In vivo ההדמיה של דאואר ספציפי עצבי שיפוץ בג elegans

סיכום

בעקבות חשיפה לגורמי לחץ סביבתיים ספציפיים, הנמטודה Caenorhabditis elegans עוברת פלסטיות פנוטיפית נרחבת כדי להיכנס לשלב נעורים 'דאואר' עמיד ללחץ. אנו מציגים שיטות לאינדוקציה מבוקרת והדמיה של נוירופלסטיות במהלך דאואר.

תקציר

מנגנוני השליטה פלסטיות פנוטיפי שנגרם עקב מתח בבעלי חיים הם לעתים קרובות מורכבים וקשים ללמוד in vivo. דוגמא קלאסית של פלסטיות שנגרם עקב מתח היא שלב dauer של ג elegans. Dauers הוא שלב זחל התפתחותית חלופי נוצר בתנאים של ריכוזים נמוכים של חיידקים שבמזון וריכוזים גבוהים של פרומון dauer. Dauers להציג פלסטיות התפתחות והתנהגות נרחבת. לדוגמא, קבוצה של ארבעה רביע פנימי labial הנוירונים (IL2Q) עוברים שיפוץ הפיך נרחב במהלך היווצרות dauer. ניצול הכניסה הידועה dauer ויסות מסלולים סביבתיים, שיטה הוקמה בעבר לייצור פרומון dauer הגולמי מתרבויות נמטודות נוזל בקנה מידה גדולה הוא הוכיח. בשיטה זו, ריכוז של 50,000 - 75,000 / נמטודות מ"ל של תרבות הנוזלית הוא מספיק כדי לייצר פרומון dauer הגולמי חזק מאוד. עצמת פרומון הגולמי היא determined ידי המבדק מנת תגובה. לבסוף, השיטות המשמשות בזמן לשגות הדמיה vivo של IL2Qs במהלך היווצרות dauer מתוארות.

מבוא

פלסטיות פנוטיפי, כוללים פלסטיות התפתחות והתנהגות, חשובה להסתגלות לתנאי סביבה שליליות ולנחשב לכוח מניע בהתפתחות ^1. ג elegans הוא אורגניזם מודל המשמש לעתים קרובות ללימודים בפיתוח ונוירוביולוגיה. בתנאים אידיאליים, ג elegans מתפתח דרך ארבעה שלבי זחל לפני כניסת שלב הרבייה הבוגרת. עם זאת, בתנאים של זמינות נמוכה מזון וצפיפות אוכלוסייה גבוהה, ג elegans יכול לעבור מתג התפתחותיים ולהיכנס לשלב dauer חיים ארוך ועמידות לעקות ^2. Dauers להציג כמה הבדלים מורפולוגיים והתנהגותיים מאינם dauers אשר צפוי לתווך התנגדות ללחץ הזה. הרמזים הסביבתיים ומסלולים גנטיים המסדירים כניסת dauer היו תיארו בהרחבה ^{3, 4, 5, 6, 7.} עם זאת, המנגנונים המולקולריים שליטה שינויי פנוטיפי בודדים המתרחשים דהיווצרות dauer uring הם הבינו פחות טוב.

הבדיקה של פנוטיפים dauer ספציפי דורשת הייצור של בעלי החיים dauer. זה יכול להיות מושלם בשלוש דרכים: 1) בחירה מתרבות מורעבת של ג elegans, 2) שימוש בהיווצרות dauer (daf-c המכונן) מוטציות, 3) אינדוקציה של היווצרות dauer באמצעות פרומון מטוהר. זה פשוט יחסית כדי לאסוף dauers מצלחת NGM סטנדרטית עם ג אוכלוסיית elegans שמיצתה את מזון אספקת החיידקים שלה. בידיים שלנו, צלחת NGM סטנדרטית במקור זרע עם 50 μl של Escherichia coli OP50, מותר לגדול במשך 3 ימים ולאחר מכן מחוסן עם 3 - הרמפרודיטים 4 מבוגרים המשיך ב25 ° C יתיש אספקת מזון בתוך שבוע אחד ולייצר כמה אלף dauers בתוך 3 ימים נוספים (בנוסף למים שאינם dauers מורעב רב). עם זאת, שיטה זו אינה מניחה את הדעת לתהליכי בחינה המתרחשים במהלך הנשירה לדאאואר. קשה לקבוע איזו מכמה אלף בעלי חיים על צלחת מורעבת טיפוסית נכנסים לdauer. יתר על כן, שימוש בצלחת מורעבת מציעה שום אפשרות לסנכרון. השימוש במוטציות daf-c מאפשרים סנכרון והדור אמין של dauers. עם זאת, אין ערובה לכך שמוטצית daf-c בפרט לא תשפיע פנוטיפים dauer ספציפי אחרים לבד או בשילוב עם מוטציות נוספות.

