימוש נרחב ^20,30. עם זאת, שיטה זו כרוכה בזמן הכנה ארוך וצעדים מורכבים עיכול ותוצאות במשתנה מספרים סלולריים ופרופורציות של Tecs הסופי אפילו באותו הדור העכברי ^29,30. לפני מספר שנים, אנזים כיתה מחקר Liberase, מכיל מטוהר ביותר Collagenase ופרוטאז הניטרלי התחיל להיות בשימוש בניתוק רקמת התימוס ^30. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס עיכול Liberase, עם נהלי הפרדה מכאנית מותאמים, שמניב מספר גבוה של Tecs קיימא מרקמות בלוטת התימוס עכבר. .

כדי להעשיר את תאי סטרומה ניתק, מחקרים קודמים השתמשו גם מפלי צפיפות או הפרדת חרוז מגנטית ^21,29. עם זאת, שתי השיטות לגרום חמורות אבודות של אוכלוסיות מסוימות של תאי סטרומה הרתי, במיוחד האוכלוסייה של cTECs ^29. חיסול ציטוטוקסיות וטכניקות צילום פנורמי 31,32 לי נרחב שימש במשך דלדול או הפרדה של לימפוציטים בתחום החיסוני ^12,31. לאחר השוואה של טכניקות אלה, הקמנו את פרוטוקול צילום פנורמי הנוכחי להעשרה של Tecs. המצב העדין במהלך הליך ההעשרה מוביל למוות של תאים ופחות משוחד והתאוששות TEC מוגברת.

ההשעיה תא התימוס המבודדת שתוארה בסעיף 3 יכולה להיות מיושמת ישירות לזרום ניתוח cytometric לזיהוי ואפיון של תת TEC ותאים דנדריטיים. סעיף 4 מתאר דרך פשוטה ושימושית לזיהוי תת TEC באמצעות זרימת פרמטרים מרובה cytometer. ניתן למצוא בניסויים שמבקשים להשיג cTECs מטוהר או mTECs, העשרת TEC ומיון תא הליכים בסעיף 5 ו -6.

פרוטוקול

במחקר זה, למבוגרים - הנשי (6 8 שבועות) C57Bl / 6 עכברים היו בשימוש. עכברים שנרכשו מהמכון הלאומי לסרטן וקיומם תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. אוניברסיטת ועדת בעלי החיים המוסדית מינסוטה טיפול ושימוש (IACUC) אישרה את כל הניסויים בבעלי החיים.

.1 הכנת מכשירים והחוצצים

1. הכן פתרון אנזים (בינוני RPMI1640 עם 0.05% [w / v] של Liberase TH ו100 U / ml של DNase I), חיץ אלבומין העשיר (1X PBS [Ca ^{2 +} / ^{2 +} -חינם Mg] עם 0.5% בסרום שור אלבומין ו2 חומצת Ethylenediamine Tetraacetic מ"מ [EDTA]), חיץ FACS (1X PBS [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -חינם] 1% בסרום שור עוברי המכיל [FBS] ו0.02% NaN _3), FACS מיון חיץ (1X PBS [Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} -חינם] (בינוני RPMI-1640 המכיל 2% FBS), ובינוני RP10 מסופק עם 10% FBS).
2. הכן 10 צלחות צילום פנורמי. הכן פתרון ציפוי 40 מ"ל (0.01 מ"ג / מ"ל ​​Gשיבולת שועל אנטי העכברוש-IgG ב0.1 M NaHCO הצפת _3), ולהוסיף 4 מ"ל של תמיסת ציפוי לכל 100 x 15 צלחת מ"מ, מערבולת ולדגור על 4 CO ° / N. יוצקים את פתרון נוגדן ולשטוף את הצלחת באמצעות 5 מ"ל של 1x PBS עבור 2 פעמים, מערבולת במרץ בין שטיפות. אחסן את הצלחות מוכנות ב 4 ° C..

