כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
התימוס הוא איבר חיוני להתפתחות לימפוציטים T. של תאי סטרומה הרתי, תאים הרתי אפיתל (Tecs) הם קריטיים במיוחד בשלבים שונים של התפתחות תא T: מחויבות T תא, סלקציה חיובית וסלקציה שלילית. עם זאת, הפונקציה של Tecs בבלוטת התימוס נשארה הבינה באופן חלקי. במאמר, אנו מספקים שיטה לבודד תת TEC מבלוטת התימוס עכבר טרי באמצעות שילוב של הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. השיטה מאפשרת לתאי סטרומה הרתי וthymocytes להשתחרר ביעילות מתאי תאים וחיבורי מטריצת תאים תאיים וכדי ליצור השעיה תא בודד. שימוש בתאים המבודדים, cytometry זרימת פרמטרים המרובה יכול להיות מיושם על זיהוי ואפיון של Tecs ותאים דנדריטיים. בגלל Tecs הוא אוכלוסיית תאים נדירה בבלוטת התימוס, אנחנו גם לתאר דרך יעילה להעשרה ולטהר Tecs ידי כלה thymocytes, סוג התא הנפוץ ביותר בבלוטת התימוס. Folloאגף ההעשרה, זמן מיון התא יכול להיות ירידה כל כך אובדן של כדאיות תא ניתן למזער במהלך הטיהור של Tecs. תאים מטוהרים מתאימים לניתוחים במורד הזרם שונים כמו Real Time-PCR, כתם מערבי ופרופיל ביטוי גנים. הפרוטוקול יהיה לקדם את המחקר של פונקצית TEC וכמו גם את הפיתוח של במבחנה הכינון מחדש של תאי T.
מבוא
בשלב מוקדם בהתפתחות תא T, אבות multipotent מח עצם גזע hematopoietic שמקורן בתאים מגויסים לקליפה של בלוטת התימוס, עובר מחויבות לשושלת T ולהיות מבשרי תא T 1. בקליפת המוח, השלילי כפול thymocytes מבשר תא T מסוג CD4 ו CD8 (DN) להרחיב ולהתמיין CD4 לא בוגר וthymocytes החיובי כפול CD8 (DP), ויצר מאגר גדול של אבות עם קולטני תא T משתנה מאוד 1. רק קבוצת משנה מוגבל-MHC נבחרת של תאי DP יהפוך החיובי יחיד thymocytes CD4 או CD8 (SP), לעבור למדולה של התימוס, ולהתמיין לתאי T בוגרים מבחינה תפקודית המוסמכים, אירוע שנקרא סלקציה חיובית כ2 6. בניגוד לכך, שיבוטים של thymocytes האוטומטי-reactive עוברים סלקציה שלילית ויו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
במחקר זה, למבוגרים - הנשי (6 8 שבועות) C57Bl / 6 עכברים היו בשימוש. עכברים שנרכשו מהמכון הלאומי לסרטן וקיומם תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים. אוניברסיטת ועדת בעלי החיים המוסדית מינסוטה טיפול ושימוש (IACUC) אישרה את כל הניסויים בבעלי החיים.
.1 הכנת מכשירים והחוצצים
- הכן פתרון אנזים (בינוני RPMI1640 עם 0.05% [w / v] של Liberase TH ו100 U / ml של DNase I), חיץ אלבומין העשיר (1X PBS [Ca 2 + / 2 + -חינם Mg] עם 0.5% בסרום שור אלבומין ו2 חומצת Ethylenediamine ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בפרוטוקול זה, איבר התימוס הוסר מעכבר בוגר (סעיף 2) והשעית תא הרתי הוכן כפי שתואר בסעיף 3 ההשעיה התא שהושגה כללה thymocytes, תאי סטרומה שמקורם hematopoietic ותאי סטרומה שאינו hematopoietic. CD45 הוא הפאן סמן hematopoietic הביע בשני thymocytes ותאי סטרומה hematopoietic כגון מקרופאגים ותאים דנדריטיים. בניגוד לכך, Tecs אינו ממוצא hematopoietic ואינו מבטא CD45 15. מכתים תא וניתוח התזרים cytometric בוצעו כפי שתוארו בסעיף 4.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול, שלבים קריטיים הם ההכנה של תאי התימוס סטרומה (סעיף 3) וההעשרה של Tecs (סעיף 4). מומלץ מאוד שפתרון אנזים טרי מוכן בכל פעם, והוא התייחס אל הרקמה בהקדם האפשרי. לthymi נקווה, אופטימיזציה של הנפח של פתרון אנזים נדרש בהתאם למספר של thymi. אם כל שאריות רקמה שנשארו לאחר העיבוד, והוסיף עוד פתרון אנזים והארכת זמן דגירה יכול להגדיל את תשואת תא. במהלך העשרת Tecs, השלים אוסף של supernatant וחוזר לשטוף הצלחת שתוארה בסעיף .5.3 יקטן אובדן תא.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט R01 AI088209 (לקה). אנו מודים גם לאוניברסיטת מינסוטה cytometry זרימת המשאבים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נגד עכבר EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY * | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY * | Clone M5 / 114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY * | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow ממיין תאים | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX משתנה לפי פלואורוכרום ו-YY משתנה לפי גודל הבקבוקון. |
מקורות
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