הנוכחות של פרומון dauer נרמזה לראשונה על ידי Cassada וראסל ומאוחר יותר לידי הביטוי בזהב וחידה. פרומון dauer מאז מאופיין כימי ^{2, 8, 9, 10.} פרומון המטוהר מורכב מתערובת מורכבת של ascarosides, אשר בצורות שונות להסדיר שני תהליכים התנהגותיים והתפתחותיים ^{9, 11.} שימוש בתמצית פרומון dauer הגולמי מאפשרים אינדוקציה אמינה מבוקרת של dauers המסונכרן ברקע wild-type.

מערכת העצבים ותאי גליה הקשורים לעבור שיפוץ במהלך זחל dauer היווצרות ^{12, 13, 14.} חלק משינויים אלה הם בלתי הפיכים, כגון שיפוץ של תאי גליה במהלך dauer ^{13, 14.} עם זאת אירועי שיפוץ אחרים הם הפיכים על שיבה לחיובית תנאים סביבתיים. לדוגמא, קבוצה של ארבעה נוירונים IL2Q לעבור שיפוץ עצבי מהיר והפיך במהלך היווצרות dauer כולל: arborization דנדריט, מתג מהדנדריטים יחידים לתאי עצב והאקסון multidendritic שיפוץ ^12. השיטות בזאת לאפשר להדמית in vivo אמינה של neuroplasticity מתח מושרה באורגניזם מודל. השיטות שהוצגו לייצור והבדיקה של פרומון dauer גולמי שתוארו קודם לכן, ונאספו מכמה מקורות ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