.2 קציר של רקמות קורנית

1. להרדים עכבר בתא CO _2. שים את החיה על גבה על מחצלת לנתיחה, להצמיד את הרגליים על המזרן ולהרטיב את הפרווה על ידי ריסוס עם אתנול 70%.
2. לעשות חתך קו האמצע דרך העור, החל מלמעלה פתיחת השופכה ישר עד הלסת התחתונה עם מספריים ולהאריך את החתך כלפי מטה עד הברכיים בשני הצדדים. החתך נראה כמו במהופך "Y". משוך את העור הרפוי לאחור בצדדים, ולהצמיד אותו למזרן לנתיחה.
3. לנקב את הסרעפת מxiphoid, לחתוך את הצלעות בכל צד עד כ עצם הבריח, ואז להרים את הצלעות עםמלקחיים ולהצמיד אותו למזרן לנתיחה. התימוס הוא בדיוק מתחת לצלעות, ונראה כמו שתי אונות הלבנות דקות שמעל הלב (איור 1). רקמת חיבור נתק המקיף את בלוטת התימוס, משוך בעדינות ולהסיר את זוג אונות התימוס עם מלקחיים משוננים מעוקלים. אונות התימוס מקום לצלחת 6 היטב המכילה 5 מ"ל RPMI-1640.

.3 הכנת התאים הרתי סטרומה

1. חתוך את כל רקמת שומן וחיבור המקיפה ולהעביר את אונות התימוס לבאר חדשה של צלחת 6 היטב המכילה 5 מ"ל טרי להכין פתרון אנזים. לעשות חתכים קטנים באונות התימוס עם מספריים עדינים, ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
2. בעדינות פיפטה לעכל רקמה עד התימוס וירידה של 2 - 3 פעמים באמצעות 5 פיפטה מ"ל לניתוק רקמות. לאסוף חלק supernatant בצינור 50 מ"ל מכיל 10 מ"ל חיץ אלבומין העשיר קר לנטרל אנזימים. שמור את צינור האיסוף על קרח. הוסף 2.5פתרון מ"ל אנזים לרקמות שנותרו ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
3. לבצע תסיסה מכאנית עדינה עם מזרק 3 מ"ל ומחט 18 G כדי לשבור את אגרגטים. supernatant בריכה לצינור האיסוף. הוסף פתרון 2.5 מ"ל אנזים לרקמות שנותרו ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
4. חזור על תסיסה מכאנית עדינה עם מזרק 3 מ"ל ו25 מחט G, ודגירה את הצלחת נוספת 5 - 10 דקות.
5. לאחר עיכול מלא, בריכת supernatant לתוך צינור האיסוף. צנטריפוגה צינור האיסוף ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות כדי לאסוף את התאים. לשאוב את הנוזל ולהשעות את תאי pelleted ב10 מ"ל חיץ אלבומין העשיר ולסנן את המדגם באמצעות 100 רשת מ"מ. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. ואז לבצע ניתוח תזרים cytometic (סעיף 4) או העשרת Tecs (סעיף 5).

.4 זיהוי של Tecs על ידי cytometry הזרימה

1. הכן תאים לריכוז סופי של 4 x 10 ⁶ תאים במאגר FACS 100 μl מכתים בצלחת מבחן גם מסביב לתחתית 96 ולשמור את הצלחת על קרח. הוסף 20 μl פתרון לחסום Fc (אנטי CD16-/ נוגדן CD32 ב10 מיקרוגרם / מ"ל ​​במאגר FACS) לתאי דגירה התאים ל10 דקות על קרח. ספין הצלחת ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. בטל נוזל מבארות על ידי מצליף את פני הצלחת לתוך כיור.
2. להשעות את תאי pelleted ב100 קוקטייל נוגדני μl (אנטי CD45, -EpCAM, כיתת -MHC השנייה, ו-Ly51 נוגדנים, וקטיני UEA-1 שכותרתו עם fluorochromes שונה ביצרן מומלץ או נבדקים ריכוזים אופטימליים של כל נוגדן במאגר FACS ), ודגירת התאים על קרח ל20 דקות בחושך. לפיצוי, להכתים 1 x 10 ⁶ תאים עם כל fluorochrome הבודד.
3. הוספה של חיץ FACS 100 μl היטב כל אחד ולסובב את הצלחת ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. חזור על צעד אחד לשטוףזמן, ולאחר מכן resuspend תאי חיץ FACS 100 μl. להעביר את תאי צינור FACS מסביב לתחתית 12 x 15 מ"מ מלא ב300 μl FACS חיץ. לרכוש דגימות על cytometer זרימה ולנתח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח FACS. אסטרטגית gating TEC מוצגת באיור 2.