פרוטוקול

.1 גולמי דאואר פרומון הפקה

1. לגדול OP50 E. coli מO מושבה אחת / N על 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד בשל מרק LB 100 מ"ל ב 200 סל"ד. הערה: O / תרבות N זה יכול להתבצע מראש ולאחסן ב 4 ° C..
2. לגדול N2 ג elegans על 15-20 יוני סנטימטר צלחות פטרי עם אגר NGM (ראה מתכון בטבלה 1) שנזרע עם 50 μl של OP50 E. coli עד החיידקים קרוב למיצוי ^19.
3. הפוך 250 מ"ל 5x של תקשורת S (ראה מתכון בטבלה 1) ב1 L Erlenmeyer צלוחיות ^19. הערה: פתרון זה יכול להתבצע מראש.
4. לגדול תרבות של OP50 E. coli ב4 L של O מרק LB / N על ידי יחסינו עם 1 מ"ל של OP50 בE. coli ורועד ב37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
5. שטוף את נמטודות מצלחות (שלב 1.2) עם 1 מ"ל של תמיסת S הבסיסית (ראה מתכון בטבלה 1) ונמטודות העברת 4-5 צלחות לכל אחד מ4 1 צלוחיות L Erlenmeyer עם תקשורת S מוכנה בשלב 1.3 (4 5 צלחותלכל בקבוק) ^19.
6. צנטריפוגה OP50 משלב 1.4 ב650 XG עבור 10 דקות ולהסיר supernatant. Resuspend כל גלולה חיידקים ב10 מ"ל של תמיסה בסיסית S. העבר את הכמויות שווה של חיידקי resuspended בקבוק אחד של נמטודות.
7. מניחים את צלוחיות על שייקר מסלולית בטמפרטורת חדר (20 - C ° 25) ו100 - סל"ד 150 ל4 - 5 ימים עד הפתרון מתחיל לנקות, מה שמעיד על דלדול של מזון.
8. ברגע שהמזון יאזל, לגדול עוד תרבות O / N של OP50 E. coli ב4x 1 ליטר מרק LB. צנטריפוגה החיידקים ב650 XG עבור 10 דקות ולהוסיף גלולה מבקבוק אחד לכל אחד מצלוחיות תקשורת S עם נמטודות. החזר את צלוחיות תקשורת S לייקר מסלולית, כמו בשלב 1.7, ל3-4 ימים נוספים עד שהאוכל יגמר שוב.
9. קח 1 מ"ל aliquot ~ של פתרון מכל בקבוק ולהעריך את ריכוז נמטודות על ידי תת דגימת μl 1 מכל aliquot 1 מ"ל ולספור את המספר של נמטודות. הערה:אוכלוסיית נמטודות צריכה להיות 50,000 - 75,000 מ"ל / נמטודות. בריכוז זה רוב נמטודות הוא dauers.
10. לבטל את כל צלוחיות מזוהמות. הערה: זיהום לעתים קרובות בא לידי ביטוי כקורי פטרייה ראו במהלך צעד 1.9.
11. נמטודות צנטריפוגה ב 4,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.. זורק את כדור נמטודות ולשמר את supernatant. לחלופין, ראה דיון על שימוש בבעלי חיים אלה כדי להפוך את פרומון נמוך עוצמה.
12. סנן את supernatant דרך נייר סינון Whatman # 1. הערה: בקבוק ריק יהיה לזרז את התהליך הזה.
13. יתר על כן לסנן את supernatant באמצעות יחידות סינון ואקום סטרילי 0.45 מיקרומטר. הערה: אפשר לשמור התסנין O / N ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך ל1.14.
14. הוסף את התסנין לכוס 2 L עם בר ומערבב. מניחים במנדף על צלחת ומערבבים חימום. מביא לרתיחה תוך כדי ערבוב ולהתאדות כ 200 מ"ל. מעבירים את הפתרון לכוס 500 מ"ל. המשך הרותח עד כ 50 מ"ל הוא le. Ft הערה: יש להקפיד במהלך שלב זה כפי שהוא אפשרי לפתרון לרתוח. הצבע של 50 מ"ל הסופי הוא חום כהה. בכל עת במהלך תהליך הבישול, החום יכול להיות כבוי והתסנין מאוחסן O / N ב RT או 4 ° C..
15. בואו מגניב ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב1,000 x גרם. יוצקים את supernatant לתוך מבחנה מ"ל 100 וזורקים את הכדור.
16. מרתיחים את supernatant לקרום חום. מסירים מאש ולשבור את הקרום עם מרית. הוספת אתנול 200 הוכחה מספק כדי לכסות את הקרום. כסה את הכוס עם Parafilm ולתת לו לשבת O / N ב RT. יוצקים את אתנול לתוך מבחנה נקייה ולשים בצד. הוספת אתנול טרי כדי לכסות את הקרום. חזור על עקירות O / N 3 פעמים. בריכת התמציות.
17. השתמש במשאבת ואקום לייבוש תמציות אתנול. אם משאבת ואקום אינה זמינה, להוסיף את תמצית אתנול לכוס וחמה נקיים ל50 ° C תוך ערבוב במנדף. הערה: לאחר אתנול התאדה שאריות דביקות של ליטרצבע חום ight צריך להישאר. אם נעשה שימוש בחימום, יש להיזהר לא לשרוף את הפתרון על ידי חימום במשך זמן רב מדי.
18. לפזר שאריות ב10 מ"ל של מים סטריליים מזוקקים. סנן לעקר את הפתרון הזה עם מסנן 0.22 מיקרומטר מזרק ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב1 aliquots מ"ל. הערה: 1 מ"ל של מים המשמש להמסת השאריות לתרבות נמטודות נוזל המקורית כל 100 מ"ל. לדוגמא, אם אחד מצלוחיות התרבות הנוזלית נמחקת עקב זיהום, ואז להתאים את כמות מים המשמשת להמסת השאריות.

.2 קביעת פרומון מנה התגובה

1. הכן פרומון dauer על ידי ביצוע 6x 5 מ"ל של תקשורת NGM עם אגר נובל, ללא peptone, ותוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין סולפט ומגוון של פרומון dauer (ראה מתכון בטבלה 1) ^{4, 19.} מערבבים את המרכיבים ב13x100 מ"מ צינור תרבות זכוכית, לרתוח מבער בונזן, ולאחר מכן שופך לתוך 3 סנטימטר צלחות פטרי.
2. לשקול בבוקרצינור icrocentrifuge. הוסף 1 מ"ל של תרבות O / N של E. coli OP50 לצינור ו צנטריפוגות ב XG 17,000 ~ בצינור microcentrifuge. הסר את כל supernatant. לשקול את הצינור שוב ולקבוע את המשקל של גלולה החיידקים. Resuspend גלולה עם חיץ M9 (ראה מתכון בטבלה 1) לריכוז סופי של 4% ^(w / _v). Aliquot 10 μl של ההשעיה חיידקים על גבי במרכז כל צלחת פרומון ^4. O צלחות חנות / N ב RT.
3. פיק 10-15 הרמפרודיטים wild-type הרה להולדת N2 יום אחד לאחר הנשירה לבגרות לצלחות פרומון ^4. אחסן את הצלחות ב25 מעלות צלזיוס במשך 3 - 4 שעות.
4. בחר את כל הרמפרודיטים המבוגרים. רשום את מספר הביצים שהוטלו על כל צלחת. חותם את הצלחות עם Parafilm ולחזור ל25 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים ^17.
5. לספור את אחוז dauers (איור 2). הערה: בשתי השיטות חשוב לציין כי dauers (ולשעבר פחותיםאוהל שאינו dauers) יטפס על הקירות ועל המכסה של צלחות פטרי. לכן חשוב לבחון את כל המשטחים של המנה לנמטודות.
6. להתאים את הנתונים לעקומת מנת תגובה ולהעריך את ריכוז EC ₉₀ של פרומון (פרומון מספיק כדי לגרום 90% מבעלי החיים ליצירת dauers) כפי שמוצג באיור 3 הערה:. אנחנו בדרך כלל להשתמש במודל רגרסיה לוגיסטי כדי לאמוד את EC ₉₀ , אבל ייתכן שיש לי חבילות תוכנה סטטיסטיות שונות שיטות חלופיות שמייצרות הערכות דומות.