.5 העשרה של Tecs על ידי צילום פנורמי

1. ספין למטה תאי התימוס (שהוכנו בסעיף 3) ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את הנוזל ולהשעות את תאי pelleted במאגר מיון FACS בריכוז של 2 x 10 ⁸ תאים לכל מ"ל בצינור חרוטי 15 מ"ל או 50 מ"ל. הוסף נוגדן אנטי CD90.2 (Clone 30-H12) (או אנטי CD45) בריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של השעיה תא דגירה תאים בעדינות על מיקסר מסתובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף עם 5 - 10x נפח בינוני RP10 וצנטריפוגות הצינור ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
2. לשאוב את הנוזל וresuspend תאי pelleted בבינוני RP10 בריכוז של 1 x 10 ⁷ לכל מ"ל. הוסף השעיה תא 5 מ"ל לכל צלחת מצופה צילום פנורמי (מוכנה בשלב 1.3), מערבולת ולדגור ל30 דקות ב RT. מערבולת במרץ; להעביר את supernatants לתוך צינור חרוטי. יש לשטוף את הצלחת שתי פעמים באמצעות מדיום RP10 וברכת supernatants לתוך צינור האיסוף.
3. צנטריפוגה צינור האיסוף ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לשאוב את הנוזל וresuspend תאי pelleted במדיום RP10 5 מ"ל. מוסיף את ההשעיה התא לצלחת צילום פנורמי חדשה, מערבולת ולדגור ל30 דקות ב RT. לאסוף את התאים לשטוף את הצלחת וברכה אותם לתוך צינור חרוטי. ברגע שTecs מועשרים, ספין למטה התאים ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהשעות תאי 5 FACS מ"ל מיון חיץ.

.6 טיהור Tecs על ידי מיון תאים

1. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ולהכין השעיה תא בריכוז של 4 x 10 ⁷ תאי חיץ מיון FACS. הוספת נוגדני described בסעיף 4.4 לפתרון תא דגירה תאים בעדינות על מיקסר מסתובב על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בעקבות צביעה, לשטוף ולהשעות תאים לריכוז של 10 x 10 ⁶ תאים לכל מ"ל של חיץ מיון FACS.
2. מיין תת TEC דרך נחיר 100 מיקרומטר באמצעות מיון תא הקרינה הופעלה. תא ממוין נאספים ב30% (v / v) FBS בRPMI-1640). ברגע שמיון תא נעשה, תאי צנטריפוגות ב XG 400, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהתכונן לניתוח במורד הזרם.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול זה, איבר התימוס הוסר מעכבר בוגר (סעיף 2) והשעית תא הרתי הוכן כפי שתואר בסעיף 3 ההשעיה התא שהושגה כללה thymocytes, תאי סטרומה שמקורם hematopoietic ותאי סטרומה שאינו hematopoietic. CD45 הוא הפאן סמן hematopoietic הביע בשני thymocytes ותאי סטרומה hematopoietic כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים. בניגוד לכך, Tecs אינו ממוצא hematopoietic ואינו מבטא CD45 ^15. מכתים תא וניתוח התזרים cytometric בוצעו כפי שתוארו בסעיף 4.

דיון

בפרוטוקול, שלבים קריטיים הם ההכנה של תאי התימוס סטרומה (סעיף 3) וההעשרה של Tecs (סעיף 4). מומלץ מאוד שפתרון אנזים טרי מוכן בכל פעם, והוא התייחס אל הרקמה בהקדם האפשרי. לthymi נקווה, אופטימיזציה של הנפח של פתרון אנזים נדרש בהתאם למספר של thymi. אם כל שאריות רקמה שנשארו לאחר העיבוד, והוסיף עוד פתרון אנזים והארכת זמן דגירה יכול להגדיל את תשואת תא. במהלך העשרת Tecs, השלים אוסף של supernatant וחוזר לשטוף הצלחת שתוארה בסעיף .5.3 יקטן אובדן תא.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נגד עכבר EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY *	Clone G8.8
Anti-mouse MHC II	eBioscience	XX-5321-YY *	Clone M5 / 114.15.2
Anti-mouse Ly51	eBioscience	XX-5891-YY *	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Flow cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa
Flow ממיין תאים	BD Biosciences	FACSAria
FACS tubes	BD Biosciences	352052
תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX משתנה לפי פלואורוכרום ו-YY משתנה לפי גודל הבקבוקון.