.3 הדמיה חיה של נוירונים IL2 דאואר

1. הכן צלחות פרומון dauer כמו בפרוטוקול 2 באמצעות ערך EC ₉₀ קבע בשלב 2.6.
2. לגרום dauers באמצעות השיטות בפרוטוקול 2 עם זן שנשא transgene כתב IL2 משולב (myIs13 _[KLP-6 P :: GFP], myIs14 _[KLP-6 P :: GFP], myIs16 [P _KLP-6 :: tdTomato] או qIs56 [P _{פיגור 2} :: GFP]) ^{12, 20, 21} הערה:. אם q Is56 משמש, הביטוי של GFP לא יהיה גלוי בIL2Qs עד כמה שעות לתוך נשירת dauer וחלק מאירועי שיפוץ הראשוניים לא יהיה גלוי. בנוסף, בעוד שאות הניאון מtransgene _{הפיגור 2} :: GFP P סופו של דבר בהיר בIL2s במהלך dauer מאשר _KLP-6 כתבי ניאון P, P _{הפיגור 2} :: transgene GFP מבטא גם חולשה בשרירי הראש ש יכול להסוות את סניפי IL2 בסדר.
3. בעקבות הטלת ביצים, להסיר את הרמפרודיטים המבוגרים, לאטום את הצלחות עם Parafilm ודגירה של 34 שעות ב25 ° C ^17. הערה: משך הזמן לנשירת dauer משתנה מעט בין יחידים. תקופה המהירה ביותר של arborization דנדריט מתחילה 4 - 5 שעות הבאות תחילת נשירת dauer (39-44ההודעה hr 25 מעלות צלזיוס) ¹² נחת ביצה.
4. היום לפני ההדמיה, מרכיבים את פתרון של 10% ^(w / _v) agarose במאגר M9 עם פרומון dauer בריכוז EC _90. Aliquot כ 100 μl של agarose לשקופית מיקרוסקופ ובמהירות, אך בעדינות, מקום שקופית אחרת על גבי כדי ליצור משטח agarose שטוח. לאחר agarose יש הקרושה, לעטוף את השקופיות בניילון נצמד וחנות בתא לחות (קופסא קצה פיפטה עם מגבות נייר רטובות).
5. לאחר תקופת הדגירה 34 שעה, לבחון צלחות פרומון לנמטודות שהפסיקה שאיבת בלוע. שקופיות נפרדות כזה שרק אחד פני השטח של שקופית אחת יש agarose על זה. פיק נמטודות אחד או יותר על 10% משטח agarose ו1 μ l של 0.1 מיקרון חרוזי פוליסטירן ^22. הערה: עם אוכלוסייה מסונכרנת היטב, רוב נמטודות על הצלחת תהיה להיכנס לנשירה מL2d לdauer. עם זאת, ייתכן שיש הבדלים בין individuals. לכן חשוב לציין תכונות נוספות (חסימת סטומה, שיפוץ בלוע) כדי להעריך את כמות הזמן שבעלי החיים היו בתוך נשירת dauer (ראה תוצאות נציג לדוגמא).
6. לקבוע את הכיוון (ימין / שמאל, גב / הגחון) של נמטודות. צלמו תמונות Z-ערימה של דנדריט IL2Q בהגדלה 100x עם עוצמת הקרינה הנמוכה ביותר האפשרית כל 15 דקות או לפי צורך לניסוי הספציפי. המשך לכידת תמונות עד נמטודות הפרידה מציפורן L2d והקיבוע הוא בלתי אפשרי או אם בעל החיים מתאושש מdauer (לוע מתחיל שאיבה). כאשר לא באופן פעיל הדמיה, במקום להחליק בתא לחות. הערה: אנו משתמשים במיקרוסקופ epifluorescent עם ניגוד התערבות במה והפרש ממונע (DIC) אופטיקה.

תוצאות

הייצור של תוצאות פרומון dauer הגולמי בנוזל צהוב (איור 1) שהוא גם חום ויציב קר. Aliquots של פרומון גולמי מאוחסנים ב -20 ° C ללא הגבלת זמן ללא הפסד ברור בפעילות. בעקבות הייצור של פרומון, המבדק מנת תגובה אחת מספיק להערכה גסה של עוצמה. עם זאת, עבור רוב הניסויים יש צורך לחזור על המבדק 2 - 3 פעמים ולקחת את ממוצע מכל ניסוי. נציג תוצאות משני bioassays פרומון ניתנות באיור 3. מתוך נתונים אלה ניתן לחשב EC ₅₀ וEC _90.

דיון

בדיקה של neuroplasticity dauer ספציפי ושינויים מורפולוגיים הקשורים dauer אחרים דורשת מבוקרת והיווצרות אמינה של dauers או באמצעות מוטציה גנטית (מוטציות כלומר, daf-ג) או על ידי חשיפה של חיות בר מהסוג לפרומון. בעוד שהשימוש במוטציה גנטית כדי לגרום dauers הוא נוח, הוא עשוי לבלבל את התוצאות. לכן הנתונים שנאספו עם מוטציות daf-c צריכים להיות מאושרים על לאחר מכן עם חיות בר מהסוג המושרה להיכנס לשלב dauer על ידי חשיפה לפרומון dauer.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
N2 C. elegans בריסטול זן	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	על פי בקשה ממעבדת
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	על פי בקשה ממעבדת
JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri צלחות Tritech	Research	60 מ"מ T3308, 35 מ"מ T3501
NGM אגר	שונים		3 גרם NaCl, 17 גרם אגר, 2.5 גרם פפטון ב-975 מ"ל H2O אוטוקלאב מקורר ל-55° C ואחריו 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול באתנול, 25 מ"ל של 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgSO4
S מדיה	S שונות		מורכבות מתמיסת בסיס S (1.46 גרם NaCl, 0.25 גרם K2HPO4, 1.5 גרם KH2PO4, 0.25 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול באתנול ו-H2O עד 250 מ"ל. לתמיסת הבסיס S יש להוסיף 2.5 מ"ל של אשלגן ציטראט pH 6.0 (2 גרם חומצת לימון מונוהידרט, 29.4 גרם תלת-אשלגן ציטראט מונוהידרט<תת>, H<תת>2O ל-100 מ"ל, אוטוקלאב), 2.5 מ"ל תמיסת קורט מתכות (1.86 גרם דיסודיום EDTA, 0.69 גרם FeSO4  ושור; 7 H2O, 0.2 גרם MnCl2• 4 H2O, 0.29 g ZnSO4  ושור; 7 H2O, 0.025 גרם CuSO4  ושור; 5 H2O, H2O עד 1 L. אוטוקלאב ומאוחסן בחושך), 0.75 מ"ל של 1 M CaCl2, ו-0.75 מ"ל של 1 M MgSO4.
צלחות פרומון דאואר לבדיקת תגובת מינון	תערובת שונות		0.085 גרם אגר אצילי, 0.5 מ"ל של 0.513 M NaCl ו- 5 & מיקרו; L של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול מומס באתנול בכל אחד מצינורות תרבית 6x 15 מ"ל. הוסף מספיק פרומון גולמי לכל שפופרת כדי ליצור טווח ריכוזים. הוסיפו H2O כדי להביא את הנפח ל-4.725 מ"ל. מרתיחים על מבער בונסן עד שהאגר נמס ואז מצננים ל 55 מעלות צלזיוס. מוסיפים 125 &מיקרו; l 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 ומיקרו; l 0.1 מ' CaCl2, 50 ומיקרו; l 0.1 M MgSO4 ו-50 ומיקרו; L של 5 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין סולפט לכל צינור.  יוצקים את תכולת כל צינור לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. תנו לאגר להתמצק בטמפרטורת החדר למשך הלילה (אם ארוך יותר, אחסנו בכלי סגור כדי למנוע ייבוש יתר).
חרוזי מיקרוספרה 0.1 מיקרון	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	מגוונת		3 גרם KH2PO4, 6 גרם Na2HPO4, 5 גרם NaCl, 1 מ"ל MgSO4, H2O עד 1 ליטר. עיקור על ידי חיטוי

שרדרשרדר תערובת